简并引物设计.docx

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简并引物设计

简并引物设计的方法

简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。

主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。

简并引物设计的常见程序如下：

1.利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。

因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。

首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。

随后利用这一序列使用BLASTp（通过蛋白查蛋白），在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。

2.对所找到的序列进行多序列比对。

将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，网址：

http:

//bioinformatics.weizmann.a...ww/make_blocks.html。

也可选工具有ClustalW。

3.确定合适的保守区域。

设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有4个氨基酸。

若比对结果保守性不是很强很可能找不到4个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。

总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。

最终目的就是至少有两个4个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。

4.利用软件设计引物。

当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer5.0进行设计。

但最好使用专门的简并引物设计的方法如：

CODEHOP（网址：

http:

//bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html），GeneFisher2（网址：

http:

//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/）。

在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法，该方法要求的保守区较短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。

该方法主要是通过将简并区放在3′末端，并在5′端设计一个一致性的区域来降低兼并度，详见

5.对引物的修饰

若得到的引物为：

5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于pcr。

我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库网址：

...ht=%C3%DC%C2%EB%D7%D3）。

注意：

该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

引物中符号说明：

A代表A

C代表C

G代表G

T代表T

M代表AorC

R代表AorG

W代表AorT

S代表CorG

Y代表CorT

K代表GorT

V代表AorCorG

H代表AorCorT

D代表AorGorT

B代表CorGorT

N代表GorAorTorC

简并引物设计过程

（1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。

首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。

随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。

（2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有ClustalW/X,也可在线分析。

所有序列的共有部分将会显示出来。

“*”表示保守，“：

”表示次保守。

（3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。

若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。

最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。

（4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer5.0支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer5.0中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C,K=G/T,S=C/G,W=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T,该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer5.0中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

（5）对引物的修饰若得到的引物为：

5-NAGSGNGCDTTANCABK-3

则简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度很高不利于PCR，可以通过次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤可以很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。

这样设计出来的简并引物对，适用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

谢谢,很好!

!

楼主您好！

请多指点！

我要用质谱得到的两个肽段设计简并引物和探针：

一、序列

肽段1：

AHGFLPLTK（9肽）

肽段2：

ATGGSAL（7肽）-本应19肽，取可信度最高的7个氨基酸

二、用PrimerPremier5设计的简并引物：

肽段1

S5’GCNCAYGGNTTYYTNCCNYTNCANATm70.4

A3’CGNGTRCCNAARANGGGNRANTGNTGC%52

肽段2

S5’GCNACNGGNGGNWSNGCNYTTm73.4

A3’CGNTGNCCNCCNWSNCGNRAGC%66.7

三、请问：

1、每个N都用次黄嘌呤代替吗？

2、直接用物种偏好密码子替代多义碱基吗？

这是该物种的偏好密码子表：

AminoAcidsCodons

123456

[color=black]AAlaAlanineGCC（61.8）GCG（38.0）GCA（16.5）GCU（10.1）

CCysCysteineUGC（6.9）UGU（1.7）

DAspAsparticacidGAC（35.7）GAU（19.6）

EGluGlutamicacidGAA（26.5）GAG（25.7）

FPhePhenylalanineUUC（27.7）UUU（4.6）

GGlyGlycineGGC（54.8）GGU（15.3）GGG（7.9）GGA（5.6）

HHisHistidineCAC（13.7）CAU（6.6）

IIleIsoleucineAUC（36.6）AUU（6.6）AUA（1.8）

KLysLysineAAG（30.2）AAA（7.1）

LLeuLeucineCUG（67.3）CUC（12.5）UUG（7.7）CUU（5.8）CUA（1.7）UUA（1.6）

MMetMethionineAUG（25.3）

NAsnAsparagineAAC（23.4）AAU（6.2）

PProProlineCCG（31.4）CCC（10.2）CCA（4.9）CCU（3.0）

QGlnGlutamineCAG（36.7）CAA（5.3）

RArgArginineCGC（36.8）CGU（10.7）CGG（10.3）CGA（4.1）AGG（2.6）AGA（1.5）

SSerSerineAGC（21.7）UCG（15.2）UCC（10.7）AGU（4.4）UCU（2.5）UCA（2.4）

TThrThreonineACC（38.6）ACG（12.0）ACU（3.5）ACA（3.3）

alalineGUG（41.9）GUC（22.4）GUU（7.9）GUA（6.2）

WTrpTryptophanUGG（12.4）

YTyrTyrosineUAC（16.3）UAU（5.9）

STOPUGA（1.9）UAA（0.6）UAG（0.3

请您帮忙看一下好吗？

发帖好几天了无人应助。

。

导师和同学也都不作这个。

。

快郁闷死了！

在线等！

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1、次黄嘌呤的优点是能和四种碱基很好地配对，并且不降低引物可结合的靶序列的数目。

不过次黄嘌呤的价格比较贵，可能要一百一个,如果钱多也无所谓啊，哈哈。

2、每一个aa对应的密码子都有一个出现的频率，根据你研究的物种的Ala对应有4种可能的密码子GCC（61.8）GCG（38.0）GCA（16.5）GCU（10.1），根据每个密码子出现的频率你可以先从高的试起，比如Ala可以设计为GC（CG），可能绘出很多条带，可以都割了区测序，关键要多是几次。

实在不行建议以亚套方式合成引物库，可以参考《PCR技术实验指南》，科学出版社和张学敏《靶向新基因的克隆策略——理论与方法》军事医学科学出版社

祝实验顺利！

！

衷心感谢qxkillgre的及时解答。

请斑竹加分！

1.次黄嘌呤全部替代不现实阿。

若选择性替代N是尽量靠近3‘端还是5’端？

2.手动设计后怎么对其进行评价和Blast？

很多软件只提供特异性引物的评估。

3.查到了该物种的基因组序列。

两个肽段的BLAST都与该物种的一假设蛋白

同源（尽管得分很低），是否可以利用这一信息进行尝试？

4.用偏好密码子替代G+C含量偏高。

5.据您的经验，哪家公司的简并引物和探针合成较好？

加您的qq或msn行吗？

邮箱也行。

设计好后想请您审核一下。

1、I一般替代在3'端，保证了3'引物和模板的结合才能保证pcr的进行。

2、看看两条引物的3'端有没有互补就行了，你只是要求出带，又不要图片多好看是发

3、不知道你是基于数目判定他们同源的，如果确实同源肯定要试一试啊

4、gc高可以尝试tdpcr啊

5、我是在生工合成的

祝实验顺利！

！

楼主，是不是在只知道蛋白质序列或者是氨基酸序列的时候，应用简并引物设计啊？

我要做的东西，只在论文上查到了蛋白质序列，却没有基因序列。

郁闷中，为什么会这样啊？

我们本来打算先用文献公布的引物，先P出来，然后测序，根据序列再看是不是需要继续p,可是看到这个帖子，就想问问，是不是可以用简并引物做，谢谢！

！

大家好,有谁能告诉我如何查找目的基因和引物?

谢谢!

人家有引物先试一试啊

很好！

！

！

我来做过兼并引物的设计，谈点粗浅的看法，并推荐个比较好的方法。

由于引物的简并性的问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率降低，PCR产物非特异性增高。

虽然减少简并引物长度可以相对减少简并性，但随之而来的问题是引物的Tm值过低，有时不得不设计第二对引物对PCR产物进行二次扩增，即巢式PCR，或者需要与TouchdownPCR相结合使用。

与通常设计的简并引物不同，利用CodeHop方法设计简并引物。

引物由两部分组成：

引物3’端为根据4-5个保守氨基酸设计的核心简并区（3’coreregion），长度只有11-15个碱基；引物5’端为非简并性夹板结构（5’consensusclampregion）。

5’端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性序列，它最大程度的预测了保守性氨基酸的编码序列，其长度取决于所需的退火温度。

这样设计的优点在于既减少了引物的简并度，又提高了引物的退火温度，保障了PCR产物的特异性。

标准简并PCR在聚合反应的晚期，随着产物的增多，引物的非特异性结合的现象增多；而CodeHopPCR的晚期，这种现象大为减少。

实验结果表明，按这种方法设计的简并引物非特异性扩增减少，是一种快捷方便的简并引物设计方案。

其与标准的简并PCR比较见图。

简并引物设计原则

从蛋白到核酸，请注意：

1）尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区，如蛋氨酸和色氨酸仅有一个密码子。

2）充分注意物种对密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。

3）引物不要终止于简并碱基，对大多数氨基酸残基来说，意味着引物的3末端不要位于密码子的第三位。

4）在简并度低的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。

以上几点遵循的总的原则为：

尽量降低引物的简并度，尤其在3末端或近3末端

[Lasteditedbyyucheng9255on2010-2-19at22:

02]

相关回复：

补充一点个人经验，保守区要选择完全保守的，实在不行5个氨基酸也可以的，但是不得少于5个，也不要多于8个。

简并度有时影响因素不太大，不要拘泥于此。

引物要一次多设计几对，提高命中率。

:

）

3.1牙鲆MHCⅡ类基因的快速扩增和结构特征

分离和克隆基因是研究基因结构、功能与表达的基础，以往一般都采用建立和筛选cDNA和DNA文库的方法来分离克隆目的基因，但是这种方法繁琐且工作量大（王建华，2005）。

克隆数据库中检索不到的物种的同源基因cDNA序列，以RT-PCR为基础的RACE技术是一种快速而简捷的方法。

它是选取与目的物种亲缘关系相近的物种的同源基因的氨基酸和对应核苷酸的保守区片断，在此范围

内设计基因特异性引物。

成功克隆相异物种同源基因全长cDNA序列，PCR引物的准确设计是最关键之处。

物种中蛋白和核苷酸序列进化上的保守区往往是其行使功能的区域，而不同物种的同源基因的功能会有很大的相似性，因而在核苷酸同源保守区设计PCR引物具有可靠的理论基础；而不同物种的同源基因在长期分子进化过程中经过自然选择的作用，其核苷酸序列有可能发生突变，因而设计兼并引物是保证快速克隆目的基因的可行的也是简捷的策略。

简并引物设计需要的两个必要条件，一是考虑所选靶扩增区的进化保守性和简并PCR的扩增特异性，选择同源性高且简并性低的氨基酸区域，如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子，最好不选择具有4和6个密码子的氨基酸的肽段。

二是根据生物使用密码子的偏爱性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引物的简并度。

三是引物的3’端不应存在简并，因为单碱基错配会阻碍延伸。

对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。

除Met或Trp外，末端密码子的最后一个碱基可以省略（史兆兴等，2005）。

十、简并引物的设计：

概念：

简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。

有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平设计引物。

众所周知，大多数氨基酸（二十种常见结构氨基酸中的十八种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，就遇到部分碱基的不确定性。

这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的，甚至植物线粒体与无脊椎动物线粒体以及无脊椎动物线粒体的遗传密码都不尽相同。

Premier可以针对各种不同的遗传密码规律设定不同的DNA和氨基酸的相互转换，这取决于被分析序列的出处。

这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。

Primier软件给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（CiliateMacronuclear），无脊椎动物线粒体（InvertebrateMitochondrion），支原体（Mycoplasma），植物线粒体（PlantMitochondrion），原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion），一般标准（Standard），脊椎动物线粒体（VertebrateMitochondrion），和酵母线粒体（YeastMitochondrion）。

概念：

简并引物是根据某些特定的目的而选用的一组混合物，指在寡核甘酸的某一位置（一个简并位）上有多个碱基存在于不同的寡核甘酸分子中，如一组简并引物中有N1，N2，N3三个简并位，在N1上有三个碱基简并，N2二个，N3四个，则此简并引物中共有3*2*4=24种寡核甘酸分子。

简并引物常用的几个方面：

（1）从已知蛋白到相关核酸分子的研究；

（2）用一组引物扩增一类分子。

在上述两个主要应用中，需要注意的几个主要问题：

从蛋白到核酸，应注意：

1）尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。

如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子。

2）充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。

3）引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。

4）在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。

5）以上几点，遵循的总的原则为：

尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。

用一对简并引物扩增一类DNA分子时，同样遵循上述总的原则，即尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。

在此种应用中，应先利用工具软件（多序列对准比较软件）或其它工具找到这些分子的保守区，然后根据共有序列，应用上面所述的一些原则来设计所需要的引物。

简并引物设计原则：

1． 选择高度保守的序列作为引物。

如果可能的话，选择在基因家族内和不同种属间都保守的序列。

2． 选择兼并度最小的序列

a. 含有色氨酸和甲硫氨酸的肽段为首选，因为其密码子是唯一的

b. 尽可能不用含有亮氨酸、精氨酸、丝氨酸的肽段。

3． 若引物序列高度简并，利用脊椎动物基因组中CpG二核苷酸的较低丰度，可望降低兼并度。

并结合密码子优先表，或在有兼并度的地方引入次黄苷来降低兼并度。

4． 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基。

但令人吃惊的是，当G、C或T发生错配时，3’端的T残基相对保持中立。

5． PCR产物的合适长度为200～1000bp。

6． 如果蛋白中有两个以上的区域高度保守，可构建几套PCR引物，以便使用“巢式”PCR来增加特异性。

PCR反应条件

1． 退火温度总的来说，退火温度越低，非特异性扩增的可能性越大。

低至37度的退火温度也可被采用于高度简并的引物进行PCR扩增。

TouchdownPCR也可以减少错误扩增

2． 扩增的循环数过多循环数导致非特异性带的产生；可以每5个循环取一定样品来检测扩增的特异性

3． 降温时间不同的PCR仪效率不同。

较长的降温时间有利于错配杂交的产生

4． PCR缓冲液成分主要在于Mg＋＋离子的浓度。

Primer5.0设计简并引物的方法：

首先把各个CDs序列分别存储为fasta格式，然后在file-open-DNAsequence里边把各个序列依次加入，然后点击align，比对完之后再点击primer，调整参数进行search或手工拉动选择引物。

表现的形式是非简并性的，但是你从下边可以看得出来哪个碱基是非简并性的，再手工调整。

其他原则同一般的简并引物设计原则，如3‘避免简并性等等。

还可以在线用codehop设计，如果需要这种方法，我可以告诉你怎么搞。