A Posttranslational Modification Cascade Involving p38 Tip60 and PRAK Mediates OncogeneInduced Se.docx

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APosttranslationalModificationCascadeInvolvingp38Tip60andPRAKMediatesOncogeneInducedSe

涉及到P38，TIP60和PRAK的翻译后修饰级联反应调节引诱导的衰老

摘要

癌基因诱导的衰老是一种重要的肿瘤抑制的防御机制。

然而，介导的衰老反应的信号通路相对而言知之甚少。

在这里，我们证实了一个多功能乙酰转移酶，TIP60，在致癌基因ras介导的衰老起着至关重要的作用。

进一步的调查结果显示，蛋白质翻译后修饰级联涉及三个蛋白P38，TIP60和PRAK，是ras基因诱导的衰老所必需的。

当ras基因活化后，p38通过磷酸化Tip60的Thr158诱导Tip60乙酰转移酶活性;激活的Tip60又通过p38同时磷酸化Tip60和PRAK的磷酸化依赖方式乙酰化PRAK的K364，从而直接与PRAK作用并诱导PRAK的蛋白激酶活性。

这些翻译后修饰分别对Tip60和PRAK的prosenescent功能是至关重要的。

这些结果已经明确了一个介导癌基因诱导的衰老的信号通路，并确定了调控Tip60和PRAK的酶活性和生物功能的翻译后修饰途径。

引言

在正常的哺乳动物细胞内，癌基因如ras基因的激活触发稳定增殖的停止，被称为致癌基因诱导的衰老。

类似细胞凋亡，癌基因诱导的衰老也是抗肿瘤的防御机制。

最近的研究表明，癌基因诱导的衰老在体内发生，并提供了肿瘤发生的一个真正的障碍。

介导ras基因诱导衰老的信号转导通路还没有得到充分的了解。

致癌ras基因诱导的衰老依赖于RAF-MEK-ERKMAPK通路的激活，其特点是上调细胞增殖抑制剂的表达，包括p16INK4a，P53，p21WAF1和p14/p19ARF，以及细胞炎症因子的分泌增加。

我们和其他人也已表明，ras基因诱导的衰老需要激活的p38MAPK。

我们进一步证实，p38在衰老和肿瘤抑制的功能是其下游底物PRAK蛋白激酶所介导的。

灭活PRAK导致衰老反应的中断（破坏）和在细胞培养与小鼠癌症模型中肿瘤发生的增强，表明PRAK具有肿瘤抑制活性。

在试图描述介导PRAK肿瘤抑制功能的信号通路，我们在目前的研究中通过酵母双杂交筛选确定了一个的PRAK相互作用蛋白TIP60。

进一步的调查显示，与p38和PRAK类似，Tip60也是致癌ras基因诱导的衰老必不可少的。

Tip60是组蛋白乙酰基转移酶（HATS）MYST家族的一个成员，涉及到多种细胞过程。

Tip60已被证明有抑癌基因的功能。

Tip60的功能可能是通过转录机制介导的，其中Tip60被招募到靶启动子上并参与组蛋白乙酰化，或者通过独立的转录机制介导的，其中TIP60通过与非组蛋白直接作用和乙酰化来改变非组蛋白的活性或表达。

尽管越来越多的证据表明TIP60在多种细胞过程中的重要作用，调节TIP60活性的机制仍知之甚少。

最近的研究发现Ser86是TIP60的GSK3磷酸化位点。

GSK3磷酸化Ser86后，Tip60通过乙酰化ULK1，参与生长因子剥夺/缺失诱导的自噬，或通过乙酰化p53蛋白，促进细胞凋亡。

然而，对TIP60功能的转录后调控进行更全面的分析是必要的。

在目前的研究中，我们已经确定了一个涉及P38，TIP60和PRAK，三个蛋白质信号元件的翻译后修饰级联通路，通过调节这些酶的活性和生物学功能，介导癌基因诱导的衰老。

在对致癌ras基因做出反应时，p38通过磷酸化Thr158残基诱导Tip60的乙酰转移酶活性，接着活化的Tip60乙酰化PRAK的Lys364，从而刺激PRAK的蛋白激酶活性。

这些翻译后修饰是Tip60和PRAK调解衰老的能力所必须的。

因此，我们的结果已确定了一个癌基因诱导的衰老中起着关键的作用的信号转导途径，并确定了调节Tip60和PRAK蛋白的酶活性和生物的功能的翻译后修饰。

结果

鉴定TIP60是一个PRAK结合蛋白

要阐明的PRAK衰老诱导和肿瘤抑制的作用机制，我们筛选HeLa细胞cDNA文库搜索PRAK相互作用蛋白，以PRAK作为诱饵来进行酵母双杂交筛选的方法。

筛选确定了一个代表多功能HATTip60的C-末端片段（氨基酸188-513）的克隆，（图1A）。

要确认PRAK与Tip60的相互作用，用带有FLAG标签Tip60a和带有Myc标签的PRAK转染到293T细胞中，并用抗-FLAG抗体的免疫沉淀。

PRAK在FLAG-Tip60的复合物中容易检测到（图1B）。

互补实验中，所有这三个Tip60的的亚型（Tip60-1，Tip60α，Tip60β）的共沉淀与V5标签PRAK（图1C）。

Tip60也结合到PRAK的激酶死亡突变体（K51M）（图1B），这表明相互作用不需要PRAK的激酶活性。

此外，从原BJ人类成纤维细胞中得来的HA标记的PRAK与FLAG标签的Tip60α和Tip60β免疫共沉淀（图1D）。

内源性的Tip60和PRAK之间的相互作用中也能在衰老BJ细胞的核提取物观察到的（图1E）。

这些结果证实了，Tip60与PRAK在细胞有生理相互作用。

在GSTpull-down方法，重组的Tip60a被GST-PRAK珠捕获，但不GST珠（见图S1A在线），表明Tip60的PRAK相互作用是直接。

此外，使用相互免疫共沉淀（图1F）和GST下拉（图S1B）检测，我们发现当TIP60的HAT结构域被删除（335-477，261-492），PRAK相互作用几乎被废止/消失的，表明PRAK主要结合到TIP60的HAT结构域。

由于Tip60的保守HAT结构域的结合乙酰co-A和底物，如组蛋白H2AX，这一发现提出了一个可能性即PRAK使Tip60的底物

Tip60的ras基因诱导的衰老是必不可少的

Tip60的基因编码三个异构体，是选择性剪接的结果：

TIP60-1，Tip60a和Tip60b。

设计四套引物，通过PCR来检测这些异构体。

引物A和C检测Tip60a和Tip60b，B和C检测TIP60-1，C和D扩增三个亚型的所有可变区和tot5，tot3扩增的所有亚型（图S2A和S2B）的共同区域。

Tip60a和Tip60b，在引物A+C和C+D在原BJ人类成纤维细胞，容易检测，适当的尺寸大小TIP60-1的片段无法由C+D或B+C扩增（图S2C）。

（只有一种更小的非特异性片段由B+C扩增出来），在免疫印迹分析BJ细胞裂解物时，抗Tip60的抗体​​检测的蛋白带与在293T细胞中Tip60a，Tip60b异位表达共迁移，但Tip60-1不共同迁移（图S2D）。

这些结果表明，两个Tip60aTip60b在BJ细胞中有表达，而Tip60-1没有。

W138的原代人成纤维细胞中得到了相似的结果（数据未示出）。

为探讨TIP60在衰老诱导中的作用，构建了Tip60的的shRNA，检查对ras基因诱导的BJ细胞衰老的效果。

shRNA有效地沉默了两个Tip60aTip60b表达（shTip887和1506，图2A和2B，图S2D）阻止Ras诱导的增殖抑制和SA-B-半乳糖苷酶（图2C，右边面板，图2E）积累。

此外，我们还设计了一个shRNA（shTip404）通过对第5外显子打靶，敲低Tip60-1和Tip60a，但不敲低Tip60b，一个shRNA（shTip275）通过对交界处的外显子4和6打靶，敲低Tip60b，但不敲低Tip60-1或Tip60a，（图S2A）。

正如预期的那样，shTip404和shTip275分别沉默Tip60aTip60b在BJ细胞的表达（图2A和2B，图S2D）。

然而，这些构建体没有阻断ras基因诱导的衰老（左面板中，图2C和图2E），表明Tip60a和Tip60b是功能上是冗余的。

此外，异位表达一个Tip60的小鼠（mTip60）不能被人类Tip60的shRNA的沉默（图2D，插入）在shTip887沉默表达后恢复的ras基因诱导的衰老BJ细胞中（图2D和2E），表明衰老诱导的旁路在BJ细胞是由于TIP60特异性敲低，而不是shRNA的脱靶效应。

总而言之，这些结果表明，Tip60在ras基因诱导的衰老重是必要的。

在体外和细胞，P38磷酸化TIP60Thr158/106

Tip60的PRAK之间的相互作用促使我们调查ras基因诱导Tip60的磷酸化，是通过PRAK还是其上游激酶p38。

当在293T细胞中共同表达P38A和有作用的/积极地MKK3（MKK3E），Tip60在SDS-PAGE显示较慢的移动性（图S3A）。

流动性的转变是由于磷酸化，因为隔离Tip60与λ磷酸酶处理会被消除时（S3A图）。

当p38或MKK3突变失活（p38aAF或MKK3AA）（图S3B，顶部面板），流动性的转变也会被消除，这表明Tip60的磷酸化依赖于有作用的MKK3和p38。

在H1299细胞（图S3B，底部面板）进行了相同的观测。

因此，在细胞内Tip60是由激活态的p38磷酸化的。

与此相反，PRAK，MKK3E和P38A的共转染，未能进一步增强Tip60的磷酸化（图S3B），表明PRAK没有在细胞Tip60的磷酸化起作用。

直接评估p38对TIP60的磷酸化，我们通过重组或免疫沉淀p38进行体外激酶分析。

当用MKK3E，FLAG-P38A，但不是它的激活点突变体（AF）共转导BJ细胞，体外磷酸化Tip60的免疫沉淀（图3A）。

在哺乳动物中，存在四种p38的亚型，P38а，P38в，p38г，p38б。

Tip60是由MKK6E依赖方式的p38的所有四个亚型重组体所磷酸化的（图3B）。

作为阳性对照，对p38亚型的重组体磷酸化一个已知的底物ATF2进行免疫沉淀（图3A，3B）。

因此，Tip60是p38的一个直接的底物

用质谱法分析Tip60a被P38A和MKK6E重组体的磷酸化，我们确定了磷酸肽，含有磷酸化的Ser155或Thr158（分别对应Tip60b的Ser103或Thr106）。

然而，由于这两个位点很接近，质谱是无法解析这两个位点的大小。

因此，我们研究Tip60a与S155A，T158A重组体的磷酸化，或在体外将这两个位点都突变了。

T158A，但不S155A，消除Tip60a被p38磷酸化（图3C）。

同样，T106A，但不S103A，扰乱P38-介导的Tip60b（图S3C）的磷酸化。

更换Ser90（细胞周期蛋白B/Cdc2的磷酸化位点）和Ser98，没有影响p38介导的Tip60的磷酸化（图3C）。

此外，共转染到293T细胞后，p38/MKK3E介导的TIP60依赖磷酸化的流动性改变由T158/106A消除，但不由S155/103A突变体消除（图S3D）。

因此，这些结果确定了Thr158/106是p38磷酸化Tip60的底物位点，不管是在体外还是在细胞中。

Thr158/106位于染色质和锌指之间的铰链区，以及与p38的磷酸化位点（S/TP）相匹配（图1A）

衰老细胞中致癌基因RAS诱导的P38-介导的TIP60在Thr158/106位点的磷酸化，

为了方便分析TIP60在衰老细胞中的磷酸化，我们提出了一个特异性磷酸化抗体（pTip60T158），特异性识别TIP60的Thr158位点的磷酸化（S3E图）。

在一个IP耦合的免疫印迹分析中使用这种抗体，致癌ras基因诱导的Thr158/106磷酸化，Tip60a，Tip60b都用FLAG标签标记，稳定转导到BJ细胞（S3F图）。

由pTip60T158抗体检测到的Ras诱导的Tip60a磷酸化被T158A突变消除，但不由S155A突变消除（图3D），进一步证实为Thr158是ras诱导的磷酸化位点。

pTip60T158抗体在BJ细胞也检测RAS-和MKK3E的诱导内源性Tip60aTip60b，分别被Tip60的shRNA减低了（图3E）的信号。

因此，在衰老细胞中激活后的RAS和p38，对异位表达和内源性Tip60的蛋白磷酸化都是在Thr158/106。

当在BJ细胞中使用P38A和P38B一种化学抑制剂SB203580时，ras和MKK3E诱导Tip60a和Tip60b上的Thr158/106的磷酸化都大大减少，这表明p38是Tip60-T158/106在衰老细胞中的磷酸化所必需（图3F）。

要进一步探索介导ras基因诱导Tip60的磷酸化的的p38亚型，我们检测了P38A，P38B，p38g，和p38d的组成性激活突变体的影响。

在这些突变体在体外和体内都获得了自发性蛋白激酶活性，同时保持与野生型（WT）p38亚型相似的底物和抑制剂的特异性。

当与相应的WT相比时，在BJ细胞中稳定表达的异构体中只有活性P38а和p38б突变体能刺激Tip60a-T158的磷酸化（图3G），这表明，在TIP60-T158的磷酸化中只有P38а和p38б起作用。

此外，在BJ细胞中shRNA介导P38а和p38б的敲低大大减少了异位表达的致癌基因Ras诱导Tip60a-T158的磷酸化（图4D）。

与此相反，靶向p38г的shRNA对ras基因诱导Tip60的T158的磷酸化没有影响（S3G图）。

这些研究结果表明在衰老细胞中，癌基因ras基因激活后，P38а和p38б，而不是p38г，调解Tip60在Thr158/106的磷酸化，尽管在体外所有四个P38亚型都可以磷酸TIP60（图3B）。

这可能是由于不同的亚细胞定位，使P38а和p38б可与Tip60接触。

另外，P38亚型可能与不同的辅助因子相互作用，调节自己在细胞中磷酸化TIP60的能力

P38-介导TIP60-158的磷酸化对Ras诱导TIP60酶活性及衰老前功能是必不可少的

接下来，我们调查了由于p38磷酸化Tip60对调节Tip60的乙酰转移酶活性和生物学功能的可能性。

在体外培养时，含有P38A和MKK6E，没有ATP（一种Tip60的T158不会被磷酸化的条件），Tip60a乙酰化组蛋白H4取决于剂量。

在反应中加入ATP导致Tip60-T158的磷酸化并使每一个Tip60的浓度下的组蛋白乙酰化都增加（图4A）。

此外，在SB203580的存在（抑制Tip60的-T158的磷酸化），或Thr158突变成Ala甘氨酸时，P38A和MKK6E不能使Tip60组蛋白乙酰化提高（图4B）。

因此，在体外p38的磷酸化TIP60-Thr158可刺激HAT结构域活性

使用一个IP耦合HAT的分析，我们分析了在衰老细胞中的p38和致癌基因RASTIP60活性。

用FLAG-Tip60a免疫沉淀，转导了haRasV12或MKK3E的BJ细胞，与对照细胞相比，显示了一个的HAT对组蛋白活性的增加，致癌基因ras诱导TIP60的HAT活性被T158A突变体消除（图4C），这表明致癌基因ras和活性状态的p38通过磷酸化Thr158诱导Tip60的活性。

进一步支持了p38在ras基因的激活TIP60中的至关重要的作用，shRNA介导的P38а或p38б的敲低，消除了Ras诱导的Tip60a-T158磷酸化，并降低了BJ细胞中Ras诱导的Tip60a的HAT活性，在组蛋白H4作为底物的IP-HAT分析确定（图4D）。

此外，在BJ细胞的蛋白质表达和免疫沉淀时，在含有磷酸盐类似物突变的Thr158/106，Tip60a-D158和Tip60b-D106Tip60的突变体，与WTTip60蛋白相比显示HAT活性的增加（图4E）。

这些数据表明，在诱导衰老过程中，致癌ras通过介导p38的磷酸化Thr158刺激Tip60的酶活性

在BJ细胞小鼠Tip60的异位表达能恢复表达了人Tip60的shRNA的ras基因诱导的衰老（图2D和2E，图4F，左侧面板中，如图4G），表明该鼠Tip60可在衰老功能上替代人类Tip60。

S155A突变体在小鼠Tip60介导的衰老系统中没有影响（图4F，中间面板），但是，T158A突变体不能恢复人类Tip60的shRNA存在下的衰老（图4F，右面板图4G）。

因此，TIP60的Thr158的磷酸化在调解ras基因诱导的衰老上是必要的。

综上所述，我们的研究结果表明，在ras基因诱导的衰老过程中p38磷酸化TIP60的Thr158对TIP60的酶活性和生物功能起着至关重要的作用。

虽然TIP60-D158突变能增强Tip60的HAT活性，但这种突变不能诱导衰老（图S4），这表明P38对Tip60单独的磷酸化和激活都不足以诱导衰老

Tip60的乙酰化PRAK中的磷酸化依赖方式

我们研究PRAK-Tip60的相互作用是否会导致PRAK被TIP60乙酰化。

事实上，在MKK6E和P38A的存在下，将Tip60a与PRAK进行温育导致PRAK的乙酰化，是在一个随时间（图5A）和剂量（图5B）变化的方式。

Tip60乙酰化PRAK依赖于磷酸化，在不加ATP的情况下（图5B）Tip60和PRAK没有磷酸化时，PRAK乙酰化减小。

PRAK和Tip60都是p38的底物，我们确定了磷酸化的某一蛋白与TIP60乙酰化PRAK相关。

来分析Tip60的磷酸化的影响，我们首先在ATP的存在下孵育PRAK与MKK6EP38A，随后加入SB203580抑制p38活性，再与Tip60a孵育。

与媒介物处理对照相比，用SB203580有效防止WTTip60a的磷酸化，对PRAK的磷酸化无影响，并同时极大地抑制PRAK乙酰化（图5C，比较泳道2和5）。

此外，T158A突变使p38的磷酸化Tip60a消除也减少Tip60a乙酰化PRAK的能力（图5C，比较泳道2和3）。

因此，Tip60对PRAK的乙酰转移酶活性是由p38的磷酸化Tip60刺激产生的。

此外，PRAK的p38磷酸化位点T182A突变，呈现p38不能磷酸化PRAK，显著降低Tip60的乙酰化PRAK，尽管p38磷酸化Tip60是完整的（图5D，比较泳道2和5，泳道3和6），p38磷酸化PRAK也是Tip60最佳的乙酰化PRAK所需要。

因此，Tip60的乙酰化PRAK是通过p38同时磷酸化Tip60和PRAK的依赖方式

用来比较的Tip60的和PRAK磷酸化的平行的影响，我们先孵育PRAK与MKK6E和P38A或无ATP，然后在存在或不存在的SB203580与Tip60a（图4E）。

缺少ATP的情况下，阻止Tip60a和PRAK两个的磷酸化（泳道3和4）。

加入ATP和SB203580导致在PRAK乙酰适度增长（泳道1），加了ATP不加SB203580导致PRAK，Tip60a都磷酸化，与单独PRAK被磷酸化（泳道1）相比，PRAK乙酰化进一步上升（泳道2）。

这些结果表明，p38对PRAK的磷酸化和对Tip60的磷酸化与Tip60对PRAK的乙酰转移酶活性是积累作用/附加作用。

此外，MKK3E，P38A，WTTip60a，但没HAT缺陷的（HD）的突变体Q377E/G380E共转染到293T细胞中，乙酰化PRAK（图S5C，比较泳道2和4，而图6B，比较泳道2和3），表明Tip60是一个细胞内PRAK乙酰基转移酶。

高效Tip60a乙酰化PRAK只当MKK3EP38A共转染时才观察到（图S5C，比较泳道2和3），表明在p38介导的磷酸化，也与细胞内Tip60乙酰化PRAK相关

在293T细胞Ras诱导的衰老中，Tip60乙酰化PRAK的K364位点

在体外用质谱法分析Tip60乙酰化PRAK，我们确定了两个分别含有乙酰基的K51和K364的PRAK肽。

确认K51和K364是Tip60在体外的乙酰化位点，K51R或K364R单独突变大大降低Tip60a对PRAK乙酰化，而双突变消除了Tip60a对PRAK乙酰化（图6A）。

然而当Tip60a和PRAK共转染到293T细胞中，在MKK3E和P38A的存在下，K51R仅略有减少PRAK乙酰化，而K364R完全消除PRAK乙酰化，Tip60的介导的PRAK乙酰化（图6B），这表明K364是细胞内Tip60乙酰化PRAK的主要位点

接下来，我们研究在致癌ras基因诱导的衰老过程中，TIP60在PRAK乙酰化中的影响。

HA-标签PRAK稳定转染到初级BJ细胞，在致癌基因ras诱导的衰老后进行免疫沉淀。

通过使用抗-乙酰基-赖氨酸的抗体对PRAK乙酰化进行westernblotting分析。

事实上，在细胞中ras基因诱导PRAK乙酰化，能被稳定表达的Tip60shRNA（shTip60-887，1506）消除（图6C）。

此外，K364R突变从根本上消除ras基因诱导的PRAK乙酰化，而K51R几乎没有影响（图6D）。

因此，诱导衰老过程中，致癌基因ras诱导依赖于Tip60的PRAK乙酰化主要是K364位点处。

我们使用IPwesternblotting进一步研究TIP60对内源性PRAK的乙酰化。

当与MKK3E，P38A，WT但不是HD，共转染到293T细胞中，Tip60a诱导内源性PRAK乙酰化（图6E）。

此外，在BJ细胞中致癌基因ras诱导内源性乙酰PRAK，能被Tip60的shRNA消除（图6F）。

这些发现加强ras基因诱导的衰老过程中Tip60的乙酰化PRAK这一见解。

TIP60乙酰化K364刺激PRAK激酶活性是致癌基因Ras诱导的PRAK的激酶活性和衰老前功能是必不可少的

Tip60乙酰化PRAK，促使我们研究Tip60的乙酰化在PRAK活性和功能上的影响。

在体外激酶检测，与WTTip60a一起孵育大大增加PRAK对HSP27的蛋白激酶活性，同PRAK没有被乙酰化相比之下，即没有Tip60或有HDTip60a存在（图S5A比较泳道1和2，以及3和4），或没有的乙酰辅酶A存在（图S5B）。

我们共转染Tip60a，PRAK，MKK3E和P38A到293T细胞，并用免疫沉淀测量PRAK对HSP27的蛋白激酶活性。

WTTip60a，但不HD，导致PRAK乙酰化并强烈刺激PRAK对HSP27的激酶活性（图S5C，比较泳道2和4，图7B）。

这些都表明在体外和细胞中PRAK激酶活性是由Tip60乙酰化诱导的。

此外，重组Tip60不能刺激K364R突变的PRAK的蛋白激酶活性，因为Tip60的乙酰化被破坏（图7A）。

K51R突变大大降低PRAK对底物的激酶活性，可能是由于ATP三磷酸腺苷结合减值，K51位于PRAK的ATP结合凹槽内。

在IP激酶分析后293T共转染，K364R突变消除Tip60诱导的PRAK激酶活性（图7B）。

因此，在体外和细胞中Tip60乙酰化K364对PRAK激酶活性的刺激是必不可少的

我们进一步研究PRAK乙酰化在ras基因诱导的衰老中的影响。

如前所述，从ras基因诱导的衰老的BJ细胞中免疫沉淀PRAK，显示HSP27的激酶活性增加与对照细胞相比（图7C）。

然而，在稳定表达Tip60的shRNA的BJ细胞中，这种诱导PRAK活性大大削弱（图7C），表明在衰老细胞中致癌ras刺激PRAK激酶活性是Tip60依赖性的。

此外，K364R突变的PRAK，破坏了TIP60乙酰化，也消除了ras基因诱导的PRAK激酶活性（图7D）。

这些结果证明在诱导衰老过程中，致癌基因ras刺激PRAK的酶活性的方式，至少部分是通过Tip60介导的PRAK的K364乙酰化

我们曾报道靶向人PRAK的shRNA扰乱ras基因诱导的衰老，，不能由人类PRAKshRNA沉默的异位表达的小鼠PRAK，能在表达人shRNA的细胞中恢复衰老。

使用这个系统，我们测试Tip60的乙酰化位点在PRAK调解衰老的能力中的影响。

正如预期的那样，WT小鼠PRAK恢复ras基因诱导的增殖停止（图7E）和在表达了人类PRAKshRNA的（shPK89）细胞中表达SA-β-半乳糖苷酶标记（图7F）。

与此相反，小鼠的PRAK携带K364R突变不能恢复衰老诱导（图7E和7F），这表明Tip60乙酰化PRAK在介导ras诱导的衰老中很重要。

因此，在ras基因诱导的衰老过程中，Tip60乙酰化K364，对PRAK的激酶活性和衰老前功能