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抗体酶
由DNA,DNA酶I和DNA酶II引起的免疫系统产生的DNA酶,RNA酶,和Phosphatase的抗体活性
Abstract
兔子在免疫DNA,DNA酶1,DNA酶2后,产生与DNA酶,RNA酶(核黄素和去氧核糖寡核苷酸的水解影响(ON)),核酸酶(去除5′端的去氧核醣寡核苷酸磷酸残基)相关的抗体,比较这些抗体(AB)的接触活性。
将从没有该免疫反应的兔子体内提取出来的多克隆抗体(AB)进行电泳,结果表明不具有这种接触活性。
兔子免疫DNA,DNA酶1,DNA酶2后产生IgG抗体酶,IgG抗体酶表现了高度的去氧核醣寡核苷酸水解反应活性和甚至高裂解5′端去氧核醣寡核苷酸磷酸残基的能力。
在这个反应中,超螺旋质体DNA和在依赖核酸酶水解的抗体反应中发现的去氧核醣寡核苷酸和磷酸酶裂解5′端磷酸残基的Km值相差.这表明核酸酶和磷酸酶的活性属于在多克隆抗体中的微小不同的抗体酶.因此,动物在第一次免疫DNA,DNA酶I,和DNA酶II后,实验数据表明抗体的一种结构可能表现出磷酸酶活性。
然后讨论兔子在免疫这些免疫原后产生具有磷酸酶活性的AB抗体的可能原因。
人工抗体对化学反应中的固定的过渡态类似物的催化功能已经描述的很清楚。
众所周知,在健康的捐献者的血液中可能含有对抗不同的抗原的多克隆auto抗体。
然而,血液里的具有不同催化活性的AB是不同的自身免疫病的特征,具有不同自身免疫病的血液中的与auto-AB相关的数量也明显较常人高。
推测有两条主要途径的天然抗体酶组成比如在特定模拟态的条件下,人工抗体,天然抗体可以直接产生来对抗抗原
AmongsuchabzymesareABspecificallyhydrolyzingvasoactiveintestinal肠的peptide缩氨酸(VIP)(asthma)[9],thyroglobulin甲状腺素(autoimmunethyroiditis甲状腺炎)[10],myelin髓素basicprotein(multiplesclerosis多发性硬化症)
[11],andanumberofdifferentproteinsinmanyAIDs[5_
8].在这样的抗体酶AB明显地水解和一系列在自身免疫病的不同蛋白质.有核酸酶活性的抗体酶可以直接产生对抗自由的RNA和DNA或是它们的和不同蛋白质的复合体。
非特异性的抗体酶:
它们的组成遵循Erne理论.如果特异性的AB定向的对抗酶的活性中心,然后相应的第二非特异性AB有初始的酶反应中心的结构特征并且展现出催化活性。
小剂量的酶用于获得具有醋胆素酯酶,羧肽酶,和β-内酰胺酶活性的单克隆抗体酶.可以想象患有红斑狼疮病的患者的血液中含有DNA水解AB拓扑异构酶I。
在由DNA,RNA和不同蛋白质的混合物引起不同的自身免疫病,anti-DNA和anti-RNA抗体具有核酸酶活性的,包括在细胞凋亡后出现在血液中的组织蛋白。
从患有自身免疫病(SLE,多发性关节炎,多发性硬化),淋巴细胞生物学滑行和一些病毒性疾病的患者的血液中分离出来的IgG或者IgM和IgA被用来水解DNA,RNA,蛋白质,和多糖类。
众所周知,经典的DNA酶水解DNA并且不表现出anti-RNA的活性,RNA酶也不能水解DNA。
患有AIDs的患者的血液和母乳中经典的核酸酶,IgG,IgA,sIgA,andIgM抗体酶水解RNA效果高于DNA。
这表明乳汁中的sIgA对水解rRNA起作用。
有趣地是,不同的老鼠单克隆抗体IgG对不同状态下的B-DNA水解任意RNA的速率为30-100/次,大于水解DNA的速率。
这也表明兔子免疫DNA酶I导致产生特异的AB1,免疫DNA酶产生非特异性的AB2。
然而,最近DNA(RNA)的自身免疫病是否由可以水解DNA和RNA的多功能抗体酶构象引起,或者Ig的同步构象表现出DNA酶或者RNA酶的活性,又或者出现其他一些别的活性还没有研究清楚。
AB是否会具有天然的非特异性的RNA酶活性也不是很清楚。
为了解决这个问题,用DNA酶I,DNA酶II,RNA酶A,和mBSA(甲基化的BSA)和DNA或者RNA的复合体比较AB在水解质体scDNA(超螺旋DNA)和不同的多聚核糖核蛋白的相对活性。
结果得到有效水解RNA和DNA的多克隆抗体组成。
这些反应的比率和AB与DNA和RNA的亲和性依赖使用过的抗原,但并不是所有的,在所有的抗原反应中获得的抗体酶在DNA水解反应中比RNA水解大3-4个光度。
我们相信,不同的AIDs,DNA和RNA水解抗体酶包含一种“混合物”来直接的对抗DNA,RNA,也同时对抗第二AB阻止不同抗体酶水解核酸。
反应中所用的聚合物基板不支持实验员控制是否由相同的或者不同的具有单克隆抗体AB的抗体酶片段来催化水解核酸和展示出磷酸酶活性。
这些研究的主要目的是分析在兔子免疫DNA,DNA酶I和DNA酶II在水解不同的d(pN)n,(pN)n,and5′端磷酸键断裂时获得的AB的酵素学特征。
DNA酶和RNA酶的活性研究是在电泳和免疫同类在兔子免疫DNA和mBSA的复合物,DNA酶I和DNA酶II后的血液中的pIgG抗体。
在每组中有三只兔子。
所用的方法包括分析AB与DNA或者RNA(原位技术)的凝胶共聚反应的活性,结果表明经典的DNA酶和RNA酶没有诱导出IgG,并且催化活性是它们原本的特征而不是来自诱导的抗体酶。
在每组的三种抗原的所得的三种AB制剂展示出相近特征在scDNA和多核糖核苷酸的水解中。
对这种状况加以说明,用于分析一般的状况,在研究中三种混合物都存在,在兔子免疫DNA,DNA酶I,DNA酶II后,各三个IgG制剂与AB含有等摩尔量,以scDNA和混有不同长度的p(N)作为基层来估计实验中AB的DNA酶和RNA酶活性反应中的.在获取AB的过程中scDNA水解导致DNA的构象松弛并随后水解。
就像已知的RNA酶,兔子pIgG水解p(C)的能力大于p(U),但是具有AIDs的病患体内经典的RNA酶和多克隆抗体AB几乎对不能水解p(A)和p(G)。
scDNA和混杂长p(N)用于限制决定scDNA和多聚RNA水解的催化动力学特征的可能性和它们的产物AB依赖降解并分析它们的磷酸酶活性。
由于这一点,用单链5′[32P](pN)9_和[32P]d(pN)10来更详细的分析特征AB依赖催化不同长度的DNA和RNA水解,移除它们5′端的磷酸基的物理化学界限。
这表明从未免疫和mBSA免疫的兔子的血液中含有的AB不能水解5′_[32P](pN)n或者5′_[32P]d(pN)n,并且不能断裂它们的5′端磷酸基。
然而,从DNA,DNA酶I,DNA酶II免疫的兔子的血液中的AB能有效的断裂5′[32P](pN)n和5′[32P]d(pN)n的5′端的磷酸基。
如图1c,电泳分析数据表明从5′[32P](pC)10处断裂的正磷酸,反应由DNA酶II免疫的兔子的血液中的IgG催化。
正如上边所说,用对应不同的抗原的AB制剂免疫兔子的血液中p(N)的水解速率比DNA高3-4单位。
当比较5′[32P](pN)n和5′[32P]d(pN)n的水解,观察相似状况。
图1e表明了DNA酶II免疫兔子的血液中的IgG制剂水解5′[32P](pC)10的数据模型。
用评估AB在水解不同5′[32P]核糖寡核苷酸和断裂它们的5′端磷酸基的相对活性电泳分析结果.
图2,35′[32P](pC)10和5′[32P](pU)9的RNA酶水解和它们的相对速率依赖和断裂它们5′端依赖于协调3种不同的抗原的集中。
5′[32P](pC)10和5′[32P](pU)9酶水解的基础在高浓度溶液中饱和的米氏方程双曲线已经研究清楚。
表格表明寡核糖核苷酸底物的Km值和用这些曲线的非线性的双曲线的逆向双曲线和双倒数方程计算kcat,都显示了同样的结果。
可以看出,所有的AB制剂对于pC)10的亲和性都近似于3.4-6.4,高于对(pU)9亲和性。
这与IgG制剂对p(C)有高度亲和性,高于p(U)相一致。
基于磷酸酶断裂5′端磷酸基的反应速率类似于所有AB制剂的双曲线的线性范,记录使用的寡核糖核苷酸的浓度。
估计可能的Km和kcat值,用电脑分析用于曲线近似值的曲线。
在图2,由决定磷酸酶从5′[32P](pC)10断裂5′端磷酸基的三种速率的因素非常相似。
电脑分析这些曲线,结果表明有大致相似的Km和kcat值。
在图3,磷酸酶从5′[32P](pC)10断裂5′端磷酸基的速率显然超过RNA酶在最少底物浓度断裂的速率,并且有相当数量的不同曲线类似于基于兔子免疫DNA,DNA酶I和DNA酶II产生的AB。
5′[32P](pU)9曲线的非线性复原的双曲线近似值提供来估计可能的Km和kcat值。
然而,因为具有磷酸酶活性的AB催化中心有亲和特征的5′[32P](pU)9的Km的估计值中可能有一系列的错误,超出抗体酶的中心展示的RNA酶活性的threeorders与这些估计值一致。
考虑关于用于分析磷酸酶活性的大量ON,在兔子免疫DNA酶II和5′[32P](pU)9得到抗-DNAAB,直接分析高浓度的5′[32P](pC)10的Km和Vmax(kcat).(pC)10的Km和Vmax(kcat)值介于0.9mM和1.7min–1,(pU)9的Km和Vmax(kcat)值,它们与上面提及的双曲线近似值一系列的估计值相似。
因此,ribo-ON亲和性对于AB的活性中心展示磷酸酶活性接近50-450times低于RNA酶活性中心。
有趣地,kcat值描述具有磷酸酶活性的AB是19-20高于RNA活性的抗体酶.因此,同步RNA酶分析和磷酸酶活性研究兔子AB,由于在低浓度下饱和的活性中心展示出RNA酶活性。
维生素B2磷酸酯钠,核黄素磷酸酯钠
记录从兔子免疫DNA,DNA酶I,andDNA酶II后的血液分离AB,由AB刺激的从脱氧-ON(5′[32P]d(pC)10and5′[32P]d(pU)10)断裂的5′端磷酸基,在同样的速率从ribo-ON发生近似相同的断裂。
然而,从deoxy-ON断裂5′端磷酸基的速率基于AB制剂潜伏期超出它们的DNA酶断裂。
这让用Kmandkcat值描述DNA酶中心deoxy-ON的相互影响的定量的评价非常困难。
然而,数据表明在微摩尔浓度类似于ribo-ON,DNA会水解兔子免疫deoxy-ON的血液中的AB。
低于DNA酶和RNA酶活性的磷酸酶活性与ribo-和deoxy-ON对于从不同AIDs患者血液中分离抗体酶的相似亲和性相一致。
DISCUSSION
数据表明,除具有DNA酶和RNA酶活性的AB之外,兔子免疫DNA,
DNaseI,和DNaseII,结果导致抗体酶展示出磷酸酶活性。
在从免疫了DNA,DNaseI,andDNaseII的兔子的血液中产生AB过程中的scDNA和ON的Km值是AB和抗原的高度的联系的特征,并且是明显的低于这些对于DNaseI和RNases。
一些已经公布的数据被认为是用来兔子AB的DNA酶和磷酸酶活性分析。
。
所知道的DNA和RNA的依赖酶,Km值从10–6to10–10M显示对不同的DNA和RNA亲和性。
然而,单核苷酸的亲和性,广义的DNA和RNA对于不同的磷酸酶和ATP酶以Km的形式是相当的,并且依赖于特殊的酶,从10–4to10–3M变化。
显然,具有核酸酶和磷酸酶活性的抗体酶可以见证DNA和RNA亲和性重要的不同的一个相似的状态。
在研究中,比较存在于自然情况下的自身免疫MRL-lpr/lpr老鼠的血液中的多克隆AB和存在于杂交瘤技术里的老鼠的单克隆IgG相关的磷酸酶和DNA酶活性。
比较从兔子免疫DNA,DNaseI,andDNaseII后的多克隆抗体IgGscDNA的Km值,和早期在患有自身免疫病老鼠的血液中的AB的scDNA的Km值,具有不同AIDs的患者血液中的IgG
基于scDNA转变为d(pN)10和(pN)10,从AID患者的血液中的AB对于核酸的亲和性减少1-2ordersofmagnitude。
免疫的兔子的血液中的AB,观察到scDNA和Ribo-ON在Km值稍有不同。
就整体来说,在任意的器官的AB的scDNA,deoxy-,和Ribo-ON的Km值比AMP和ATP低2-5ordersofmagnitude,包括免疫后的兔子的血液,作为患有自发的SLE的老鼠的血液中的AB催化磷酸酶断裂单核苷酸末端磷酸基的特征
这表明AMP和ATP不能阻止老鼠的AB催化scDNA的水解,甚至进入单核苷酸的中心。
反过来,scDNA和deoxy-ON使5′端磷酸基能躲藏端磷酸基从AMP和ATP的断裂。
这表明磷酸酶和核酸酶的活性展示由不同的老鼠多克隆AB的抗体酶片段。
具有磷酸酶活性的老鼠单克隆IgG高效的断裂AMP和ATP的端磷酸基,但是不能水解scDNA和ON,同时,在高浓度时,它们从d(pN)n寡核苷酸断裂端磷酸基。
这表明老鼠单克隆AB的DNA可以很好的水解DNA和RNA。
这也就意味在天然的AID发生的过程中,会有更好的具有磷酸酶或DNA酶活性的AB产物从属于不同的多克隆抗体酶片段。
原则上来说,就是一个不包括抗体酶可能结构,但活性中心可以催化核酸水解和端磷酸基断裂。
然而,还没有发现一种单克隆AB表现出两种酶活,在AB的结构具有磷酸酶和核酸酶活性时,多克隆抗体酶对于寡核苷酸明显表现不同的亲和性。
显然,在兔子免疫DNA,mBSA,DNaseI,和DNaseII的复合物时,产生有具有核酸酶和磷酸酶活性的抗体酶,和自身免疫小鼠体内的相似。
当同样的AB分子表现出磷酸酶和核酸酶活性时,发现在底物水解和端磷酸基断裂反应,寡核苷酸的Km值在实验错误时重叠。
在分析磷酸酶和核酸酶活性时发现,所有的多克隆AB制剂的亲和性对于ON有很大不同,表明这些反应由兔子催化AB的所有不同结构的抗体酶催化的。
ON对于具有核酸酶活性的pAB的亲和性符合具有这种活性的单克隆和多克隆AB支持这种观点,发现在端磷酸基断裂反应中,底物RNA的亲和性,类似于单核苷酸和寡核苷酸对于经典的磷酸酶,ATP酶,和具有磷酸酶活性的抗体酶的亲和性.
NotethatinthecaseofAIDs,potentialimmunogens免疫原Stimulating刺激formationofantiidiotypic抗炎作用ABwithphosphataseactivitycanbephosphatases,ATPases,anddifferentbloodenzymesremovingphosphatefromlowmolecularweightsubstratesaswellascellularenzymesexhibitingtheseactivitiesrevealed展示intheblooduponapoptosis细胞程序性死亡.
记录在AIDs的过程中,免疫原刺激具有磷酸酶活性的抗炎作用的AB的构象,潜在的磷酸酶,ATP酶,和不同血液的抗体,从低分子量底物转移的磷酸基,同时,细胞的酶表现在细胞程序性死亡的血液
问题的提出,抗原可以刺激具有磷酸酶活性的AB的构象,基于
兔子免疫DNA和mBSA,DNaseI,andDNaseII的复合物。
在免疫聚合的DNA的过程中,兔子血液中会含有DNA碎片,包括5′端磷酸化。
也行是AB产物对抗5′端核苷酸单位,就像DNA可以引起AB具有磷酸酶活性。
除此之外,DNA和mBSA复合物的水解可以和单核苷酸构象联系,
它们和mBSA的复合物同时证明也可以刺激具有磷酸酶活性的AB构象。
在研究中,为了获得具有磷酸酶活性的单克隆抗体酶,我们用
免疫原BSA和ATP结合,在原理上可以模拟mBSA和不同单核苷酸的结合。
以上所提到的,在兔子免疫DNaseI和DNaseII过程中,抗体酶的一部分是自然的抗炎作用,这些AB捆绑到最初的抗体到DNaseI和DNaseII。
然而,IgG的另一部分不与炎症AB影响到DNaseI和DNaseII,但是,这些AB表现DNA酶和RNA酶活性。
这因为这些AB抗体酶是到核酸和DNaseI和DNaseII形成复合物。
自从血液经常含有不同浓度的5′磷酸化DNA,RNA和单核苷酸,也可以和DNaseI和DNaseII联系,作为免疫原,基于动物免疫DNA酶具有磷酸酶活性的抗体酶的结构的途径和免疫DNA和DNA与mBSA的复合物是一样的。
对抗转变态的类似物的AB的反应速率以102-106次低于对于经典的酶。
天然的抗体酶Kcat值从0.001到15.6min–1。
目前,正在研究从健康女性的乳汁和自身免疫的老鼠而来的抗体酶表现磷酸酶活性。
移除从兔子免疫DNA酶I和DNA酶II的血液中的抗体的ribo-和deoxyribo-ON的5′端的磷酸基的kcat值比老鼠自身免疫的血液中的具有磷酸酶活性的AB或者是女性乳汁中的AB低1-2ordersofmagnitude..然而,整体的kcat值超出大部分所知的具有不同活性的抗体酶,和修复酶与限制酶的恒定的反应速率相当。
第一次处理单链ribo-和脱氧核糖单核苷酸水解和AB的5′端磷酸基断裂的分析;这些数据也表明,用DNA,DNaseI,andDNaseII免疫动物,不仅可以产生抗体水解DNAandRNA,也可以产生具有磷酸酶活性的抗体酶。
ThisworkwassupportedbyPrograms程序of
FundamentalInvestigationsoftheRussianAcademyof
SciencesPresidium“MolecularandCellBiology”(No.
6.7)and“FundamentalSciencesforMedicine”(No.
5.16),andbytheRussianFoundationforBasicResearch
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