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生物DNA传感器论文
毕业设计
2013年06月05日
目录
中文摘要1
英文摘要2
1绪论3
1.1生物传感器的定义3
1.2生物传感器的分类3
1.3DNA传感器的关键技术4
1.4DNA检测技术4
1.41电化学检测4
1.42光学检测4
1.43压电晶体5
1.44场效应管5
1.45热敏检测5
1.5DNA传感器的应用6
1.51DNA传感器用于基因检测6
1.52DNA传感器用于环境监测6
1.53抗癌药物的开发6
1.6纳米阵列电极的定义和特点6
1.7纳米阵列电极的制备方法7
1.8纳米压印技术7
1.7纳米压印技术的工艺及特点8
1.7.1热压印8
1.7.1.1热压印的工艺过程8
1.7.2紫外压印8
1.7.2.1紫外压印的工艺过程8
1.7.3微接触印刷9
1.7.3.1微接触印刷的工艺过程9
1.8纳米压印应用9
2.1实验仪器10
2.2实验材料21
2.2.1PDMS21
2.2.2PET22
2.2.3脱模剂22
2.2.4PMMA23
2.2.5其它材料25
3.1模板制作27
3.111000L模板制作27
3.122000L模板制作28
3.2胶厚度的计算28
3.3ANYSY分析SPEL应力分布和变形29
4.实验过程33
4.11000L纳米电极压印实验过程33
4.22000L纳米电极压印实验过程35
5.实验结果和过程的讨论37
5.11000L和2000L压印的结果(显微镜图)37
5.2去底胶时间的确定38
5.2.11000L灰化时间确定38
5.2.22000L灰化时间确定40
5.3去Cr时间的确定和控制41
5.41000L,2000L最终的电镜图43
5.5实验存在问题45
致谢47
参考文献48
生物DNA传感器
摘要:
DNA作为细胞核中染色体的主要成分,是影响人类遗传和健康的重要物质。
而传统的DNA检测比较复杂。
现在兴起的DNA传感器可以克服传统DNA检测复杂等缺点,使检测更简单、更快速、更廉价。
本文利用全新的图形复制方法-纳米压印技术,制作1000L和2000L的纳米阵列电极。
纳米阵列电极是多个纳米电极的集合体。
它克服了单个纳米电极响应信号过小、易受干扰和难以操作等缺点,能极大地提高测量的灵敏度和可靠性,降低操作难度和测量成本。
将其应用到传感器中,这样制作出来的DNA传感器具有较高的性能。
关键字:
DNA传感器纳米阵列电极纳米压印
BiologicalDNAsensors
Abstract:
ChromosomalDNAasthemajorcomponentofthecellnucleus,.Itimpacthumanhealthandit’stheimportanceofgeneticmaterial.ThetraditionalDNAtestingismorecomplex.NowtheDNAsensorscanovercometheshortcomingsoftraditionalDNA.Itmakedetectioneasier,fasterandcheaper.Inthispaper,iusenanoimprinttechnologythatisanewgraphicscopyingmethodtoproduce1000Land2000Lnano-electrodearray.Nano-electrodearrayisacollectionofapluralityofnanoelectrodes.Thesinglenano-electroderesponsesignalistoosmall,vulnerabletointerferenceanddifficulttooperate.Butthenano-electrodearraycanovercomethesedisadvantages.What’smore,itcangreatlyimprovethesensitivityofmeasurementandreliability,reduceoperatingdifficultyandcostofmeasurement.ADNAsensorwithnano-electrodearraywillhavehighperformance.
Keywords:
DNAsensornano-electrodearrayNanopatterning
1绪论
DNA作为细胞核中染色体的主要成分,是影响人类遗传和健康的重要物质。
目前,由于特异性DNA在癌症等重大疾病的诊断中具有非凡意义,其检测备受关注.传统DNA杂交分析方法(如凝胶电泳法)存在杂交效率低、耗时费力、难以实现复杂生物样品检测等缺点。
DNA生物传感器不仅可以克服传统方法存在的不足,实现更简单、更快速、更廉价的检测,而且还能显著提高检测的灵敏度和特异性,为DNA的杂交检测提供一种更有效的检测方法。
[1]
这一特性使得DNA生物传感器在基因分析领域发挥着重要的作用。
除了DNA检测外,还可应用于环境监控、药物研究、法医鉴定及食品分析等领域,具有广阔的发展前景。
而现在利用纳米阵列电极为基体制作生物传感器,非常有利于实现传感器的微型化、集成化,便于进行在体连续监控、活体细胞检测、临床疾病诊断、药理研究等,可以为酶工程、基因工程、细胞工程等提供新的研究工具和手段。
制作纳米阵列的方法有很多,本文用纳米压印的方法制作纳米阵列电极。
[2]
1.1生物传感器的定义
生物传感器的基本概念是指传感器的构成中分子识别元件为具有生物活性的材料,即生物活性材料膜层与相应的换能器的结合体,能实现对特定化学物质的作用并产生相应的可检测信息(如光、电效应、热效应、场效应和质量变化等。
[3]
1.2生物传感器的分类
按DNA识别模型的不同,DNA传感器分为:
(1)单链DNA(ssDNA)传感器,是利用固定化单链DNA探针,在碱基配对原则基础上进行分子识别检测系统,通过DNA分子杂交反应,直接或间接产生的信号变化检测目的基因。
(2)双链DNA(dsDNA)传感器,即固定化双链DNA,利用DNA与其他分子或离子间的相互作用产生的信号进行测定。
1.3DNA传感器的关键技术
一.是有效地将DNA探针在固体基质表面的固定技术;
二.是在传感器液相界面对于靶基因或靶标物质的测定技术。
1.4DNA检测技术
1.41电化学检测
电化学DNA传感器主要是依据所加电活性指示剂与DNA单、双链作用的不同进行识别。
根据检测方式的不同,分为伏安法、记时电位法及电致化学发光法。
伏安法DNA传感器是以所加入的氧化活性物质与杂交后的双链DNA分子作用所引起的氧化还原峰电流或电位的变化或位移来进行测定的,所加指示剂可以是有机金属共价络合物、抗生素、口丫啶染料、苯酰胺染料等能与DNA作用的物质指示剂嵌入后的响应信号与待测DNA物质的量浓度有相关性,从而定性或定量检测基因含量。
电化学DNA传感器饰电极除汞电极外,主要是DNA修饰固体电极,包括金电极,各类碳电极:
玻碳电极(GCE)、碳糊电极(CPE)、裂解石墨电极(PGE)、定向裂解石墨电极(HOPGE)、碳条电极(CSE)等。
1.42光学检测
表面等离子体基元共振(SPR)用于光化学传感器的响应原理是基于金属膜表面待测物质折射率的改变。
一般在棱镜上被覆一层金属银或金的薄膜,与另一种折射率的介质相接触。
经P偏振处理的光线照射进入棱镜,在金属2棱镜界面形成反射。
在某一角度(共振角)测定时,反射光强度最小。
共振角对紧靠金属膜外侧的介质折射率的变化非常灵敏。
当金属膜表面固定的DNA单链探针与溶液中其互补体结合时则会引起折射率的改变,用光波导将折射率的变化传输给检测器可进行检测。
一种检测方式为SPR扫描,是改变入射角度,测定反射光强度与入射角的关系。
另一种检测方式为SPR显微镜,是将入射角度固定在共振角附近,用电荷耦合阵列检测器(CCD)检测反射光强与样品不同部位的关系。
此方式可区分单、双链DNA,并有可能进行突变识别。
荧光型检测法是在DNA探针中或待测靶基因中标上荧光标记物,也可在DNA杂交后加入荧光标记物。
通过测定荧光标记嵌入DNA双螺旋间所导致的荧光信号的变化检测DNA。
DNA探针与溶液中其靶基因杂交后,与荧光嵌入染料溴乙啶(EB)反应,根据荧光强度与溶液中互补DNA的量的正比关系进行分析,可检测出DNA含量。
1.43压电晶体
应用研究较多的是厚度剪且模式(TSM)的压电石英晶体微天平。
这种压电晶体型传感器是利用晶体表面质量变化的原理构建的,在制作完成之后,压电晶体有一个固定的频率,当有少量物质附着在其表面以后,它的共振频率即会发生变化。
当石英晶体表面单链DNA探针与溶液中的互补单链杂交,会引起的晶体表面质量改变ΔM,通过晶体频率的改变量ΔF进行间接检测。
与其它检测法相比,此类方法不需要标记且可实时监测。
1.44场效应管
功函数型场效应管是在场效应管的栅区固定一条含有十几到上千个核苷酸单链DNA片段,当待测物分子与敏感栅作用时,发生电荷转移,导致功函数变化,使阈电压偏移,其改变量ΔVT,可用ID保持恒定时的漏电压表示出来。
同样,功函数型传感器也是探测分子之间的作用,其灵敏度可达ppB级,响应时间小于10s。
由于该传感器可集成化、陈列化,便于多道测量。
同时可微型化,易于实现在体检测。
1.45热敏检测
生物传感器是利用灵敏的热敏元件(主要是热敏电阻)探测生物反应的焓变,进而间接得出待测物的浓度。
该方法的灵敏度较高、稳定性好、价格便宜,若能采用合适的DNA探针标记法(需产生高的热效应),该传感器有可能应用于分子杂交的检测。
以上介绍的各种DNA传感器技术是设计传感器常用的技术方法,在实际应用中,可根据其基本原理,运用多种固定化方法、选用不同的换能器和电活性试剂、光活性试剂进行优化配置。
如另光寻址DNA传感器采用光寻址代替导线接触,使DNA传感器更易集成化、阵列化和连续检测;荧光标记DNA传感器通过测定荧光标记嵌入DNA双螺旋间所导致的荧光信号的变化,检测DNA灵敏度大大提高;电化学发光(ECL)是通过对电极施加一定的电压而促使反应产物之间或与体系中某种组分进行化学发光反应,通过测量发光光谱和强度来测定物质的含量。
它既具有化学发光的灵敏度,又有根据电位进行分离的高选择性,方法快速、灵敏、重现性好等。
1.5DNA传感器的应用
1.51DNA传感器用于基因检测
DNA传感器可用于基因遗传病的快速诊断,如癌症、帕金森氏综合症、阿尔茨海默氏病等。
目前,利用石英晶体传感器检测β2地中海贫血症患者血清的PCR扩增产物,诊断准确率达100%。
利用DNA传感器在ng/mL水平上直接检测到病源微生物的存在。
将DNA传感器与PCR技术结合,则可以实现更低浓度水平的病源微生物感染的诊断。
不仅操作简单,快速准确,可及时尽早诊断和预防如霍乱、天花、麻疹、SARS等病原微生物。
1.52DNA传感器用于环境监测
DNA传感器监控环境中的病原微生物与用DNA传感器进行疾病诊断的原理相似,即通过固定监测对象的特异性DNA探针,再配合PCR技术,进行杂交信号的检测。
很多环境污染物是基因诱变剂,能与DNA发生作用。
如道诺霉素、联苯和黄曲霉毒素以及工业废水中的1,22二氨基蒽醌、22氨基蒽萘和口丫啶橙等含氨多环芳香族化合物。
污染物对固定化DNA链产生的作用,可引起相应的光、电等信息的改变,根据换能器信息的变化就可对污染物进行检测。
1.53抗癌药物的开发
抗癌药物大都是直接作用于癌变的DNA。
将DNA固定在传感器上,并用该传感器来检测DNA与抗癌药物相互作用产生的信号,为抗癌药物的动力学研究和药理学研究提供了一种新的手段。
[4]
1.6纳米阵列电极的定义和特点
纳米阵列电极是多个纳米电极的集合体。
[5]纳米阵列电极不仅具有单个纳米电极高传质速率、低双电层充电电流、小时间常数、小IR降及高信噪比等优势,而且由于成千上万个单个纳米电极集中在一个基体上,克服了单个纳米电极响应信号过小、易受干扰和难以操作等缺点,能极大地提高测量的灵敏度和可靠性,降低操作难度和测量成本。
[6]
1.7纳米阵列电极的制备方法
现在常用的有模板法、刻蚀法和自组装法等
模板法是选择具有纳米孔径的多孔材料作为模板,在模孔内合成纳米阵列,然后组装成纳米阵列电极。
(采用化学沉积和电化学沉积在滤膜孔中沉积金属,制备纳米阵列电极)
刻蚀法是基于化学腐蚀或光化学反应,对材料进行加工的一种方法。
在纳米阵列电极制备过程中,主要通过对电极覆盖层、阵列模板或电极材料进行加工,从而制备出各种立体形状的电极,是目前制备形状可控的纳米阵列电极较为有效的方法。
自组装法通过非共价键之间的相互作用使纳米粒子聚合在一起,自发地在基底表面形成有序纳米结构薄层的一种方法,是近年来非常活跃的研究方法之一。
在纳米阵列电极制备过程中,自组装层可作为电极反应的活性部分,也可作为惰性覆盖层。
[7]
1.8纳米压印技术
纳米压印技术是华裔科学家美国普林斯顿大学周郁在20世纪1995年首提出的。
目前,这项技术最先进的程度已达到5nm以下的水平。
纳米压印是一种全新的图形复制方法,其基本思想是通过模板将图形转移到相应的存底上,转移的媒介通常是一张很薄的聚合物膜,通过热压或者辐照等方法使其结构硬化从而保留下转移的图形。
其特点是具有超高分辨率、高产量,成本低。
作为一种低成本的下一代光刻技术,纳米压印技术将为纳米制造提供新的机遇,被誉为十大可改变世界的科技之一。
[8]
1.7纳米压印技术的工艺及特点
现在具有代表性的纳米压印技术有:
热压印、紫外光压印、微接触印刷
1.7.1热压印
热压印相对于传统的纳米加工方法,具有方法灵活、成本低廉和生物相容的特点,并且可以得到高分辨率、高深宽比结构。
热压印的缺点是需要高温、高压,且即使在高温、高压下很长时间,对于有的图案,仍然只能导致聚合物的不完全位移,即不能完全填充印章的腔体。
[9]
1.7.1.1热压印的工艺过程
(1)聚合物被加热到它的玻璃化温度以上;
(2)施加压力。
聚合物被图案化的模具所压;
(3)模压过程结束后,整个叠层被冷却到聚合物玻璃化温度以下,以使图案固化;
(4)脱模;
(5)图案转移,利用刻蚀技术或剥离技术进行图案转移。
1.7.2紫外压印
紫外固化纳米压印技术与热压印技术相比不需要加热,可在常温下进行,避免了热膨胀因素,也缩短了压印的时间;掩模板透明,易于实现层与层之间对准,层与层之间的对准精度可达到50nm,适合半导体产业的要求。
但紫外固化纳米压印技术设备昂贵,对工艺和环境的要求也非常高;没有加热的过程,光刻胶中的气泡难以排出,会对细微结构造成缺陷。
[10]
1.7.2.1紫外压印的工艺过程
1.采用石英SiO2等作为掩模板材料;
2.在Si等衬底材料上涂覆一层厚度为400~500nm的低粘度、流动性好、对紫外光敏感的光刻胶;
3.低压将模板压在光刻胶上,使光刻胶填充模板空隙;充分填充后利用紫外光照射模板背面,使光刻胶化;
4.脱模后利用等离子体刻蚀技术将残留胶除。
[11]
1.7.3微接触印刷
微接触印刷不但具有快速、廉价的优点,而且它还不需要洁净间的苛刻条件,甚至不需要绝对平整的表面。
微接触印刷还适合多种不同表面,具有操作方法灵活多变的特点。
该方法缺点是在亚微米尺度,印刷时硫醇分子的扩散将影响对比度,并使印出的图形变宽。
通过优化浸墨方式、浸墨时间,尤其是控制好印章上墨量及分布,可以使扩散效应下降。
[12]
1.7.3.1微接触印刷的工艺过程
1.使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)等高分子聚合物作为掩模制作材料,采用光学或电子束光刻技术制备掩模板;
2.将掩模板浸泡在含硫醇的试剂中,在模板上形成一层硫醇膜;
3.再将PDMS模板压在镀金的衬底上10~20s后移开,硫醇会与金反应生成自组装的单分子层SAM,将图形由模板转移到衬底上。
[13]
1.8纳米压印应用
微纳米压印技术作为一门新颖而实用性很强的应用技术,发展非常迅速。
其在纳米电子器件、纳米光学元件、纳米生物传感器及其他具有纳米结构的功能图形制作方面,将显示出其独特的技术优势。
它能广泛采用各种高分子有机材料制造微米至纳米尺寸的器件,可以达到分辨率小于10mm的水平,无疑将为IT与微电子产业、生物与生命科学、环境与新能源技术等领域的加速发展带来重大的影响,成为未来主流芯片、显微镜头、微生物传感器、能源转化器以及微射流原器件的生产方式。
另外在制造高密度磁性记录器件方面也有很大的潜力。
[14]
2实验材料和仪器
2.1实验仪器
(1)紫外曝光机
图2.1紫外曝光机
本实验采用的是传统紫外光刻机,如图2.3所示,它是自带的紫外光源,波长为365nm。
该光刻机使用汞灯发光,谱能量在可见和紫外区,主要集中在几个狭窄的谱带,如313.2nm、334.1nm、365/366.3nm、404.7nm、434.8/435.8nm、540.1nm、577nm等;其中在波长为365-366.3nm的能量辐射最强,是一种很好的紫外光源。
其能量分布如图所示:
图2.2紫外光源能量分布
(2)反应离子刻蚀机(RIE)
图2.3反应离子刻蚀机
反应离子刻蚀过程是一个非常复杂的物理和化学过程,一般是反应离子刻蚀机通过交变的电磁场在有反应气体的腔室内激发等离子体,通过等离子体中的气体离子和化学活性的自由基与材料表面的化学反应和离子轰击材料表面的物理过程刻蚀材料。
本实验中采用的反应离子刻蚀机如图2.5所示,有多种可调控的参数,如气体流量、放电空间气压、放电功率、放电室腔壁与电极材料等。
主机主要有以下几部分构成:
反应腔室、基极电极、真空系统、供气系统、等离子源、射频电源、预真空室。
反应腔室:
由整块铝锭制造,无焊缝结构,内径为300毫米。
基极电极:
基极电极带有加热和冷却装置
真空系统:
机械泵作为前级泵串联一台涡轮分子泵,使用时,先打开机械泵进行预抽,大概到达200Pa左右时打开涡轮分子泵抽气至1Pa.
供气系统:
气体控制面板有4个气路组成,每个气路都由质量流量控制器控制。
实验中只用了一个气路,因为刻蚀材料是聚合物,所以刻蚀气体选择的是氧气。
射频电源偏压发生器功率:
13.56MHz。
感应耦合等离子(ICP)发生器
功率:
13.56MHz具有分布式控制系统,每个反应腔都具有独立的控制软件和硬件,能对全部组件进行实时监控。
刻蚀时间可以预设定,自动控制刻蚀时间。
实验中用反应离子刻蚀机对光刻胶进行表面改性,增强它的表面能,使键合能在比较低的温度下进行。
反应离子刻蚀机操作步骤:
a电源通电,打开冷却水阀门
b真空室充气,打开真空室并放置样品
c关真空室,开机械泵。
当热偶真空机显示真空度达到几十帕时,开高速泵。
d等热偶真空计显示真空度达到0.5帕时,开阀3、总阀,并将氧气罐打开。
e调阀3气流流量,稳定到30
/s,设定离子轰击时间,并打开轰击开关,开始灰化。
结束后,按顺序关闭阀3、总阀、氧气罐,并将时间设定为零。
充气,取样品。
(3)电热恒温鼓风干燥箱
图2.4电热恒温鼓风干燥箱
电热恒温鼓风干燥箱具有设定,测定温度,时间双目数字显示,采用数显智能仪表控制,按键设定,自动控制恒温,操作简单,配置时间控制器及报警系统。
采用热风循环系统由能在高温下连续运转风机和合理风道组成,工作室内温度均匀。
在实验中一般用来烘烤基片
(4)甩胶机
图2.5甩胶机
本匀胶机有两个转速,如图2.7所示。
在启动之后,先以低转速运转,使胶摊开,然后自动变动到高转速运转。
两种转速及相应的时间分别可调。
高转速决定各种胶的厚度。
本实验中匀胶机分两档转速,I档调速范围:
1-1000转/分,匀胶时间:
1-18秒;II档调速范围:
1000-10000转/分,匀胶时间:
1-60秒。
(5)热台
图2.6热台
实验室采用的热台如图2.6所示,热台可以实现快速达到所需温度的功能,大量节省时间,具有LED数显温度值,可以用来显示温度。
它的温度控制精度高,热稳定性好,便于在台上进行操作,实验中的主要部分热键合的过程就是在热台上进行的。
(6)光学显微镜
实验中采用的是NIKON显微镜,如图2.7所示,放大的功率为:
5X,10X,50X,100X。
图2.7显微镜
(7)台阶仪
图2.8台阶仪
本实验中所用的是AMBOIS公司生产的XP-1型台阶仪,如图2.8所示。
可以精确测量纳米级至几百微米级台阶高度。
其工作原理如图2.9所示。
当探针在样品上进行接触式扫描时,由于样品表面的高低起伏从而使得探针随着样品表面也做高低起伏。
由于探针的高低起伏就带动了蓝宝石轴承的倾斜度发生变化,从而使镜面倾斜度随着时刻发生变化,致使激光反射到光电池上的光斑位置时刻发生变化,变化的光斑位置产生的电信信号,通过对电信号的转换就会得到样品表面的高低形貌。
图2.9台阶仪工作原理图
本课题所用台阶仪的参数为:
样品台直径(SampleStageDiameter):
170mm;
扫描长度(ScanLengthRange):
0.05-20mm;扫描速度(ScanSpeedRange):
0.01-2mm/s;样品最大厚度(SampleThickness):
20mmmaximum;水平分辨率(LateralResolution):
500nm等。
除了精密台阶的测量,它也可以表征表面形状,测量表面的组织和粗糙度。
(8)扫描电子显微镜
图2.10电子显微镜
扫描电子显微镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具,如图2.12所示,主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态,即用极狭窄的电子束去扫描样品,通过电子束与样品的相互作用产生各种效应,其中主要是样品的二次电子发射。
二次电子能够产生样品表面放大的形貌像,这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的,即使用逐点成像的方法获得放大像。
扫描电子显微镜的制造是依据电子与物质的相互作用。
当一束高能的入射电子轰击物质表面时,被激发的区域将产生二次电子、俄歇电子、特征X射线和连续谱X射线、背散射电子、透射电子,以及在可见、紫外、红外光区域产生的电磁辐射。
同时,也可产生电子-空穴对、晶格振动(声子)、电子振荡(等离子体)。
原则上讲,利用电子和物质的相互作用,可以获取被测样品本身的各种物理、化学性质的信息,如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电场或磁场等等。
扫描电子显微镜由三大部分组成:
真空系统,电子束系统以及成像系统。
(9)洁净台
图2.11洁净台
洁净台是对硅片,玻璃片进行初级清洁
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