两种特异性引物聚合酶链反应乙型肝炎病毒基因分型法的.docx
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两种特异性引物聚合酶链反应乙型肝炎病毒基因分型法的
两种型特异性引物聚合酶链反应法检测乙型肝炎病毒基因型及亚型的评价
金晖王杰闫玲李卓聂晶晶李杰庄辉
北京大学医学部病原生物学系
【摘要】目的比较并评价本研究室(新方法)和日本Naito(Naito法)等建立的乙型肝炎病毒(HBV)型特异性引物聚合酶链反应(PCR)基因分型法。
材料和方法分别用新方法和Naito法,检测系列稀释的含有A、D基因型和B1、C2亚型HBV基因组的质粒及不同浓度比例的Bj/C2亚型混合质粒,评价两种方法的灵敏度和特异度。
另外,用两种方法分别对深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市送检的113份HBVDNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因分型,并对两种分型方法检测结果不一致的血清样本用PCR产物直接测序法验证。
结果用含有不同基因型HBV基因组的质粒及不同浓度比例的Bj/C2亚型混合质粒评价两种方法的灵敏度和特异度,结果显示,两种方法的灵敏度无差异,而新方法的特异度明显优于Naito法。
并且经一次巢氏PCR,新方法即可直接检测出C1和C2基因亚型。
两种方法检测单一基因型血清标本的灵敏度无差异,对HBVDNA浓度为102~109拷贝/ml血清标本的检出率均为100%,并可检测出≤5×102拷贝/ml的血清标本。
但新方法对B/C混合型样本的检出率更高。
两种方法检测结果的总符合率为83.2%(94/113),不一致率为16.8%(19/113)。
从19份两法分型不一致的血清标本中,随机选取7份以PCR产物直接测序法进行验证,测序结果与新方法检测结果完全一致。
结论本室建立的HBV型特异性引物-PCR基因分型法具有较高灵敏度,且特异度明显优于目前临床上常用的Naito等建立的方法,适用于大规模的临床样本检测及流行病学调查,对我国HBV基因型及基因亚型的研究提供了新的有力的手段。
两种型特异性引物聚合酶链反应法检测乙型肝炎病毒基因型及亚型的评价
金晖王杰闫玲李卓聂晶晶李杰庄辉
北京大学医学部病原生物学系
根据HBV全基因组核苷酸序列差异≥8%,或S基因序列差异≥4%,将HBV分为9个基因型,分别命名为A~I[1-5]。
目前国内应用最多的HBV基因分型方法是2001年由日本的Naito等[6]建立的型特异性引物-PCR分型方法(以下简称Naito法),但在本研究室长期的实际应用中,我们发现该法的特异度以及对B/C混合型样本的灵敏度有待提高。
因此,有必要建立一种适合检测我国HBV流行株基因型的新的型特异性引物-PCR分型方法。
本室在Naito等A~F基因型分型法和Sugauchi等[7]B1、B2亚型分型法基础上,建立了A~D基因型和B、C基因亚型特异性nPCR分型法[8](以下简称新方法)。
为比较并评价两种方法的灵敏度和特异度,本研究用已带有A、D基因型和B1、C2基因亚型的HBV基因组的质粒,分别评价两种方法的灵敏度和特异度,并分别用两种法对深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市送检的113份HBVDNA阳性的慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因分型,对两种分型方法检测结果不一致的血清样本用PCR产物直接测序法验证。
现将结果报告如下。
材料和方法
新方法引物设计:
引物S4R和BA1R为Naito等[6]设计,HBAS-4V和BJA-RV为Sugauchi等[7]设计。
其余引物为本室用DNAStar软件比较分析150株GenBank中登录的A~H8种基因型HBV全基因组序列,结合我国HBV基因型及亚型的分布特点设计而成[8]。
所有引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成,序列见表1。
表1新方法引物序列表
引物
序列
位置
第一轮扩增
BF
5’-ACGGGGCGCACCTCTCTTTA-3’
1519~1538
HBAS-4V
5’-ATAGGGGCATTTGGTGGTCT-3’
2316~2297
PF
5’-TTATGCCTGCTAGGTTYTATCC-3’
2635~2656
S4R
5’-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3’
434~415
第二轮扩增
MixA
HB
5’-ACCGTGAACGCCCACMGGAA-3’
1617~1636
BJA-RV
5’-TTCTTTATACGGGTCAATGTCCATG-3’
1924~1900
DF
5’-GCAGAATCTTTCCACCAG-3’
2853~2870
C1F
5’-TCACTCCRCCACACGGCAA-3’
3047-3065
C2F
5’-CACCGAACATGGAGARCACA-3’
147~166
PR
5’-TTGGTGAGTGATTGGAGGTTG-3’
341~321
MixB
AF1a
5’-GCCTACTAGATTCTATCCTACCCAC-3’
2645~2669
AF2
5’-GCCTACTAGATTTTATCCTAACAGC-3’
2645~2669
BA1R
5’-CTCGCGGAGATTGACGAGATGT-3’
111~132
MixC
HB
5’-ACCGTGAACGCCCACMGGAA-3’
1617~1636
BA
5’-GTGTCGAGRAGATCTCGAATA-3’
1998~1978
BJ
5’-TGATCTTTAGGCCCATGTTAGT-3’
2192~2171
Y:
C或T,M:
A或C,R:
A或G
aAF1和AF2为简并引物
2.质粒
含B1亚型的基因组质粒由日本传染病研究所Abe教授馈赠;含A基因型和C2亚型的基因组质粒由广州南方医院侯金林教授馈赠[9];含D基因型的基因组质粒由澳大利亚Victorian传染病参比实验室Locarnini教授馈赠[10],均于-20℃保存备用。
3.血清样本:
共计113份慢性乙型肝炎患者血清或HBVDNA标本用于本研究。
其中96份随机选取自本室血清库,均为HBVDNA阳性,其中深圳61份,河北邯郸35份。
另有17份新疆地区少数民族慢性乙型肝炎患者HBVDNA标本由北京佑安医院李卓提供。
所有标本于-20℃保存备用。
4.DNA提取和扩增
使用RNAgents®TotalRNAIsolationSystem核酸提取试剂盒(购自Promega公司),从50l血清中提取病毒DNA,沉淀物溶于20l灭菌双蒸水中。
新方法第一轮PCR扩增体系为:
10×Buffer(Mg2+15mM)2l,dNTPs(10mM)0.4l,BF(10M)1l,HBAS-4V(10M)1l,PF(10M)0.6l,S4R(10M)0.6l,TaqDNA聚合酶1.5U(购自广州东盛生物科技有限公司),HBVDNA5l,灭菌双蒸水9.1l,共20l。
循环参数:
95℃预变性10min;95℃30s,58℃30s;72℃1min,扩增40个循环;72℃,7min。
第二轮PCR扩增体系MixA为:
10×Buffer(Mg2+15mM)2l,dNTPs(10mM)0.4l,HB(10M)0.6l,BJA-RV(10M)0.6l,DF(10M)0.6l,C1F(10M)0.6l,C2F(10M)0.6l,PR(10M)0.6l,TaqDNA聚合酶1.0U,第一轮扩增产物1l,灭菌双蒸水12.8l,共20l;MixB为:
10×Buffer(Mg2+15mM)2l,dNTPs(10mM)0.4l,A1F(10M)0.6l,A2F(10M)0.6l,BA1R(10M)0.6l,TaqDNA聚合酶1.0U,第一轮扩增产物1l,灭菌双蒸水14.6l,共20l;MixC为:
10×Buffer(Mg2+15mM)2l,dNTPs(10mM)0.4l,HB(10M)0.6l,BA(10M)0.6l,BJ(10M)0.6l,TaqDNA聚合酶1.0U,第一轮扩增产物1l,灭菌双蒸水14.6l,共20l。
循环参数同第一轮扩增。
Natio方法扩增体系和循环参数参考文献[6]进行。
第一轮PCR扩增体系为:
10×Buffer(Mg2+15mM)2l,dNTPs(10mM)0.4l,P1(10M)0.6l,S1-2(10M)0.6l,TaqDNA聚合酶1U(购自广州东盛生物科技有限公司),HBVDNA5l,灭菌双蒸水11.2l,共20l。
循环参数:
95℃预变性10min;95℃20s,55℃20s;72℃1min,扩增40个循环;72℃,7min。
第二轮PCR扩增体系分两个Mix,MixA为:
10×Buffer(Mg2+15mM)2l,dNTPs(10mM)0.4l,B2(10M)0.6l,BA1R(10M)0.6l,BB1R(10M)0.6l,BC1R(10M)0.6l,TaqDNA聚合酶1.0U,第一轮扩增产物1l,灭菌双蒸水14l,共20l;MixB为10×Buffer(Mg2+15mM)2l,dNTPs(10mM)0.4l,B2R(10M)0.6l,BD1(10M)0.6l,BE1(10M)0.6l,BF1(10M)0.6l,TaqDNA聚合酶1.0U,第一轮扩增产物1l,灭菌双蒸水14l,共20l;循环参数:
95℃预变性10min;95℃20s,58℃20s;72℃30s,扩增20个循环;95℃20s,60℃20s;72℃30s,扩增20个循环;72℃,7min。
5.HBVDNA定量检测
HBV核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司,采用Bio-Rad公司的iCycler荧光定量PCR仪进行HBVDNA定量检测。
6.两种方法的灵敏度比较
6.1用含A、D基因型和B1亚型基因组的质粒进行系列稀释,分别检测两种方法对相关基因型的灵敏度。
并将含B1亚型基因组的质粒与含C2亚型基因组的质粒分别按以下浓度混合(表2),模拟B/C混合型样本,以评价两种方法对B/C混合型样本的检测灵敏度。
表2含B1亚型的基因组质粒与含C2亚型的基因组质粒不同混合浓度
标本号
1
2
3
4
5
6
7
8
B1:
C2浓度(拷贝/ml)
104:
108
105:
108
108:
108
108:
107
108:
106
108:
105
108:
104
108:
103
B1:
C2浓度比例
1:
10000
1:
1000
1:
1
10:
1
100:
1
1000:
1
10000:
1
100000:
1
6.2评价两种方法对临床血清标本的灵敏度。
随机选取68份HBVDNA浓度为102~109拷贝/ml血清标本(其中深圳市52份,邯郸市16份),分别用两种方法检测血清标本中HBV基因型及基因亚型。
新疆地区17份标本因无原始血清,未能做DNA定量。
7.两种方法的特异度比较
7.1分别用两种方法的单套型特异性及亚型特异性引物(即HB/BJA-RV、C1F/C2F/PR、DF/PR、AF1/AF2/BA1R、HB/BA、HB/BJ、B2/BA1R、B2/BB2R、B2/BC1R、B2R/BD1)对含A、D基因型和B1、C2基因亚型的质粒以及经X区和PerC/C区测序证实为B2亚型的血清样本和经PreS区测序证实为C1亚型的血清样本进行检测,以评价两种方法的单套型特异性引物对各型样本的特异度。
7.2用Natio方法的引物MixA:
B2/BA1R/BB1R/BC1R和MixB:
B2R/BD1/BE1/BF1对不同浓度(108-103拷贝/ml)的含D基因型的质粒进行检测,并用引物B2R/BE1对浓度为107拷贝/ml的含D基因型的质粒进行检测,以评价Natio方法对D型样本的特异度。
7.3DNA测序
因为核酸测序是HBV基因型检测的金标准,所以随机选取两种方法分型结果不一致的标本进行核酸测序验证。
对D基因型的样本,用测序引物SF[6]和PR3进行第二轮PreS区的扩增后,将纯化后的扩增产物直接测序;用B亚型分型引物HB、BA和BJ进行第二轮部分X区和PreC/C区的扩增后,将纯化后的扩增产物直接测序,进行B基因亚型的鉴定;对混合型样本分别用各基因型和亚型特异性引物进行第二轮扩增(由于C2亚型的扩增片段较短,不足以进行测序分析,因此,采用具有C2亚型特异性的引物C2F和下游通用引物PR3进行第二轮PreS区和S区的扩增后,将纯化后的扩增产物直接测序)。
PCR产物经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)纯化,测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
SF和PR3引物的序列如下:
SF(正义链):
5’tcaccatatacatgggaacaaga3’(nt:
2817~2839);PR3(反义链):
5’catagcagcaggatgaagagga3’(nt:
423~402)。
其余引物见表一。
7.4测序结果的计算机分析
首先用NCBI中的病毒基因分型系统(登录http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)对测序结果进行初步的基因分型,然后用MEGA4.0软件构建进化树(Neighbourjoining法)进行基因型和亚型的分析,同时作Bootstrap(1000replicates)分析,以确定所建进化树的可靠性。
结果
1.两种方法的灵敏度比较
1.1对系列稀释的质粒检测灵敏度比较
将A、B1和D质粒进行倍比稀释(108~102拷贝/ml),然后用两种方法分别对其进行检测。
结果显示,两种方法均可分别检测到103拷贝/ml的A、B1和D质粒。
1.2对B1质粒和C2质粒混合样本检测结果比较
如图1所示,1~8道为新方法对不同浓度比例的B/C混合型样本的检测结果,9~16道为Natio方法对不同浓度比例的B/C混合型样本的检测结果(B/C混合型浓度表见表2)。
2~6道的B1:
C2质粒浓度比例在1:
1000~1000:
1之间,说明在B/C混合型样本中,只要B型或C型浓度所占比例在1‰以上,就能被新方法检测到;而如第12道所示,当B1:
C2浓度比为10:
1时,Natio方法对C型的检出效率就明显下降,而如第13道所示,B1:
C2浓度比为100:
1时,Naito方法就完全检测不到C型的存在了。
提示在模拟B/C混合型样本的检测中,新方法对B/C混合型样本检测的灵敏度优于Natio方法。
另外,如第1道和第9道所示,当B1:
C2浓度比为1:
10000时,新方法检测结果提示该样本中的优势毒株为C2亚型,只有少量的B型;而Naito方法检测结果仍为B/C混合型,无法提示样本中优势毒株的基因型。
图1不同浓度B1和C2质粒混合物检测效果示意图
注:
1~8道为新方法的扩增产物,样本分别为不同比例的B1:
C2质粒混合物;9~16道为Natio方法的扩增产物,样本分别为不同比例的B1:
C2质粒混合物。
B1和C2质粒的配比见表2。
1.3对临床血清样本检测的灵敏度比较
随机选取68份完成HBVDNA定量的血清样本,分别用两种方法检测其基因型,结果如表3所示,两种方法均可检测HBVDNA浓度范围为102~109拷贝/ml(其中2份<5×102拷贝/ml)的血清样本。
两种方法均具有较高的灵敏度。
2.两种方法的特异度比较
2.1两种方法的单套引物的特异度比较
我们已经证实新方法对各型样本的特异度都很好[8],在本文中我们又分别用两种方法的单套型特异性引物,即新方法的HB/BJA-RV、C1F/C2F/PR、DF/PR、AF1/AF2/BA1R、HB/BA、HB/BJ和Naito方法的B2/BA1R、B2/BB1R、B2/BC1R、B2R/BD1来分别检测含A、D基因型和B1、C2基因亚型的质粒以及经X区和PerC/C区测序证实为B2亚型的血清样本和经PreS区测序证实为C1亚型的血清样本,结果再次证实新方法的各套单引物均具有较高特异度,即各特异性引物只能扩增出其对应的基因型或者亚型的样本。
而对于Natio方法,B2/BA1R能扩增出A、B1、B2、C1、C2型的样本;B2/BB1R能扩增出A、B1、B2、C1、C2、D型的样本;B2/BC1R能扩增出A、C1、C2、D型的样本;B2R/BD1能扩增出A、D型的样本,单引物的特异度不足。
2.2Natio方法对含D基因型的质粒的特异度评价
用Naito方法的引物MixA:
B2/BA1R/BB1R/BC1R对不同浓度(108~103拷贝/ml)的含D基因型的质粒进行检测,发现检测结果均为B/C混合型(如图2(a))。
如图2(b)所示,用Naito方法的引物MixB:
B2R/BD1/BE1/BF1对不同浓度(107~103拷贝/ml)的含D基因型的质粒进行检测,发现当D型质粒浓度为103拷贝/ml时,检测结果为D型;当D型质粒浓度为106~104拷贝/ml时,检测结果为D/E混合型;当D型质粒浓度为107拷贝/ml或更高时,检测结果为E型。
用引物B2R/BE1对浓度为107拷贝/ml的的含D基因型的质粒进行检测,结果也为E型。
提示Naito方法对HBVD基因型样本的特异度有待提高,当检测含D基因型的样本时,会误判为B/C/D混合型或者B/C/D/E混合型。
(a)
(b)
图2Naito方法对D型质粒的扩增产物电泳图
注:
(a)为Naito方法的引物MixA:
B2/BA1R/BB1R/BC1R对含D基因型的质粒的检测结果,1道~6道分别为108~103拷贝/ml的D型质粒的检测结果,7道为阴性对照。
(b)为Naito方法的引物MixA:
B2R/BD1/BE1/BF1及引物B2R/BE1对含D基因型的质粒的检测结果,1道为引物B2R/BE1对107拷贝/ml的D型质粒的检测结果,2道~6道分别为107~103拷贝/ml的D型质粒的检测结果,7道为阴性对照。
2.3对113份血清或HBVDNA样本的检测及测序验证结果
分别用两种方法对来自深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市的113份血清或HBVDNA样本进行检测,两种方法检测结果的总符合率为83.2%(94/113),不一致率为16.8%(19/113),检测结果见表3:
表3两种方法对113份样本的检测结果
结果一致(共94例,83.2%)
检测结果不一致(共19例,16.8%)
单型别(89/94,94.7%)
混合型
(5/94,5.3%)
单型别(9/19,47.4%)
混合型(10/19,52.6%)
B
(21/94)
22.3%
C
(61/94)
64.9%
D
(7/94)
7.4%
B/C
(4/94)
4.3%
B/C/D
(1/94)
1.1%
D
(9/19)
47.4%
B/C
(6/19)
31.6%
C/D
(3/19)
15.8%
B/C/D
(1/19)
5.3%
新方法
B*
C1
C2
D
B/C2
B/C1/D
D#
D#
D#
D#
B/C2#
B/C2#
C2/D
C2/D
B/C2/D
Natio方法
B
C
C
D
B/C
B/C/D
B
B/C/D
B/C/D/E
B/D/E
B
C
B/C/D
B/C/D/E
B/D
例数
21
8
53
7
4
1
1
6
1
1
5
1
2
1
1
注:
#部分样本进行了PCR产物直接测序验证,结果与新方法一致;
*新方法检测的B基因型毒株全部为Ba基因亚型。
在两种方法检测结果不一致的样本中随机选取7份样本,其中4份新方法鉴定为D,而Natio法鉴定结果分别为B型、B/C/D混合型、B/C/D/E混合型及B/D/E混合型;3份新方法鉴定为B/C2混合型,而Natio法鉴定结果分别为B型(2份)和C型(1份)。
对这7份样本以PCR产物直接测序法进行验证,与新方法分型结果一致。
图3应用PreS区核苷酸序列进化树分析HBV基因型和亚型
注:
本研究共7份测序标本,但其中3株为B2和C2混合型,因此,图内所示为10份,其他为参比株。
讨论
本研究通过检测含HBVA、D基因型和B1、C2基因亚型的质粒,以及113例来自深圳、邯郸、新疆地区的血清样本,对两种不同的型特异性引物PCR分型法进行了评价,结果证明我室建立的新方法灵敏度与Naito方法一致,而特异度显著优于Natio方法。
另外,我们的引物设计考虑到我国HBV基因型的分布特点,即目前我国大部分地区的优势基因型主要是B型和C型,新疆等地的少数民族人群中为D型,本着经济适用的原则,把检测B型、C1、C2亚型及D型的引物放入一个试管中检测,这样仅通过两轮PCR反应就能检测出我国绝大部分样本的基因型,且能同时分出C1和C2亚型;对于B1亚型流行的日本地区,可用我室的新方法鉴定为B型后,再以第一轮PCR产物为模板,用引物HB/BA/BJ鉴定B亚型。
对于A型流行的地中海地区,可用我室的新方法做第一轮PCR扩增后,再分别用HB/BJA-RV/DF/C1F/C2F/PR和AF1/AF2/BA1R两套引物做第二轮PCR扩增。
因此,新方法不仅适合于对国内的样本进行大批量的流行病学筛查,也适合对日本、西亚等地区做初步的流行病学筛查。
两种方法的不同检测结果导致了深圳和新疆的基因型/亚型的分布出现较大偏差(详见表4)。
深圳地区混合型样本用新方法检测比用Natio法检测结果高8.2%,是由于Naito法对B/C混合型中C型检测灵敏度不高,所以对B/C混合型的样本,可能会误判为B基因型,因此Naito法检测深圳地区结果B基因型比例较高,而混合型比例较低。
用新方法对新疆地区的样本的筛查表明,新疆地区尤其是少数民族居民的D基因型比例可能大大高于以往的报道,本研究在17例新疆样本中检测到15例D型,占88.2%,推测新疆地区可能是以D基因型为优势基因型。
而Naito法检测结果D型比例只有41.2%,明显低于新方法检测结果,提示Naito方法对HBVD基因型样本的特异度有待提高,当检测含D基因型的样本时,会误判为B/C/D混合型或者B/C/D/E混合型。
邯郸地区由于基因型/亚型分布较单一(绝大部分为C2亚型),两种方法的检测结果未有较大差异。
本研究提示曾经用Nai
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