牛血清中青霉素类药物残留的ELISA法检测1.docx
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牛血清中青霉素类药物残留的ELISA法检测1
牛血清中青霉素类药物残留的ELISA法检测
毕业论文
论文(设计)题目:
牛血清中青霉素类药物残留的ELISA法检测
专业:
生化药学专业
年级、班级:
学生姓名:
张超
指导老师:
牛血清中青霉素类药物残留的ELISA法检测
摘要
青霉素有被称作为盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。
,是抗菌素的其中一种。
属于β-内酰胺类抗生素。
是一种非常常用的抗菌药品。
但是在每一次使用前都需要通过皮试,防止发生过敏反应。
过敏反应的发生率最高可达5%~10%,为皮肤反应,表现皮疹、血管性水肿,最严重者为过敏性休克,多在注射后数分钟内发生,症状为呼吸困难、发绀、血压下降、昏迷、肢体强直,最后惊厥,抢救不及时可造成死亡。
青霉素类抗生素的毒性一般是很小的,由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁,而人类的细胞只有细胞膜,不存在细胞壁,因此对人类的毒性较小,除了可能会引起严重的过敏反应之外,在一般用量下,它的毒性是不太明显的。
由于毒性小,见效高的特点使得青霉素在生活中得到了广泛的应用,尤其是在兽医临床中所用较多。
一般情况下当家畜生病时,大多会给予青霉素进行治疗,虽然其本身的毒性比较小,但是会引起药物过敏的反应。
在用量上如果不严格把关。
会使得动物由于过敏性休克而死亡。
但是如果长期不间断的使用低浓度的青霉素类药物,会使细菌对这类药物产生抗药性,久而久之会失去效果。
近年来发现,青霉素在动物体内的残留越来越严重,人体长时间的食用肉质,长此以往的摄入低浓度的青霉素类药物,会使得人体免疫力下降,对青霉素的使用不再起到消灭细菌的作用。
因此加强对动物源性食物的检测,建立较好的方法来对动物体内青霉素类药物残留情况的检测,有利于保障食品安全,保护消费者的健康。
本研究就对青霉素类药物的人工抗原的合成,动物免疫以及ELISA检测的方法建立等进行了研究。
关键词:
青霉素,药物残留,ELISA法检测
Abstract
Penicillinisknownaspenicillin,penicillin,penicillin,penicillin,penicillinpotassium.It'soneofantibiotics.Belongstobetalactamantibiotics.Itisaverycommonantibacterialdrug.However,skintestsarerequiredbeforeeachusetopreventallergicreactions.Theincidencerateofupto5%~10%forallergicreactions,skinreactions,skinrash,manifestationsofangioedema,mostsevereallergicshock,severalminutesaftertheinjectionoccurred,symptomsofdyspnea,cyanosis,hypotension,coma,limbrigidity,finalconvulsion,nottimelyrescuecancausedeath.Penicillintoxicityisgenerallyverysmall,becausethecellwallbetalactameffectonbacteriaandhumancells,onlythecellmembrane,thecellwalldoesnotexist,sotoxictohumansissmall,butmaycausesevereallergicreactions,ingeneraluse,itistoxicnottooobvious.Becauseofitslowtoxicityandhighefficiency,penicillinhasbeenwidelyusedindailylife,especiallyinveterinaryclinicalpractice.Undergeneralcircumstances,mostoftheanimalswillbegivenpenicillintreatment,althoughitsowntoxicityisrelativelysmall,butitwillcauseallergicreactionstodrugs.Iftheamountisnotstrictlychecked.Itcausesanimalstodieofanaphylacticshock.Butiflong-termuseoflowconcentrationsofpenicillindrugs,bacteriawillberesistanttosuchdrugs,andwillloseefficacyinthelongrun.Inrecentyears,penicillinresiduesinanimalbodyismoreandmoreserious,thebodyforalongtimetoeatmeat,ifthingsgoonlikethisintakeofpenicillindrugsoflowconcentration,willleadtodecreasedimmunity,theuseofpenicillintodestroybacterianolonger.
Therefore,tostrengthenthedetectionofanimalderivedfood,establishabettermethodtodetectpenicillinresiduesinanimals,isconducivetotheprotectionoffoodsafety,andprotectthehealthofconsumers.Inthisstudy,thesynthesisofartificialantigensofpenicillin,animalimmunityandtheestablishmentofELISAdetectionmethodswerestudied.
KeyWords:
penicillin,drugresidues,ELISAdetection
引言
青霉素属于抗菌素的一种,是指分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素,是由青霉菌中提炼出的抗生素。
由于毒性较低的缘故,被广泛的应用在医学中。
现如今发现,因为青霉素类药物在兽医临床中的大量使用,使得许多肉质类食品中出现了大量药物残留的情况。
虽然毒性较轻,但是依然会对由过敏性体质的人群产生危害。
这类有药物残留的肉类食品流入市场,不仅会对消费者的健康产生威胁,也对肉类食品加工企业带来损失。
因此,通过一些方法来检测动物源性食品中青霉素类药物的残留情况,可以更好的监控食品的卫生健康。
(一)、青霉素类药物简介
青霉素于1928年英国细菌学家弗莱明首次发现。
青霉素类药物属于抗生素的一种,包括了天然青霉素、耐酶青霉素、广谱青霉素等。
因为它的结构中有β-内酰胺环,所以又被称作为β-内酰胺类抗生素。
青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。
青霉素类药物的分类有很多种,它包括了:
青霉素G类、青霉素V类、耐酶青霉素、广谱青霉素、抗绿脓杆菌的广谱青霉素、氮咪青霉素等。
各种青霉素的制备方法也有所不同。
青霉素G生产可分为菌种发酵和提取精制两个步骤;各种类型的半合成青霉素则是采用以6APA为中间体与多种化学合成有机酸进行酰化反应;以及青霉素浓缩法。
(二)、药理药动耐药性
青霉素药理作用是干扰细菌细胞壁的合成。
青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似,可与后者竞争转肽酶,阻碍粘肽的形成,造成细胞壁的缺损,使细菌失去细胞壁的渗透屏障,对细菌起到杀灭作用。
青霉素对溶血性链球菌、草绿色链球菌、肺炎球菌等作用强,肠球菌敏感性较差。
不产生青霉素酶的金葡菌及多数表葡菌对青霉素敏感,但产生青霉素酶的金葡菌对之高度耐药。
革兰阳性杆菌,白喉杆菌、炭疽杆菌及革兰阳性厌氧杆菌如产气荚膜杆菌、破伤风杆菌、难辨梭菌、丙酸杆菌、真杆菌、乳酸杆菌等皆对青霉素敏感。
革兰阴性菌中脑膜炎球菌对青霉素高度敏感,耐药者罕见。
对青霉素敏感的淋球菌日益少见。
百日咳杆菌对青霉素敏感。
致病螺旋体,如梅毒螺旋体、钩端螺旋体对之高度敏感。
青霉素不耐酸,口服很难被吸收,不适用于口服。
通常采用肌内注的方式,注射之后,大概30分钟就会达到血药浓度高峰,吸收后广泛分布于组织、体液中,易透入有炎症的组织,胸、腹腔和关节腔液中浓度约为血清浓度的50%。
本品可通过胎盘,但很难透过血.脑脊液屏障,乳汁中可含有少量青霉素,不易透入眼、骨组织、无血供区域和脓腔中。
本品约19%在肝内代谢,70%则通过肾小管分泌排泄,肾功能正常情况下,约75%的给药量于6小时内自肾脏排出,通过胆汁排泄的并不多。
细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制还是β-内酰胺酶。
β-内酰胺类抗生素药物在β-内酰胺酶的作用下水解开环。
β-内酰胺环是与PBPS结合的活性功能部位。
它的存在阻碍了干扰细胞壁合成的功能。
细胞壁的主要成分是有肽聚糖组成的,PBPS与细胞壁的合成、肽聚糖结构的调节有着密切的联系,通过对PBPS的改变,就会使得β-内酰胺类抗生素的药物活性大大降低。
(三)国内外检测抗生素残留的研究现状
我国是抗生素的生产大国,也是使用量非常多的国家,大约70%的用药都是抗生素。
所谓抗生素指的就是由细菌、霉菌或其他微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类物质。
抗生素最大的作用是消灭细菌,对霉菌、支原体、衣原体等其他致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用。
因此在临床医学中的应用非常的广泛。
然而抗生素残留却对身体健康有着严重的危害。
据统计,我国目前每年有大约6000吨的抗生素被掺入动物食用的饲料中,大约有35%的抗生素被动物机体吸收,残留在动物体内,这就造成了动物源性食物对人体的严重危害。
抗生素虽然有杀菌的作用,但是抗生素残留会对人的身体造成致癌、致畸、致突变的危害。
因此,许多国家建立了严格的标准来把控食物中的抗生素残留,建立一系列检测抗生素残留的方法变得极为紧迫和重要。
我国目前颁布了一系列严格的法律法规来限定抗生素的使用。
2004年卫生部就颁布了《抗菌药物临床应用指导原则》,2018年《抗菌药物临床应用管理办法》落实实施,被称作史上最严的限抗令。
同时,我国制定了96种最高残留限量的兽药,有67种化合物被禁止使用。
在《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定了145中药物残留的检测方法,其中包含了14项的水产品中兽药残留检测标准。
抗生素即便是在国外很早就被引起重视的发达国家也应用广泛。
在日本最主要的抗生素是头孢类药物,美国虽然是世界上药政管理最为严格的国家,环丙沙星这类抗生素的使用量依然高居不下。
面对这类现象,美国疾控中心加大了对抗生素的临床研究和管理。
如今世界各国都开始加强多抗生素残留的检测,常用的方法有:
1.微生物检测
微生物检测由于不需要使用特殊的仪器所以是一种比较快速的检测方法。
此方法的判断原理是通过细菌对不同种类的抗生素所产生的抑菌圈的大小情况来判断抗生素使用量是否超标。
经常被用作初级筛选阶段的检测方法
2.试剂盒检测法
由于会出现假阳性的现象,因此这种方法只能作为一种筛查手段使用。
其特点是不需要使用大型的仪器,所以筛选成本较低。
工作原理是合成抗原,筛选抗体。
3.仪器检测法
仪器检测法是针对不同种类的抗生素采取不同的仪器来对其进行检测的方法。
其特点是可以做到定量、定性。
只要涉及的仪器有HPLC、GC、LC-MS/MS、GC-MS等等。
4.HPLC与LC-MS/MS
此类检测方法在国内最为普遍使用,具有灵敏度高、检测限低、方法稳定的特点。
它将液相色谱对复杂基体化合物的高分离能力和质谱独特的选择性、灵敏性、相对分子质量以及结构信息结合为一体。
被广泛应用于食物药物残留的检测中。
(四)人工抗原和单克隆抗体的研究现状、立题依据与研究内容
用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原,称之为人工抗原。
它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。
无论对免疫学理论研究和分子疫苗的制备都具有重要意义。
1.人工结合抗原
人工结合抗原包括了;将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联,或将无免疫原性的有机分子如二硝基苯(DNP)或三硝基苯(TNP)与蛋白质载体结合,形成载体-半抗原结合物。
2.人工合成抗原
用化学方法将活化氨基酸聚合,使之成为合成多肽,只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽,如由左旋赖氨酸形成的共同聚多肽(PLL)。
由二种或二种以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽,如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和赖氨酸组成的聚合成多肽(T、G)-AL。
应用这种人工合成多肽可研究氨基酸种类、序列与蛋白质抗原性及免疫原性的关系,也可研究机体遗传性与免疫性的关系。
3.基因重组抗原
将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体(如细菌粒或病毒)DNA分子相结合,然后引入受体细胞中(如原核细胞的大肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞)使之表达,即能获得免疫原性之融合蛋白,经纯化后可做为疫苗,此即基因工程疫苗。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。
通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群,可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程:
1.免疫动物
取5周龄与骨髓瘤细胞同种系的Bal/c小鼠,以含蛋白质200μg/500μL的抗原与等量福氏完全佐剂充分乳化,注入小鼠腹腔内,间隔3周用福氏不完全佐剂乳化抗原,采用皮下多点注射。
第二次免疫后一周,尾静脉采血,检测抗体效价。
2.细胞融合
采用二氧化碳气体处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。
3.选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基。
在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增。
经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存。
5.单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
将0.5毫升的石蜡注入实验鼠腹腔。
随后将5×106个杂交瘤细胞注入实验鼠腹腔。
八天后可观察,实验鼠腹部出现膨胀,将实验鼠腹部进行消毒,用无菌针头注射其腹部,用试管接住滴下的腹水,晃动针头,令腹水持续滴下。
三天后,重复上述步骤收集新形成的腹水。
最后将收集好的腹水进行离心10min(1000r/min),取上清液,加入0.02%叠氮钠,在-20℃下存储。
二、人工抗原的合成与鉴定
人工抗原常合成的常用载体有:
牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、人工合成的多聚赖氨酸等载体蛋白。
这些载体的特点:
具有化学活性基因,具备一定的容量,可以偶联足够的分子,具有惰性,不干扰偶联分子的功能,具有足够的稳定性,并且廉价易得。
蛋白偶联的方法:
通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸的条件下进行。
影响人工抗原质量的因素有:
偶联比、偶联桥、半抗原的分子空间结构、浓度测定、纯度鉴定和结构分析。
常用的人工抗原的鉴定方法有:
紫外分光光度法鉴定人工抗原、非变性聚丙烯酰胺电泳鉴定人工抗原、SDS-PAGE法鉴定人工抗原、人工抗原偶联比的测定。
三、青霉素单克隆抗体的制备与鉴定
材料:
氨苄青霉素、羧苄青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素,青霉素钠、土霉素、四环素、新霉素,为中国药品生物制品鉴定所;细胞色素C(Cy)、牛血清白蛋白(BSA)、RPMI-1640培养基、HT、HAT、PEG、弗氏佐剂、降植烷、抗体类型及亚类鉴定试剂盒及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG等,均为Sigma产品;Sp2/0骨髓瘤细胞本所保存;96孔细胞板和96孔酶标板均为丹麦Nunc产品;体质量20g的SPFBALB/c小鼠(8周龄)。
1.氨苄青霉素分别与细胞色素C和BSA的交联物的制备
2.紫外分光光度计检测抗原
3.BALB/c小鼠的免疫
4.细胞的融合及培养 参照文献[5]的方法进行。
取上述。
5.杂交瘤细胞的筛选与克隆 待融合细胞生长到覆盖培。
6.腹水制备及抗体纯化。
7.抗体类型及亚类鉴定和腹水效价测定。
8.青霉素50%抑制质量浓度的测定。
9.单克隆抗体的特异性测定。
(1)单克隆抗体的效价测定
抗体稀释度
5000:
1
10000:
1
20000:
1
40000:
1
160000:
1
320000:
1
640000:
1
A
1.582
1.382
0.732
0.633
0.282
0.206
0.102
B
1.602
1.339
0.768
0.628
0.296
0.203
0.116
C
1.608
1.367
0.782
0.672
0.287
0.207
0.128
D
1.596
1.389
0.756
0.683
0.288
0.210
0.117
E
1.597
1.362
0.776
0.687
0.289
0.208
0.109
F
0.101
0.046
注:
0.101为阴性值,0.046为空白值。
(2)单抗敏感性测定(IC50)
a.取已包被过夜的板,洗板
b.分别加入50μL各浓度的青霉素类药物及其它抗生素药物,再加入50μL的10000:
1的抗体;
c.置湿盒内于37℃作用至1.5h;
d.用PBST洗涤液洗三次;
e.加入酶标二抗(1:
4000)100μL/孔,置湿盒内于37度作用至1h。
f.甩掉多余的酶标抗抗体,用洗涤液洗五次,然后用纯化水洗两次;
g.每孔加入10μL新配制得底物TMB,置暗处作用20min;
h.每孔加入100μL2mol/L硫酸,终止反应;
置酶标仪测定结果。
A
B
C
D
E
F
G
H
浓度(ng/mL)
100
50
25
12.5
6.25
3.125
阴性
空白
1
0.148
0.325
0.512
0.655
0.825
0.985
1.272
0.025
2
0.142
0.336
0.525
0.657
0.834
0.982
1.280
0.028
表1氨苄青霉素IC50值测定结果
OD值为阴性孔数值一半的值时的标准品浓度为为IC50,氨苄青霉素IC50为12.5ng/mL。
A
B
C
D
E
F
G
H
浓度(ng/mL)
100
50
25
12.5
6.25
3.125
阴性
空白
1
0.182
0.365
0.622
0.728
0.912
1.012
1.272
0.035
2
0.186
0.388
0.628
0.736
0.926
1.025
1.280
0.037
表2阿莫西林IC50值测定结果
OD值为阴性孔数值一半的值时的标准品浓度为为IC50,阿莫西林IC50为25ng/mL。
A
B
C
D
E
F
G
H
浓度(ng/mL)
100
50
25
12.5
10
3.125
阴性
空白
1
0.123
0.285
0.536
0.584
0.625
1.122
1.272
0.027
2
0.122
0.262
0.526
0.589
0.628
1.135
1.280
0.032
表3青霉素GIC50值测定结果
OD值为阴性孔数值一半的值时的标准品浓度为为IC50,青霉素GIC50为10ng/mL。
A
B
C
D
E
F
G
H
浓度(mg/mL)
100
50
25
12.5
6.25
3.125
阴性
空白
1
0.232
0.411
0.628
0.824
0.982
1.022
1.382
0.036
2
0.248
0.425
0.622
0.885
0.992
1.025
1.366
0.033
表4四环素IC50值测定结果
OD值为阴性孔数值一半的值时的标准品浓度为为IC50,四环素IC50为25mg/mL。
A
B
C
D
E
F
G
H
浓度(mg/mL)
500
250
125
62.5
31.25
15.5
阴性
空白
1
0.368
0.685
0.796
0.962
1.005
1.255
1.596
0.028
2
0.372
0.681
0.798
0.998
1.011
1.245
1.560
0.036
表5庆大霉素IC50值测定结果
OD值为阴性孔数值一半的值时的标准品浓度为为IC50,庆大霉素IC50为125mg/mL。
A
B
C
D
E
F
G
浓度(mg/mL)
300
150
75
37.5
18.75
阴性
空白
1
0.342
0.796
0.988
1.015
1.244
1.582
0.033
2
0.348
0.728
0.976
1.017
1.248
1.563
0.035
表6链霉素IC50值测
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