作为新型疫苗使用的活的减毒的重组伪狂犬病毒的概述.docx
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作为新型疫苗使用的活的减毒的重组伪狂犬病毒的概述
姓名:
张克龙
专业:
动物科学院预防兽医学
学号:
1618305017
作为新型疫苗使用的活的减毒的重组伪狂犬病毒的概述
摘要:
伪狂犬病病毒(PRV)是一种双链,猪源DNA病毒,其基因组大小约为150kb。
PRV具有许多非必需基因,其可以被编码异源抗原但对病毒繁殖没有有害影响的基因替代。
表达的天然和外来抗原的重组PRV能够刺激免疫应答。
在本文中,我们对当前具有控制动物中的病毒感染的可能的活减毒重组PRV和基于PRV的活载体疫苗进行概述。
简介
1.1PRV背景
伪狂犬病病毒(PRV)是疱疹病毒家族的一个成员,α疱疹病毒亚亚科和伪狂犬病(PR)或Aujezsky氏病的病原体。
感染PRV之后导致神经紊乱,呼吸困难,消瘦,年轻仔猪死亡,流产感染。
该病毒具有双链线性DNA基因组1.43×10 5 kb 的长度和含有独特的长区域(UL),独特的短区域(US),一个末端重复序(TRS),和内部重复序列(IRS)。
到目前为止,已经鉴定了至少11种不同的PRV糖蛋白(gB,gC,gD,gE,gG,gH,gI,gK,gL,gM或gN),并且编码这些蛋白质的基因已经测序。
PRV的必需糖蛋白包括gBgD,gH,gL和gK; 其他被认为是不必要的[ 5,6 ]。
有PRV的诸如胸腺激酶(TK)和蛋白激酶(PK),其与致病[相关的多个非结构蛋白6,7 ]; 然而,该基因子集可以被异源基因替代而不影响感染性或病毒繁殖,只要基本基因保持完整。
显示在关于在PRV基因组的基因插入常见的部位的示意图如图1.
图1
PRV基因组中用于插入外源基因的常见位点。
编码TK,PK,gG的,国电电力,GI和gE基因的基因是插入外源序列的最常见位点。
TK基因位于独特的长区(UL)内,并且PK,gG的,国电电力,GI和gE基因基因位于独特的短区(US)内。
IR=内部重复序列; TR=末端重复序列。
附图不是按比例的。
已经研究了多价PRV疫苗的功效。
在这里,我们概括研究使用减毒重组PRV(rPRVs)作为疫苗候选的作为应用应用的进展,用于推动rPRV载体疫苗的发展。
1.2减毒活PRV疫苗的简介
重组PRV病毒最有希望改进现有疫苗和开发新的的途径以及即将开发新疫苗。
在原则上,设计的伪狂犬病毒载体疫苗在活PRV基因组的前提是被用来插入和表达编码来自其他病原体包括病毒,细菌的保护性抗原的基因,和寄生虫等。
所表达的外源抗原可以在随后用来刺激相关的免疫反应。
许多非必需基因中的大PRV基因组中的存在允许多个外源基因的同时插入,使接种多种矿院对抗多种疾病有了希望。
PRVBartha-K61是rPRV的常见亲本菌株。
它是减毒的PRV,可以在猪肾细胞中,鸡卵,以及鸡胚细胞反复传代。
在这株序列中,完整的gE基因和GI基因的一部分已被删除。
然而,该种结构见证了在开发多价疫苗,以控制各种传染病应用取得了成功。
使用rPRV的共同方法及构建携带PRV基因组的一部分的转移载体。
将该载体与天然PRV一起转染入易感细胞,然后筛选细胞中重组体。
除了PRV基因组的一部分,转移载体还含有启动子,感兴趣的外源基因和报告基因。
PRV序列应该出现在载体的始断和末端,以允许载体的臂和病毒基因组之间的同源重组。
有研究表明,人巨细胞病毒(CMV)启动子在指导病毒基因合成方面比PRV启动子更有效。
因此,CMV早期基因启动子已经成为在这些构建体中使用的最常见的启动子。
它也可以用于rPRV的鉴定。
除了产生重组体的常规方法,病毒基因组可以被克隆到细菌人工染色体(BAC)载体中。
生成定点和转座子诱变重组使用BAC的疱疹病毒已有很深研究。
2.减毒PRV活疫苗的功效
到目前为止,已经插入PRV基因组大多数外源基因的编码来源于动物病毒的关键抗原。
迄今为止开发构建的总结如表,其包括亲PRV毒株,外源基因,并插入位点。
下面的例子提供了对这种技术的成功使用进入更深入的讨论。
2.1PRRSV/PRV重组病毒疫苗
猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种有包膜,正链RNA病毒,是动脉炎病毒科。
它会导致巨大的经济损失和世界范围内各个国家最重要的疾病,并且此病更加严重。
PRRSV的基因组是15kb的长度和包含九个开放阅读框指定ORF1A,ORF1b,ORF2a,ORF2b,ORF3,ORF4,ORF5,ORF6,ORF7。
十年前,开发了表达PRRSV的GP5包膜蛋白的减毒的rPRV,rPRV-GP5;GP5蛋白由ORF5编码。
rPRV-GP5能够在接种的猪中针对临床症状起到显着保护并减少由PRRSV攻击引起的病原性损伤的作用。
用rPRV或用PRRSV灭活的疫苗免疫的猪在攻击前后保持临床健康。
免疫后,仅产生短期(3天)的轻度发热(≤41℃),逐渐改善肺和肾损伤和短期病毒血症(分别为2和3周)。
然而,为了提高rPRV-GP5的保护功效,合成了修饰的GP5基因(GP5m),其中PanDRT辅助细胞表位(PADRE)序列插入在N末端和中和GP5表位之间。
新rPRV-GP5米引起特定PRRSV中和抗体和比rPRV-GP5细胞免疫水平更高。
近日,这组名为rPRV-GP5m-M的产生另一个结构,它表达了相同的载体中PRRSV的两大膜相关蛋白(GP5和M)。
用rPRV-GP5mM免疫的小鼠产生PRV特异性体液免疫应答,并提供针对致死性PRV激发的完全保护。
同时,在免疫的小鼠中观察到高水平的PRRSV特异性抗体和淋巴细胞增殖反应。
一旦在小鼠中证明了机制,研究进展将推进到仔猪当中。
与市售的PRRSV杀死的疫苗相比,rPRV-GP5mM免疫动物产生更高的PRRSV特异性抗体和更高的淋巴细胞增殖反应,导致对PRRSV的更好的保护。
这些数据表明PRV是开发针对PRV和PRRSV的基于病毒的疫苗的优良载体。
2.2PCV2/PRV重组病毒疫苗
猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶后多系统衰竭综合征(PMWS),这是一个世界性的疾病,使猪虚弱与淋巴结肿大和间质性肺炎的主要原因。
PCV2是单链环状DNA病毒和环状病毒家庭成员。
PCV2具有三个主要ORF;ORF1编码两个复制相关的蛋白质,Rep和Rep,这是病毒DNA复制必不可少的;ORF2编码PCV2的主要衣壳蛋白;并且ORF3编码非结构ORF3蛋白。
表达ORF1和ORF2的融合蛋白的rPRV构建和其免疫原性小鼠和猪试验10。
rPRV-PCV2在BALB/c小鼠中引发强的抗PRV和抗PCV2抗体,其中rPRV-PCV2保护小鼠抵抗用强毒PRV的致死攻击。
在猪中,rPRV-PCV2引起针对PRV和PCV2的显着免疫应答。
构建第二个rPRV,仅表达也用于免疫小猪的ORF2基因。
结果表明,rPRV-ORF2引起既PRV和PCV2显著体液免疫应答,其中PCV2特异性淋巴细胞增殖反应可通过49天免疫之后检测。
rPRV-ORF2比表达ORF1和2的rPRV在小猪中更好地引发保护性免疫应答。
这些发现证明rPRV-PCV2可以是针对PRV和PCV2的合适的二价疫苗,并且多重性不总是疫苗开发的最佳方法。
2.3FMDV/PRV重组病毒疫苗
足口病病毒(FMDV)是具有高度传染性,会影响所有偶蹄类家畜包括牛,绵羊,山羊,猪,水牛。
它是长约8.5kb的正单链RNA病毒,属于微小核糖核酸病毒科。
的口蹄疫病毒衣壳前体P1-2A被裂解并用L蛋白酶从多蛋白释放和加工通过病毒蛋白酶3C以形成四个结构蛋白,VP1,VP2,VP3,以及VP4。
口蹄疫病毒有七个血清型,A,O,C,Asia1,SAT1,SAT2和SAT3,每一个都包含多个亚型。
使用PRV作为载体,VP1基因融合到PRV基因组。
在15白猪中FMDV血清阴性测试重组产物的免疫原性。
虽然抗体水平高于市售口蹄疫疫苗和抗强毒口蹄疫病毒的保护性低,没有观察到rPRV-VP1构建体仍然在感染猪缓解临床症状。
为了改善免疫应答,产生表达FMDV的P1-2A的另一种rPRV; 其保护作用白猪[评价39 ]。
与早期版本相反,这些猪表现出高水平的针对FMDV和PRV的中和抗体,并且还显示针对FMDV抗原激活的强CTL反应。
攻击后,当与市售疫苗相比时,用新rPRV构建体接种的猪的FMDV的复制显着较低。
近来,共表达P1-2A和病毒蛋白酶3C另一个rPRV的开发和仔猪进行测试。
这些结果表明rPRV-P12A3C诱导高水平的中和抗体和FMDV特异性淋巴细胞增殖反应。
相对于提供100%保护的灭活的FMDV疫苗,rPRV-P12A3C在受攻击的仔猪中仅诱导60%的保护,但能够减少病原性损伤。
这些发现表明,rPRV-P12A3C比以前的构建体更好地保护仔猪,并支持进一步开发针对FMDV和PRV的疫苗。
现在工作必须集中于靶向其他FMDV血清型,希望找到一种针对所有或大多数血清型具有良好功效的疫苗。
2.4PPV/PRV重组病毒疫苗
猪细小病毒(PPV)是猪繁殖衰竭的重要原因。
它的特点是胎儿死亡,木乃伊化,死产和延长产仔间隔[41]。
PPV是单链DNA病毒,其是动脉病毒科的家族成员。
其基因组大小为5kb,含有两个大的ORF;左ORF编码的非结构蛋白NS1和右ORF编码3衣壳蛋白。
三分之一的衣壳蛋白,VP2,可以进行自我组装成,灭活的完整病毒疫苗免疫学区分病毒样颗粒(VLPs)。
rPRV构建表达PPVVP2的基因,用rPRV-VP2接种的小猪引起PRV-和PPV-特异性体液免疫应答,并产生针对致死剂量的PRV的完全保护。
该发现进一步支持二价疫苗的开发,特别是针对PRV和PPV的开发。
2.5FMDV/PPV/PRV重组病毒疫苗
口蹄疫病毒和PPV的VP2的rPRV共表达P1-2A构建并用于接种BALB/c小鼠。
PRV的总抗体和中和抗体水平都与市售的PRV疫苗相当。
与灭活疫苗相比,FMDV或PPV的保护率>60%。
由rPRV构建体诱导的针对FMDV或PPV的中和抗体滴度为由它们各自的灭活疫苗诱导的水平的50%。
与先前的构建体不同,该疫苗候选证明了使用rPRV开发三价疫苗,特别是针对PRV,FMDV和PPV的可行性。
未来的工作应该在猪中进行,以测试这些疫苗在这些病毒的天然宿主中的效用。
2.6CSFV/PRV重组病毒疫苗
猪瘟病毒(CSFV)是一个显著阻碍了猪产品的全球化和相当大的经济损失全球贸易。
猪瘟是一种有包膜的,单股正链RNA属于属病毒瘟病毒家族成员。
其基因组12.3kb,编码单糖蛋白,糖蛋白2(E2),它是高度免疫原性的并能够诱导保护性免疫反应。
合成二价rPRV,其为gD/gE阴性并且表达糖蛋白E2。
仔猪接种表现出对双方伪狂犬病和猪瘟强有力的保障,对CSFV基于rPRV-二价疫苗配合使用。
2.7SIV/PRV重组病毒疫苗
猪流感病毒(SIV)是A型病毒,其被包膜并由负单链RNA组成。
它是家庭正粘病毒科的成员,其基因组编码10种病毒蛋白。
RNA片段4含有编码作为主要表面糖蛋白的大血凝素(HA)糖蛋白的基因。
它也是其诱导在动物亚型特异性保护性细胞和体液免疫应答主要免疫原。
区段5编码核蛋白(NP)基因表达血清型H3N2亚型SIV的HA基因的rPRV(A/猪/内蒙古/547/2001)构建和其免疫原性是在小鼠上进行测试。
攻毒后,不能从接种的小鼠中分离出病毒;然而,在肺中观察到轻微的病理损伤。
同时,rPRV-HA构建体还使用异源毒性SIV(A/Swine/Heilongjiang/74/2000)保护小鼠免于感染。
rPRV-HA疫苗代表针对SIV的候选疫苗。
最近,Klingbeil等人利用BAC技术从产生到克隆伪狂犬病毒猪H1N1病毒的一个基于HA-疫苗。
所得病毒与亲本菌株几乎没有差异。
给予单次注射疫苗的猪产生高水平的针对H1N1衍生的HA蛋白的抗体,并且当攻毒时保护免受感染的临床症状。
2.8其他rPRV疫苗
PRV具有广泛的主机,包括猪,羊,牛和狗。
因此,PRV载体已经用于在其它宿主和与病毒保护无关的系统(即原生动物寄生虫)中开发重组疫苗。
2.8.1弓形虫/PRV重组子rPRV的构建由原生动物寄生虫,表达SAG1弓形虫。
SAG1蛋白结构域属于一组具有SAG1相关序列的糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的蛋白质,其可以在寄生虫的表面上发现。
在BALB/c小鼠中测试rPRV-SAG1构建体的保护特性。
与rPRV-SAG1接种所有小鼠开发高水平的针对特定抗体的弓形虫裂解液抗原(TLA)和中和抗体。
此外,他们还观察到了脾细胞的增殖反应的增加,IFN-γ和IL-2和强细胞毒性T淋巴细胞应答。
当用小鼠的强毒RH株攻击弓形虫,所述rPRV-SAG1构建体诱导的部分保护(60%)。
这可能与原生动物寄生虫的显着复杂的生命周期和SAG1表达的阶段特异性相关。
为了提高保护性反应,表达SAG1或micronemal蛋白MIC3(rPRV-MIC3)两个附加rPRVs被开发和用于分别和同时免疫BALB/c小鼠。
与诱导高水平抗体的rPRVs接种所有小鼠弓形虫裂解物抗原,脾细胞增殖,IFN-γ和IL-2。
进一步的实验表明rPRVs体内刺激体液和细胞免疫应答。
接种疫苗的小鼠存活有一个致命的挑战弓形虫RH株;然而,并不完全保护。
这些结果支持先前的研究显示表达的效用弓形虫在PRV保护性抗原为制定打击伪狂犬病和弓形虫病的候选疫苗的新方法;然而需要其他的研究来增加宿主动物对寄生虫攻击的存活性。
一种方法是制备靶向多于一个阶段的感染的多价疫苗或测试其他寄生虫抗原。
与病毒不同,寄生虫在生物学和遗传学上都更复杂,这使得重组疫苗开发的方法复杂化。
2.8.2日本血吸虫/PRV重组子三rPRVs表达日本血吸虫的谷胱甘肽-S-转移(Sj26GST),脂肪酸结合蛋白(SjFABP),或构建和命名rPRV/Sj26GST,rPRV/SjFABP两者,rPRV/Sj26GST-SjFABP分别[59]。
他们的能力,以防止老鼠和绵羊日本血吸虫的攻毒进行评估。
结果表明,所有rPRVs诱导的针对总蠕虫提取物,增加的脾细胞增殖,和升高的IFN-特异性抗体反应γ和IL-2的水平在免疫的小鼠。
然而,在给予rPRV/Sj26GST-SjFABP的动物中观察到比在给予rPRV/Sj26GST或rPRV/SjFABP的那些更好的免疫刺激。
此外,在所有经免疫的羊中,用于治疗认为是安全的,并且蠕虫和蛋负荷在攻击后显着降低。
这些结果表明,对于基于rPRV的多价疫苗日本血吸虫可生产显著保护功能,能够防止原生动物寄生虫感染。
然而,小于100%的保护,这在推定的寄生虫疫苗中是非常常见的,阻碍了接受和进一步发展。
2.8.3JEV/PRV重组体表达日本脑炎病毒(JEV)的NS1蛋白ArPRV构建。
免疫BALB/c小鼠和猪。
使用10测试6 PFU,小鼠,仔猪和怀孕母猪显示为rPRV安全性良好。
给予rPRV-NS1病毒的动物产生JEV特异性体液和细胞免疫应答,并保护动物免受强毒PRVEa株的致死攻击。
这些实验提供了rPRV可作为产生可用于控制伪狂犬病和日本脑炎的新疫苗的候选物的证据。
2.8.4狂犬病病毒/PRV重组体表达狂犬病毒糖蛋白rPRV构建。
该重组病毒通过口服和肌内接种途径被认为对狗是安全的,并且诱导针对狂犬病和伪狂犬病的保护性免疫应答。
在接种后5周,中和抗狂犬病和假狂犬病的中和抗体效价明显升高,并保持至少6个月。
该实验表明,本文设计的构建体在宿主中存活良好,使得接种的动物的免疫概况是长寿的。
3.其他病毒载体
显然,存在可用作疫苗载体的其他病毒基因组,例如腺病毒,痘病毒和杆状病毒。
这些都已经被测试作为先前在PRV载体中表达的外源性抗原的递送载体。
腺病毒目前是最应用的基因递送系统之一。
作为载体,他们有外源基因(5-36KB)的插入高容量,能够转导大范围的细胞类型,并在试剂盒的形式用于后续遗传修饰市售的。
痘病毒是最大的已知动物DNA病毒组。
它们已被广泛地用作表达载体接种,大的外源基因的表达,以及细胞和体液免疫应答感应。
在更常见的痘病毒中有修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA),禽痘病毒和orf病毒。
MVA一直是天花疫苗多年,最近它已被用作用于预防癌症和感染性疾病[病毒载体64]。
其它实例包括使用含有西尼罗河病毒(WNV)的PrM和E基因的基于金丝雀痘的重组体来诱导猫和狗的保护作用。
该研究导致西尼罗病毒基因的表达和免疫保护诱导。
的ORF病毒已被用于使用E2基因产生针对CSV的保护性免疫和伪狂犬病猪。
因为orf病毒很少引起系统感染并且具有狭窄的感染宿主范围;它是开发多价病毒疫苗的合理选择。
杆状病毒是在昆虫细胞中过表达重组蛋白的极好的工具。
其宿主特异性最初被认为限于来源于节肢动物的细胞;然而,最近的研究已经表明,携带哺乳类细胞的活性的启动子杆状病毒能够在多种哺乳动物细胞类型的传输和表达外源基因在动物模型。
杆状病毒系统已经非常普遍,因为如同腺病毒,它们也可商购获得并且以试剂盒形式用于容易的遗传修饰。
上述病毒也已被用于开发具有PRRSV,PCV2,FMDV,CSFV和SIV的组分的重组活病毒。
这些众多的病毒载体在关键的免疫功效的比较如表2
表2
不同病毒载体之间的免疫学效力的比较。
4.结语
作为用于表达外源抗原的载体的rPRV的过往成功导致构建了较低致病性的新rPRV。
rPRV有许多优点。
首先,活减毒PRV具有大的基因组,其中一半基因组被认为是非必需的,因此允许修饰而不影响诸如感染性的关键特征。
虽然这些基因都与毒力相关联的,它们的缺失和替换通过外源基因对PRV传播无不良影响。
关于亲代病毒共同插入位点代表信息汇总在表1中。
病毒载体的好处是它们不仅表达其自身的保护性抗原,而且表达任何插入的外源基因。
因为它们使用宿主机器来复制和表达蛋白质,所以得到的外源基因产物具有更高的在翻译后被正确修饰或折叠的可能性,这在细菌系统中是缺乏的。
因此,衍生自rPRV的产物更可能模拟天然免疫原并在免疫动物中正确诱导体液和/或细胞应答。
如上所示,可以在单个载体构建体内靶向多种疾病。
第二,使用PRV基因缺失疫苗的风险最小。
PRV疫苗株已经使用了几十年,并且在体内表现出高安全性和有效性概况。
第三,PRV具有广泛的宿主范围,包括猪,牛,山羊和狗等。
这使得可以在多种宿主中靶向动物疾病,而不需要使用多种载体构建体来表达抗原。
第四,天然PRV诱导细胞免疫并引起潜伏感染。
因此,rPRVs可以在给定宿主中长时间维持,从而提供对保护性免疫应答的恒定刺激。
最后,PRV可以在包括SPF鸡胚胎成纤维细胞的各种细胞系中增殖。
这允许简化病毒生产和保持制造成本的控制。
当开发基于PRV的载体疫苗时需要考虑的其他因素是该载体系统需要强启动子以维持高和稳定的表达水平。
此外,用待用感兴趣的外源基因替代的PRV基因组中的非必需基因的选择可影响优化免疫应答。
鉴于载体衍生的和外源蛋白衍生的免疫应答之间的竞争性兴趣,重组构建体应当关于最佳接种剂量进行表征。
为了开发有效的rPRV疫苗,必须在所有未来的工作中考虑疾病的致病特征,保护机制和流行病学。
本文中报道的许多rPRV疫苗候选物尚未进一步研究或尚未商业获得。
一般来说,有些因素使这些产品进入市场变得复杂。
首先,需要优化病毒感染和复制以产生适合释放到环境中的有效和安全的疫苗。
为此,需要在病毒内鉴定更合适的非必需区域以增强外源基因的表达,特别是当正在开发多价rPRV时。
鉴于PRV的大基因组大小以及可影响病毒毒力和复制的必需区域和外源基因之间的相互作用,这不是一个简单的任务。
第二,通常需要在产生rPRV中对亲本PRV的修饰以消除或替代现有的标记基因或重要的调节元件,以使该构建体更适合于临床应用。
第三,需要计划在可获得的疫苗和来自rPRV的疫苗之间转换。
两者的并行或重叠疫苗接种将对随后的基于rPRV的免疫的功效和繁殖具有显着和有害的影响。
最后,使用rPRV的许多研究尚未进展到天然宿主,即猪。
临床试验的高成本问题,制造足够量以促进这些研究和将生物物质释放到环境中的问题通常是限制因素。
然而,这些研究对于获得表达基因的免疫原性,病毒感染的持续性和天然宿主中的刺激的寿命以及当使用独特修饰的基于rPRV的载体时研究肿瘤发生的潜力的更全面的图片是必要的。
致谢
作者的研究部分得到了中国教育部大学新世纪优秀人才计划(NCET-10-0144),黑龙江省立大学科技创新研究团队计划(2011TD001)资助,)和中国教育部重点项目(212038)。
作者声明,本出版物不存在任何利益冲突。
版权所有©2014东博等人。
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