硫酸铵微生物限度检查方法验证.docx
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硫酸铵微生物限度检查方法验证.docx
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硫酸铵微生物限度检查方法验证
硫酸铵微生物限度检查的
方法验证
1.验证目的:
建立硫酸铵的微生物限度检查方法,确认该方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌测定及控制菌的检查。
2.培养基
2.1营养琼脂培养基
配制方法:
取本品32.00g,加1L蒸馏水,加热溶解,分装,121℃,30min灭菌,备用。
2.2玫瑰红钠琼脂培养基
配制方法:
取本品30.50g,加1L蒸馏水,加热溶解,分装,121℃,30min灭菌,备用。
2.3胆盐乳糖培养基
配制方法:
取本品35.80g,加1L蒸馏水,加热溶解,分装,121℃,30min灭菌,备用。
2.4MUG培养基
配制方法:
取本品23.30g,加1L蒸馏水,加热溶解,分装,121℃,30min灭菌,备用。
3.验证用菌株:
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003第3代来源:
江苏省药品检验所
大肠埃希菌CMCC(B)44102第3代来源:
江苏省药品检验所
枯草牙胞杆菌CMCC(B)63501第3代来源:
江苏省药品检验所
白色念珠菌CMCC(F)98001第3代来源:
江苏省药品检验所
黑曲霉CMCC(F)98003第3代来源:
江苏省药品检验所
3.1菌液制备:
3.1.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草牙孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中,30-35℃培养24小时;
3.1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物少许接种至改良马丁培养基中,23-28℃培养48小时;
3.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物少许至改良马丁琼脂培养基中,23-28℃培养5天。
3.1.4取经30-35℃培养24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草牙孢杆菌营养肉汤培养物1ml,加9ml0.9%氯化钠溶液,10倍稀释至约10-5~10-6,备用。
3.1.5取经23-28℃培养48小时的白色念珠菌改良马丁培养基培养物1ml,加9ml0.9%氯化钠溶液,10倍稀释至约10-5,备用。
3.1.6取经23-28℃培养5天的黑曲霉改良马丁琼脂培养基斜面培养物,加入4ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液,洗脱孢子,吸出并转移至空试管作为原液,取1ml加入含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液9ml,10倍稀释至10-4,混匀备用。
4.细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证(平皿计数法)
验证试验至少应进行三次独立的平行实验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
4.1试验组
取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。
4.2菌液组
测定所加入的试验菌菌数。
4.3供试品对照组
取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
4.4稀释剂对照组
若供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。
试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
4.5菌回收率计算
试验组的菌回收率(%)=
试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数
×100%
菌液组平均菌落数
稀释剂对照组的菌回收率(%)=
稀释剂对照组平均菌落数
×100%
菌液组平均菌落数
4.6结果判断
在3次独立的平行试验中,若稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率均不低于70%,照该供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
4.7结果(见续页1)
5.控制菌检查方法验证:
5.1试验组
取规定量供试液及50~100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。
5.2阴性菌对照组
方法同试验组,验证大肠埃希菌的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。
5.3结果判断
阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。
若试验组检出试验菌,按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。
若试验组未检出试验菌,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
5.4验证结果:
(见续页2)
6.结论:
本品按中国药典2010年版二部附录XⅠJ微生物限度检查法进行方法验证,结果细菌、霉菌及酵母菌可采用取供试品10g,加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,使成1:
10的供试液进行检查;可采用1:
10的供试液对大肠埃希菌进行检查。
附硫酸铵微生物限度检查记录
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录(续页1)
检品名称
硫酸铵
批号
20110509、20110510、20110511
规格
1Kg/瓶
包装
塑料瓶
数量
各60g
生产单位
德国默克公司
检验依据
中国药典2010年版二部附录ⅪJ
供试液
制备
取供试品10g,加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1∶10的供试品溶液。
菌种
项目
平均菌落数(cfu/皿)
回收率%(应≥70%)
1
2
3
1
2
3
金黄色
葡萄球菌
试验组
63
68
66
81
87
85
稀释剂对照组
/
/
/
/
/
/
供试品对照组
0
0
0
/
菌液组
78
/
大肠
埃希菌
试验组
81
81
91
85
85
96
稀释剂对照组
/
/
/
/
/
/
供试品对照组
0
0
0
/
菌液组
95
/
枯草芽孢杆菌
试验组
53
51
53
93
89
93
稀释剂对照组
/
/
/
/
/
/
供试品对照组
0
0
0
/
菌液组
57
/
白色
念珠菌
试验组
44
39
39
96
85
85
稀释剂对照组
/
/
/
/
/
/
供试品对照组
0
0
0
/
菌液组
46
/
黑曲霉菌
试验组
46
44
42
90
86
82
稀释剂对照组
/
/
/
/
/
/
供试品对照组
0
0
0
/
菌液组
51
/
结论
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率大均于70%,可以采用该法制备供试液及检查金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。
控制菌检查方法验证记录(续页2)
检品名称
硫酸铵
批号
20110509、20110510、20110511
规格
1Kg/瓶
包装
塑料瓶
数量
各60g
生产单位
德国默克公司
检验依据
中国药典2010年版二部附录ⅪJ
控制菌验证:
大肠埃希菌
供试液制备
取供试品10g,加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1∶10的供试品溶液。
验证方法
试验组(大肠埃希菌)
阴性菌对照组(金黄色葡萄球菌)
1
2
3
1
2
3
接种MUG
+
+
+
-
-
-
接种靛基质
+
+
+
-
-
-
结论
试验组呈阳性,阴性菌对照组呈阴性,
可以采用该法制备供试液及检测大肠埃希菌。
计数培养基的适用性检查
室温:
℃相对湿度:
%
培养基:
1营养琼脂培养基
2玫瑰红钠琼脂培养基
均为符合2010版药典规定的干燥培养基。
由中国药品生物制品检定所提供。
仪器型号及编号:
一.培养基的无菌性检查
培养基
营养琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
结论
皿数
1
2
3
1
2
3
培养天数(d)
1
-
-
-
-
-
-
符合规定
2
-
-
-
-
-
-
3
-
-
-
-
-
-
4
/
/
/
-
-
-
5
/
/
/
-
-
-
备注
/
营养琼脂培养基灭菌批号:
20110120培养温度32.5℃(30-35℃)
培养箱号SPX-150B-Z(上海博迅实业有限公司)
玫瑰红钠琼脂培养基灭菌批号:
20110120培养温度25.5℃(23-28℃)
培养箱号LRH-250F(上海一恒科技有限公司)
二.培养基的灵敏度检查
1.菌液制备
(1)金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量79CFU/ml
[CMCC(B)26003]第4代10倍系列稀释
(2)枯草芽孢杆菌新鲜肉汤培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量66CFU/ml
[CMCC(B)63501]第3代10倍系列稀释
(3)大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量69CFU/ml
[CMCC(B)44102]第4代10倍系列稀释
(4)白色念珠菌新鲜改良马丁培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量64CFU/ml
[CMCC(F)98001]第3代10倍系列稀释
(5)黑曲霉新鲜孢子悬液,含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液稀释至与细[CMCC(B)98003]第3代菌浓度标准管相同浊度,10倍系列稀释至
含菌量62CFU/ml
2.检查结果
取预先制备好的琼脂培养皿2个,每块平皿接种1ml菌液(含菌50~100cfu),同时用已知质量保证的对照培养基平皿2个作对照实验,倾注培养基,混匀,待其凝固后将培养皿倒置于其的使用温度下培养48-72h,取出培养后的平皿点计菌落数。
样品培养基上的微生物数应不低于对照培养基上微生物生长的数量的70%。
否则,须重新检查或该培养基被视为不符合灵敏度检查要求。
营养琼脂培养温度32.5℃(30-35℃,2天)培养箱号SPX-150B-Z
玫瑰红钠琼脂培养温度25.5℃(23-28℃,3天)培养箱号LRH-250F
对照培养基批号:
营养琼脂培养基批号135003-201002
玫瑰红钠琼脂培养基批号135003-201003
室温:
22℃相对湿度:
56%
菌种类型
培养基装量(ml)
培养基皿数(皿)
营养
琼脂
培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
对照菌落计数
样品与对照菌计数比例
营养
琼脂
玫瑰红钠琼脂
营养
琼脂
玫瑰红钠琼脂
金黄色葡萄球菌
20
1
81
/
74
/
101%
/
20
2
73
/
79
/
枯草芽孢杆菌
20
1
80
/
70
/
118%
/
20
2
73
/
60
/
大肠埃希菌
20
1
59
/
58
/
94%
/
20
2
58
/
67
/
白色念珠菌
20
1
/
59
/
58
/
95%
20
2
/
61
/
69
黑曲霉
20
1
/
48
/
62
/
90%
20
2
/
56
/
53
结论
符合规定
实验人:
韦锋2011年1月25日复核人:
王燕2011年1月25日
三结论:
营养琼脂培养基和玫瑰红钠培养基的适用性检查符合规定
控制菌液体培养基的适用性检查
培养基:
1胆盐乳糖培养基
2MUG培养基
均为符合2010版药典规定的干燥培养基。
由中国药品生物制品检定所提供。
二.培养基的无菌性检查
培养基
胆盐乳糖培养基
MUG培养基
结论
管数
1
2
3
1
2
3
培养天数(d)
1
-
-
-
-
-
-
符合规定
2
-
-
-
-
-
-
3
/
/
/
/
/
/
备注
/
胆盐乳糖培养基培养温度32.5℃(30-35℃)
培养箱号
MUG培养基灭菌批号培养温度32.5℃(30-35℃)
培养箱
二.培养基的灵敏度检查
1.菌液制备
(1)金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量79CFU/ml
[CMCC(B)26003]第4代10倍系列稀释
(2)铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量70CFU/ml
[CMCC(B)10104]第3代10倍系列稀释
(3)大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量69CFU/ml
[CMCC(B)44102]第4代10倍系列稀释
2.检查结果
细菌培养温度32.5℃(30-35℃)培养箱号SPX-150B-Z(上海博迅实业有限公司
(1)增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。
与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好。
(2)培养基抑制能力检查
分别接种试验菌于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养,试验菌应不得生长。
(3)培养基指示能力检查
分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。
被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
表一:
培养时间:
24小时
菌种类型
胆盐乳糖培养基
对照胆盐乳糖培养基
空白对照
金黄色葡萄球菌(抑制)
-
-
-
铜绿假单胞菌(促生长)
+
+
-
大肠埃希菌(促生长)
+
+
-
结论
符合规定
表二:
培养时间:
24小时
菌种类型
MUG培养基
对照MUG培养基
空白对照
大肠埃希菌(促生长)
+
+
-
大肠埃希菌(指示)
+
+
-
结论
符合规定
实验人:
韦锋2011年1月23日复核人:
王燕2011年1月23日
三结论:
胆盐乳糖培养基和MUG培养基的适用性检查符合规定
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