Developing safe therapies from human pluripotent stem cells.docx
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Developingsafetherapiesfromhumanpluripotentstemcells
开发安全的人类多能干细胞治疗策略
翻译:
何君贤
原文作者:
MelissaKCarpenter,JoyceFrey-VasconcellandMahendraSRao
原文检索:
Carpenter,M.K.,J.Frey-Vasconcells,andM.S.Rao,Developingsafetherapiesfromhumanpluripotentstemcells.NatBiotech,2009.27(7):
p.606-613
摘要:
将人类的多能干细胞(pluripotentstemcellsPSC)推进到细胞治疗层面需要开发出检测产品均一性、稳定性、致瘤性、毒性和免疫原性的标准化检测方法。
前言:
细胞治疗是现代医学领域最有前景的几种治疗方法之一,若干治疗方案正在产业界和科研小组中酝酿。
自1968年第一例骨髓移植[1,2]成功以来,基于成人干细胞的治疗方案已经在临床上应用了数十年。
在这几十年的发展中,细胞治疗技术取得了巨大的发展。
与此相应,监管机制也发生了巨大变化。
(在美国),细胞治疗受美国食品药品监督管理局的“良好组织操作规程”(GoodTissuePracticesFinalRule)监管。
该操作规程对与细胞治疗有关的风险进行分类监管(表1)。
一批细胞产品,比如软骨细胞和人造皮肤已经获得了FDA的批准(表2)。
尽管与干细胞相关的产品目前还没有获得批准,但是该类产品中已经有几种处于晚期临床试验阶段了(表2)。
表1.监督管理机制
类别
监管机制
适用范围
举例
一类
不受FDA21CFR1271法案监管
基于细胞的制品,不涉及人类细胞/组织的细胞产品;没有或很小的处理;同源使用;不与药物或者设备搭配使用
器官移植、全血来源的产品、高剂量化疗或全身放疗后的骨髓移植
二类“361”
受公共健康安全法案第361部位监管
经过较小处理的基于人类细胞/组织的产品;同源使用;不与药物或设备混合使用;自体使用或者具有一级或二级血缘关系的亲属间使用
比如将右膝软骨和左膝软骨进行外科移植;用于治疗恶性血液疾病,从外周血分离纯化的CD34+簇造血细胞
三类“351”
受公共健康安全法案第351部分监管
经过培养或者处理的人类细胞/组织产品;不是以同源治疗为目的;结合药物或仪器使用;异体使用
利用扩大的人类神经干细胞以传输溶酶体酶类;在心肌梗死治疗中使用的人类胚胎干细胞来源的心肌细胞
对于成人干细胞治疗或者多能干细胞治疗来说,其一般操作流程是首先将未分化干细胞(undifferentiatedstemcell)扩大培养,然后体外诱导其分化成某种特殊类型的细胞,将这些诱导生成的细胞通过一定的方法输送到病人体内,最后使这些细胞长期定居在病人体内发挥作用。
围绕这一干细胞治疗流程所设立的一些监督管理办法主要是基于活细胞的一些特征而设立的。
活细胞在体内或者体外都会随着时间的变化而发生改变,这些细胞所生存的环境总体上是复杂多样的。
活细胞被移植到体内后会发生整合和迁移,与宿主系统,比如局部环境和免疫系统,发生相互作用。
但是,干细胞来源的细胞产品除了具有上述特征外还具有以下两个额外特征使得它们与众不同:
超强的自我复制能力和多能性。
细胞的高度自我复制能力保证了能够进行大规模的商业化生产,但是同时也提出了新的要求,即有必要对在体外经过一定时间培养后的细胞的稳定性进行评估。
细胞的多能性是诱导生成特殊的细胞类型的前提,但同时这一特性也有可能导致肿瘤的产生和生成不需要的细胞。
本文将重点讨论干细胞治疗所涉及监管控制等议题[3,4]。
由于第一个被授权的干细胞临床试验是人类胚胎干细胞(humanembryonicstemcellshESCs),本文将围绕人类胚胎干细胞展开讨论。
同时,我们也留出一点空间来讨论与诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcellsiPSCs)相关的一些特殊议题。
表2.市场上目前正在使用的或者处于晚期临床试验阶段的细胞治疗产品
产品
描述
用途
目前状态
软骨Carticel
自体软管细胞
软骨替代
已获批
上皮Epicel
自体成纤维细胞
皮肤替代
已获批
人造皮肤Dermagraft
异种成纤维细胞
皮肤替代
已获批
人造细胞Transcyte
异种成纤维细胞
皮肤替代
已获批
人造皮肤Apligraf
异种成纤维细胞
皮肤替代
已获批
间充质细胞Prochymal
人类成熟间充质干细胞
移植物抗宿主疾病
3期临床
肌细胞MyoCell
自体来源的骨骼肌细胞扩大培养物
充血性心力衰竭
3期临床
ALD-101细胞
脐带血细胞亚群
遗传性代谢疾病;溶酶体缺乏症;过氧化物蓄积疾病;造血干细胞移植
3期临床
为了证明hESC来源的治疗手段的安全性需要对原始材料进行检测、评估;证明细胞再生和细胞处理方案的可重复性;对最终产品的均一性进行分析;对细胞的体内特征如体内的分布、致瘤性、毒性和免疫原性进行分析。
上述某些议题已经在讨论细胞治疗的文章中进行了阐述[5,6]。
本文将着重对具有特殊挑战性的议题包括hESCs的分离、产品的均一性、细胞的稳定性、致瘤性、毒性以及免疫原性进行讨论。
1.hESCs的分离
目前所使用的大部分hESCs都是以研究为目的,用小鼠饲养层为辅助材料分离获得的。
目前FDA还没有专门针对为临床应用而进行hESCs分离的指导方案。
所以,目前研究者只能参照在体细胞治疗方面的指导方案来进行hESCs的分离操作。
在这样的指导方案下,用于临床的hESCs的分离需要遵循“良好的组织操作”(GoodTissuePracticeGTP)和“良好的生产操作”(GoodManufacturingPracticeGMP)方面的要求。
这些要求包括供体的合格性,在hESCs的采集、筛选、测试、处理、储存、标记、包装和分发过程中都遵循GMP规程。
详细的规程在21CFR210&211中有描述(见表3中有关FDA指导方案的链接和参考材料)。
但是,目前遵循GTP/GMP规程进行hESCs的分离已不现实。
比如用于人工生殖的体外生产的的胚胎虽然可以成功受孕,但是却不符合GTP/GMP操作规程。
GTP规程下的“供体合格性”要求对供体进行一系列的筛查,包括对每个供体家族史和血液样本的筛查。
在临床体外受精操作中一般没有做这些筛查,所以当这些体外受精所剩下的胚胎被捐献出来用于分离hESCs时也就很难实施规程中所要求的筛查了。
考虑到严格遵照GTP/CMP进行hESCs分离的现实困难,我们的焦点将集中到这些规范的要旨,即确保细胞产品不会被一些偶然的成分所污染。
所以,只需要按照FDA的“细胞系特征鉴定注意事项指导方针”(PointstoConsiderintheCharacterizationofCellLinesguideline见表3)对起始材料和最终的细胞产品进行检验就足够了。
针对hESCs进行检验可以缓解缺少供体信息的困难。
考虑到hESCs的高度自我复制的特性,即使GTP原则下的指导方针还没有完善起来,建立大的主细胞库和工作细胞库(masterandworkingcellbanks)也是有可能的。
这些细胞库包括足够多的细胞用于对污染物进行检测。
确实,将来按照GTP原则所生产的细胞系也不是必须进行临床注册。
今年(2009年)一月,FDA就批准了Geron公司(美国,加利福尼亚,Menlo公园)的用少突胶质细胞前体细胞进行新药研究的申请,这种前体细胞所来源的hESCs系是科研实验室以小鼠饲养层为辅助材料所分离的第一个hESCs系所[7]。
然而,随着该领域的不断进步,将来会生产更加符合GTP/GMP规范的细胞系用于临床实践和产品开发。
有几个研究小组正在针对规范中的要求开发“临床级”(clinical-grade)hESCs(即这些细胞系是在接受了GMP原则下的充分测试而产生的),其中一个小组报道已经开发出了6个这样的细胞系[8].
表3.开发干细胞治疗的参考材料
参考资料
链接
评审人员指南
人类体细胞治疗研究新药申请化学、生产、控制评审人员指导说明和模板
http:
//www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/
98fr/03d0349gdl.pdf
FDA评审员和资助者指南
化学、制造和控制内容和回顾
人类体细胞治疗研究新药申请信息
http:
//www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/
GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Xenotransplantation/ucm092705.pdf
产业指南:
关于异种移植产品在人上使用的动物、产品、临床前和临床期的问题
http:
//www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/
GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances
/Xenotransplantation/ucm092707.pdf
产业指南:
针对开发人类细胞、组织和基于人类细胞、组织的产品现行的良好组织操作规范(CGTP)
http:
//www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/
GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Tissue/ucm091408.pdf
对用于生产生物制品的细胞系进行特征鉴定时需要考虑的问题(1993)
http:
//www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/
GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
OtherRecommendationsforManufacturers/UCM062745.pdf
产业指南:
人类体细胞治疗和基因治疗指南
http:
//www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/
GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072987.htm
产业指南:
人类细胞、组织或者基于人类细胞、组织的产品的捐献者合格性确定
http:
//www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/
GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Tissue/ucm073964.htm
2.产品的均一性(Productconsistency)
生产基于hESCs的产品的目的就是能够在一种具有充分的安全防范措施、无菌、可追溯的洁净环境下生产出数量充足的、均一的细胞。
为了实现这种目标,就需要开发一种可以获得充足细胞数量的扩增方法,一种精确的诱导分化方法和经过验证的分析方法,以此来保证所生产的产品批与批之间具有很好的均一性。
只要在符合GMP规范的环境条件下使用标准操作方案和开发有效的监测整个生产环节均一性的检测方法就可以大体上达到这种均一性要求。
但是,对“均一性”的明确却具有很大的困难,因为与小分子不同的是,细胞是一种有生命的有机体,并会随着时间的变化而发生改变。
为了保证均一性,需要特别注意减少起始材料的差异、分化调控方法以及生产流程,并且要对终产品进行严格的功能和成分检查。
图1显示的是生产制造干细胞产品所涉及到的若干步骤。
图1.显示干细胞产品开发的生产工艺流程。
cGMP:
现行良好生产操作规范(currentGoodManufacturingPractice)。
2.1在差异性起始材料前提下保障产品均一性的措施
目前基于hESCs进行治疗策略开发的一般模式中一般是希望根据单个细胞培养建立一个群体,然后在体外进行适当扩增,以此为基础建立一种经过验证的hESCs主细胞库。
如果一种细胞产品来源于单一的一个细胞系―这种现象在培养的早期可以发生-差异性就有可能存在于主细胞库中的各个细胞瓶之间。
在细胞库中对细胞的构成成分进行彻底的检测可以解决差异性的问题。
但是,对均一性的担忧会随着为人类白细胞配型而建立起来的,供体多样的细胞库的增加而增加。
数百种hESCs细胞系已经被建立了起来,虽然没有对这些细胞系做过细致的比较,但是分化能力的明显差异却已经被发现[9,10]。
考虑到从不同个体所分离的处于同一时期的干细胞群所表现出来的明显差异(未发表数据),上述不同hESCs系之间所展现出来的差异性也不足为奇。
hESCs细胞系之间的差异有可能是由分离方法、分离时期(如桑椹期或囊胚期)或者等位基因间的差异所造成的。
这些差异将导致生产速度、分化能力、核型稳定性和体内整合和体内功能的差异。
表4.hESCs具备的特征a
特征
标准
群体倍增时间
~36h
是否需要成纤维细胞生长因子
是
分化能力
有
核型稳定
是
SSEA-1标记
无
SSEA-3标记
有
SSEA-4标记
有
TRA-1-60标记
有
TRA-1-81标记
有
Oct4标记
有
Nanog标记
有
Sox2标记
有
E-cadherin标记
有
Brachyury标记
无
Pax6标记
无
APF标记
无
a从参考文献34中整理而来
在于我们常见的生物制品中也存在类似的差异,虽然差异的程度相对来说小一些,但是还是存的,如促红细胞生成素(erythropoietin)。
存在于这些生物制品中的差异性已经通过将产品限制于某一种起始材料或者开发严格的、可以提供预测能力的分析评判标准得以解决。
在hESCs中采取上述同样的策略却比较困难。
虽然目前对多能干细胞的特征的研究已经取得了很大的进展,但是这些特征间的关系和特征的安全性依然不清楚。
目前已经采用标准化的方法,如检测多能性标记(pluripotencymarkers)的免疫细胞化学方法和PCR方法、核型分析(evaluationofkaryotype)、类胚体和畸胎瘤形成能力检测等方法,对hESCs的特征进行了鉴定。
并且,已经采用了芯片技术、基因表达序列分析(serialanalysisofgeneexpressionSAGE)以及转录谱(transcriptionalprofiling)等方法对不同hESC细胞系进行了比较分析[11-15]。
我们研究小组的成员还根据芯片分析的结果提出了一组多能性基因(M.R.及其同事[12])。
最近,更是通过对多个细胞系的荟萃分析(metanalysis)提出了一组无偏基因用于对hESC细胞系进行分析[16]。
这些方法虽然都有一定的可取之处,但是在临床应用方面它们要么不能被广泛接受,要么达不到要求的精度或者可信度。
考虑到各hESC细胞系之间存在的客观差异性,我们建议在主细胞库中进行的检测应该包括表型分析、基因型分析和功能分析。
一些可用的检测特征在表4中列出。
2.2在诱导分化和生产过程中确保批次间的均一性
虽然在开发诱导分化方法[17,18]、纯化方法[19]和选择[20]方面已经取得了很大的进步,但是最终的细胞群体却不可能达到绝对的均一性。
所以,我们需要一种可以生产出具有相似细胞组成的、可重复的诱导分化流程。
在分化和生产过程中的关键控制点处需要对包括细胞表型(phenotype)、倍增时间(doublingtime)、存活力(viability)、群体差异性以及包括无菌特性、内毒素水平(endotoxinlevel)、支原体污染(mycoplasmacontamination)在内的安全性等指标进行检测。
2.3通过确定产品的组分来确保功能的均一性
总体上来说,细胞产品可以被认为是一群由功能成分(有活性的细胞)和污染物成分组成的杂合细胞群体。
污染物有可能是辅助细胞、未分化细胞或者其它与治疗作用无关的细胞。
生产工艺需要确保各批次之间包括稳定数量的活性成分和污染成分。
以下将详细探讨细胞产品中存在的不需要的细胞组分以及确定这些组分的可接受水平的重要性。
对细胞产品进行功能评估需要开发检测产品功效的模拟系统,以此来预测细胞产品的体内活性。
这种分析测试系统有可能十分复杂,因为活细胞的类型或者其发挥活性的机制无法知晓(如在脊髓损伤治疗中,治疗性细胞有可能是促进髓鞘再生,或者是提供了某些生长因子或者两者都具备)。
开发体外预测分析系统可以大大减少测试和优化生产条件所需的成本和时间,从而可以大大的促进生产。
对某个终产品的特征进行鉴定需要考虑细胞群体和其发挥功能的机制。
比如,在对治疗帕金森氏病(Parkinson’sdisease)中用作替代细胞的多巴胺能神经元(dopamainergicneurons)进行鉴定时,需要考虑的问题是,该细胞群需要表达合适的标记分子如神经丝和酪氨酸羟化酶(neurofilamentandtyrosinehydroxylase),不表达未分化细胞、内胚层和中胚层的标记分子。
功能测试项目中应该包括细胞去极化后多巴胺的释放活性和移植后不分裂特性的维持。
再比如,如果移植的细胞主要是为了提供某些因子以保护内源性细胞或者弥补内源性缺失的因子,那么功能分测试项目中就需要分析这些因子的分泌情况。
在细胞产品的评估中,表观遗传学特征分析(epigeneticprofiles)也有可能起到一定的作用。
目前,FDA还没有对一些细胞产品中重要基因的表达检测或者表观遗传组学(epigenome)的检测做出要求。
即便如此,如果对这些指标进行检测将会有利于细胞特征的评估。
刚开始的时候可以检测组蛋白修饰(histonemodification)和DNA甲基化(DNAmethyaltion)[21,22],以此来评估表观遗传的稳定性。
确定细胞产品的均一性的困难是客观存在的,因为多能干细胞正是由于其多潜能性才在临床治疗方面受到人们青睐的。
多能干细胞是一种活跃的细胞,能够对环境作出积极的反应。
在培养条件下可以进行无限生长,从而导致了以体外系统很好地预测以多能干细胞为基础开发出的某种细胞产品批次间的稳定性、体内活性面临巨大的挑战性。
由iPSCs所展开的个性化治疗研究,每个批次的细胞产品都是个体特异性的,每个批次产品的起始材料都不同,这又一次加剧了产品均一性评估的难度。
尽管如此,还是开发出了一些方法来检验并监测这些参数。
3.细胞的稳定性
细胞治疗领域的细胞稳定性议题起源于对细胞群体的分割。
人们尤其关心的是细胞在经历若干群体倍增(populationdoublings)后是否变得不稳定或者发生转变。
确实,造血细胞移植(目前唯一大规模使用的干细胞治疗方法)治疗中偶尔会发生的一种并发症就是供体细胞白血病(donor-cellleukemia)[23]。
细胞在体外进行长时间培养后就会开始发生漂变或者说是发生遗传性或者表观遗传性变化。
自我更新能力增强的hESCs有可能在体外长期培养条件下获得选择优势。
在某些情况下,长期培养条件下的hESCs明显具备一种稳定的表型、核型和印记特征[24-28],但是在另一些情况下,它们也可能获得与人类胚胎瘤类似的核型特征,比如12号染色体三体和17号染色体三体[26],或者其他变异[29]。
有两个研究小组最近在长期培养的hESCs中鉴定出了一些次生的染色体异常,包括与癌基因转变有关的20q11.21扩增[30,31]。
总体上,这些细胞还是保持了多能性特征并表达一些标准的hESC标记[25,26,32]。
尽管还不知道存在于hESC培养中的少数核型异常细胞是否会影响包括生长速度、细胞周期调控和分化能力在内的大体特征,但是,这些异常的发现强调了细致监测的必要性。
开发出异常核型检测方法将会对安全性评估起到很好的辅助作用。
由于采用了人类胚胎这种特殊的起始材料,对hESCs表观遗传的稳定性在一开始就引起了人们的注意。
已经发现人工辅助生殖用的培养胚胎存在着一些表观遗传异常[33,34]。
有几个研究小组已经着手对hESCs的表观遗传学特征进行研究,包括X染色体失活(X-inactivation)、印记(impringting)和甲基化(methylation)。
X染色体失活似乎在不同的hESCs细胞系中存在着差异[35,36]。
印记研究表明在培养环境下可以维持基因组一定程度上的稳定性[27,28,33]。
一些新的工具已经被开发出来评估多能干细胞的甲基化特征[37,38]。
接下来的工作就是研究这些甲基化特征能否在长期培养下保持稳定。
考虑培养的hESCs的遗传学和表观遗传学问题对安全性测试具有多方面的启示。
其中最重要的一点就是对hESCs和分化出来的细胞产品的测试需要在一个足够长的时间范围内进行,这样才可以获得关于稳定性的可靠结论。
所以,上文提到的对产品稳定性进行测试的的指标(表型、核型、遗传特征和表观遗传特征)都需要在一个长的时间期限内进行。
对囊括数代或者数个倍增群体进行的稳定性测试可以包括重要基因的表达(如端粒酶基因、细胞周期相关基因、关键的hESC标记分子基因)、基因组和表观遗传的稳定性(甲基化、miRNA、组蛋白乙酰化和X染色体失活)。
将这些测试与对其它体外分析测试相结合,有可能使遗传学和表观遗传学特征测试成为细胞产品体内稳定性评估的一种测试方法。
虽然我们相信细胞治疗所采用的hESC群体应当是二倍体并且稳定,但是值得指出的是,在FDA批准的临床试验中,有用人类胚胎瘤细胞系NT2进行试验的项目[39,40]。
在由LaytonBioscience公司(美国加州光谷)所实施的临床试验中,所移植的神经元细胞来源于NT2/D1细胞系。
NT2/D1细胞先在视黄酸条件下培养6周,然后在抗有丝分裂物质下培养6天,然后将按照这种培养方法所生产出来的神经元细胞冷冻保存直到移植。
移植时,细胞被解冻,然后经过一定的处理后注射到中风病人的体内。
病人在接受大约两百万到一千万细胞移植后,还需要进行持续52周的移植后评估。
NT2细胞被报道有56-61条染色体,并携带很多异常[41]。
但是,当将NT2N细胞(对这种细胞的处理方法与上述应用于临床应用的细胞的处理方法相似)移植到裸鼠中枢神经系统时,在14个月的检测期内没有发现致瘤性和有丝分裂活性[42]。
另外,在这些临床试验中,没有一例致瘤的报道。
这些数据表明,异常核型或者较轻微的异常倍型不是致瘤性的预测指标。
4.致瘤性
用多能干细胞开发细胞产品最重要的一个议题是确保细胞在输入到人体后不会导致肿瘤的发生。
关于这一点主要有两方面的考虑。
第一,治疗性细胞可能被具有增殖能力并能够致瘤的未分化细胞所污染。
第二,治疗性细胞可能去分化(de-differentiate)或发生转变,从而导致良性或者恶性肿瘤。
我们建议围绕致瘤性的考虑应当针对病人个体考虑风险/受益率。
比如,得了像肌萎缩性侧索硬化症或者亨廷顿氏病等致命性、恶性疾病的患者在接受细胞治疗方面所能够容忍的风险显然要比那些还能够生活数年的病人,如糖尿病患者,所能够承受的风险要大很多。
4.1致瘤性评估所要考虑的问题
hESCs的多能性评估是通过将这种细胞注射到免疫缺陷的小鼠体内看畸胎瘤形成的情况来实现的。
这些畸胎瘤一般被认为是一种包含三个胚层分化成分的良性肿瘤。
尽管hESCs是从内细胞团(innercellmassICM)分离而来,但是由它们所形成的畸胎瘤与自发形成的生殖细胞瘤在形态
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