液相色谱质谱联用法测定血浆中氯吡格雷浓度及其人体药动学研究.docx

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液相色谱质谱联用法测定血浆中氯吡格雷浓度及其人体药动学研究

附件1

2017年度申报专业技术职务任职资格

评审答辩论文

题目：

液相色谱-质谱联用法测定血浆中氯吡格雷浓度及其人体药动学研究

作者姓名：

周文佳

单位：

核工业总医院

申报职称：

　副主任药师

专业：

临床药理

二○一七年七月二十六日

液相色谱-质谱联用法测定血浆中氯吡格雷浓度及其人体药动学研究

周文佳

（核工业总医院药物临床试验机构江苏苏州）

摘要：

目的：

建立液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）法测定人血浆中氯吡格雷的血药浓度，研究健康受试者空腹及高脂高热量饮食情况下口服硫酸氢氯吡格雷片的药动学特征，考察高脂高热量饮食对硫酸氢氯吡格雷片药动学的影响。

方法：

采用随机、开放、双周期交叉试验设计。

60名男性健康志愿者在两个试验周期分别空腹或餐后口服硫酸氢氯吡格雷片75mg。

采用液相色谱质谱联用法测定人血浆中氯吡格雷的浓度。

用DAS3.2.3药动学软件计算药动学参数，并用SPSS17.0软件对主要参数进行统计分析。

结果：

空腹与进食后的主要药动学参数如下：

Cmax分别为（1440±2397）ng·L-1和（4155±2117）ng·L-1，AUC0-36h分别为（2268±3887）ng·L-1·h和（8691±3628）ng·L-1·h，AUC0-∞分别为（2324±3899）ng·L-1·h和（8816±3668）ng·L-1·h，t1/2分别为（5.7±4.7）h和（8.8±3.8）h，tmax分别为（0.7±0.5）h和（1.7±0.7）h，Vd分别为（520115±471187）L和（118826±59077）L，Cl分别为（82365±70072）L·h-1和（9949±4017）L·h-1，MRT0-36h分别为（3.0±1.8）h和（3.6±0.9）h。

经检验，空腹与进食后的主要药动学参数均有显著性差异（P<0.05）。

结论：

高脂高热量饮食对硫酸氢氯吡格雷片的药动学特征有显著影响，餐后给药可使氯吡格雷的达峰时间延长，生物利用度提高，半衰期延长。

关键字：

氯吡格雷；药动学；液质联用；食品药物相互作用；高脂高热量饮食

DeterminationofclopidogrelinhumanplasmabyHPLC-MS/MS:

applicationtopharmacokineticsstudy

ZhouWenjia

（TheGeneralHospitalofNuclearIndustry,DrugClinicalTrialInstitution,Suzhou,Jiangsu）

Abstract：

Objective:

Toestablishanhighperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometricmethod（HPLC-MS/MS）forthedeterminationofclopidogrelinhumanplasma,tostudytheeffectsofhighfatandcaloriesdietonpharmacokineticsofclopidogrelhydrogensulphatetabletinChinesehealthyvolunteersbycomparingpharmacokineticparametersunderfastingandfedconditions.Methods：

60healthymalevolunteerswereassignedtoreceivesingleoraldoseofclopidogrelhydrogensulphatetablet75mgonemptystomachorincombinationwithhighfatandcaloriesdietintwoweekendsbyarandomizedsequence,open-1abel,two-periodcrossoverdesign.PlasmaconcentrationsofclopidogrelweremeasuredbyHPLC-MS/MS.ThepharmacokineticparameterswerecalculatedbyDAS3.2.3,andtheeffectofthehighfatandcaloriesdietonthepharmacokineticsofclopidogrelwasevaluatedbySPSS17.0.Results:

Underfastingandfedconditions,themainpharmacokineticparametersofclopidogrelwereasfollows:

Cmaxwere（1440±2397）,（4155±2117）ng·L-1,AUC0-36hwere（2268±3887）,（8691±3628）ng·L-1·h,AUC0-∞were（2324±3899）,（8816±3668）ng·L-1·h,t1/2were（5.7±4.7）,（8.8±3.8）h,tmaxwere（0.7±0.5）,（1.7±0.7）h,Vdwere（520115±471187）,（118826±59077）L,Clwere（82365±70072）,（9949±4017）L·h-1,MRT0-36hwere（3.0±1.8）,（3.6±0.9）h.Theresultsofstatisticalanalysisshowedthatthereweresignificantdifferencesonallmainpharmacokineticparameters（P<0.05）betweenfastingandfedgroup.Conclusion:

Itissuggestedthathighfatandcaloriesdiethaseffectonpharmacokineticsofclopidogrelhydrogensulphatetablet,withbioavailabilityaswellastmaxandt1/2increased.

Keywords:

clopidogrel;pharmacokinetics;HPLC-MS/MS;food-druginteractions;highfatandcaloriesdiet

1.引言

氯吡格雷（Clopidogrel）是噻吩并吡啶类药物，主要通过阻断ADP受体而抑制血小板活性，具有不可逆抑制血小板聚集的作用，目前在临床上广泛用于心肌梗死、脑卒中和周围动脉缺血等动脉血栓性疾病的治疗[1]。

氯吡格雷是一种前体药物，在体内，氯吡格雷原型药物约85%通过酯酶水解为无活性的氯吡格雷酸，另有大约15%氯吡格雷通过CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19等酶代谢为2-氧-氯吡格雷,然后通过酯酶水解成具有生理学活性的氯吡格雷硫醇衍生物[2]。

临床上氯吡格雷疗效的个体差异广泛存在，部分患者在接受氯吡格雷常规治疗时，仍达不到预期的抗血小板治疗作用，甚至导致严重心脑血管事件及死亡，即“氯吡格雷抵抗”[3,4]。

由于氯吡格雷药代动力学及药效学与CYP2C19有着显著联系，目前临床已采取在用药前，先对患者进行氯吡格雷CYP2C19基因检测，再针对携带缺陷基因的患者实施个体化用药。

但造成氯吡格雷临床疗效差异的原因除了基因多态性外，还包括药物相互作用、临床因素、患者依从性等因素[5]。

因此，对氯吡格雷进行血药浓度监测可以直观的反应各种情况服药后氯吡格雷体内暴露量，为医生实施个体化治疗提供更直观的理论依据，这对基因检测手段是一个补充。

相对于基因检测耗时长、费用高，采用HPLC-MS/MS法测定氯吡格雷血药浓度的监测手段具有灵敏、快速、简便、易推广的特点。

目前，已有文献[6-14]通过测定氯吡格雷或氯吡格雷酸的血药浓度评价试验药物的等效性或药动学特征，但最近欧洲药品评估局（EMEA）指出进行氯吡格雷的等效性研究时，只需评价原型药物氯吡格雷的血药浓度水平[15]，且部分文献的测定方法存在基质效应、代谢物回转的问题，会影响测定准确性。

因此，本文建立了灵敏、准确、快速的HPLC-MS/MS方法用于测定氯吡格雷血药浓度，以考察血浆样品中氯吡格雷的药代动力学特征。

硫酸氢氯吡格雷片为口服制剂，因而饮食易对氯吡格雷吸收和分布产生影响，在中国人群中，饮食对氯吡格雷吸收影响的研究尚未见报道，因此，研究高脂高热量饮食对硫酸氢氯吡格雷片药动学的影响对国内临床用药方案制订具有重要的临床意义。

2.材料

2.1仪器

API-4000型三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源（ESI）以及Analyst1.4.2数据处理软件（美国AppliedBiosystemSciex公司）；Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、在线脱气）；XS105DU型分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）；HeraeusBiofugeStratos高速低温离心机（美国Thermo公司）；VortexGenie-2涡旋混合器（美国ScientificIndustries公司）；Milli-Q纯水机（美国MILLIPORE公司）；MDF-U32V（N）低温冰箱（日本SANYO公司）；移液器（德国Eppendorf公司）。

2.2药品与试剂

硫酸氢氯吡格雷对照品（批号100819-201102，含量99.5%）购自中国食品药品检定研究院，内标硫酸氢氯吡格雷-d4对照品（批号6-AAH-193-1，含量98%）购自TorontoResearchChemicalsInc。

硫酸氢氯吡格雷片（波立维®，规格75mg·片-1，批号1A024）由SanofiWinthropIndustrie生产，赛诺菲安万特（杭州）制药有限公司分装。

乙腈，色谱纯，购自TEDIACOMPANY，INC公司；甲酸，色谱纯，购自Aladdin；灭菌注射用水，购自石家庄四药有限公司。

空白血浆来自健康受试者。

3.方法

3.1试验设计

选择男性健康受试者60名，年龄为（22±3）岁，体重为（64.0±6.9）kg，身高为（1.71±0.06）m，体重指数为（21.8±1.5）kg·m-2，受试者在受试前2周和试验期间没有服用任何药物，均无烟酒嗜好。

试验前进行病史询问和体格检查，血压、血糖，心、肾、肝功能，尿、血常规检查均正常。

本试验方案经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准。

受试者了解试验目的、意义及可能发生的不良反应后签署知情同意书。

60名健康受试者随机分成2组，采用随机、开放、双周期交叉试验设计，清洗期为1周。

给药前一天受试者禁食过夜10h后，试验当天早晨一组受试者空腹口服波立维®（75mg·片-1）1片，另一组受试者进食高脂高热量试验餐，进食在30min内完毕，从进食第一口起计时，30min后服用波立维®（75mg·片-1）1片，240mL温开水送服。

给药后4h、10h统一进食标准餐。

于用药前和用药后20min、40min、60min、80min、100min、120min、140min、160min、3h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、36h由肘静脉取血4mL，血样置肝素锂抗凝真空采血管中，混匀，离心（4000r·min-1，4℃）5min，分离上层血浆，于-70℃冰箱中保存，待测。

3.2色谱及质谱条件

选用WATERS公司Xterra®RP18（4.6mm×100mm，3.5μm）色谱柱，PhenomenexSecurityGuardTMC18（4.0mm×3.0mm）预柱。

流动相A为有机相（乙腈），B为水相（0.1%甲酸水溶液），梯度洗脱：

0-2.5min，B68%，2.5-2.6min，B68%-95%；2.6-3.6min，B95%，3.6-3.7min，B95%-68%；3.7-5.5min，B68%。

柱温为40℃，流速为1.0mL·min-1，进样体积为50μL，每个样本的分析时间为5.5min。

选用电喷雾（ESI）离子源，在正离子电离模式下，采用多反应监测（MRM）的质谱扫描方式，检测离子分别为：

m/z322.1→212.0（氯吡格雷）和m/z328.1→218.1（氯吡格雷-d4）。

解簇电压（DP）为60eV，碰撞能量（CE）为23eV，扫描时间为200ms。

碰撞气（CAD，N2）压力：

83kPa，气帘气（CUR，N2）压力：

206kPa，雾化气（GS1，N2）压力：

379kPa，加热辅助气（GS1，N2）压力：

345kPa，电喷雾电压（IS）：

2000eV，温度：

550℃。

3.3血浆样品处理

吸取200μL含药血浆，加入50μL氯吡格雷-d4内标工作液（10μg·L-1），涡旋混匀后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋1min，于16000r·min-1、4℃离心10min。

吸取上清液至进样瓶中，按“3.2”项下进样测定。

3.4分析方法确证

3.4.1特异性

分别取氯吡格雷、氯吡格雷-d4（内标）对照品溶液、空白血浆、最低定量限血浆（LLOQ）样本、受试者服药后的含药血浆样本，按“3.2”及“3.3”项下方法处理与检测，特异性实验色谱图见图1。

氯吡格雷和内标的保留时间为2.20min和2.16min左右，空白血浆中的内源性物质不干扰氯吡格雷和内标的测定。

图1氯吡格雷（I）和氯吡格雷-d4（II）的典型MRM色谱图.

A.空白血浆；B.氯吡格雷纯品；C.氯吡格雷-d4纯品；D.最低定量限样本（LLOQ）加入内标；E.受试者口服75mg硫酸氢氯吡格雷片2h后的血浆样本加入内标.

3.4.2标准曲线、线性范围和定量下限

取空白血浆200μL8份，分别加入氯吡格雷系列工作溶液10μL，制备成质量浓度分别5、15、50、150、500、1500、5000、15000ng·L-1标准血浆样本，按“3.2”及“3.3”项下方法处理与检测，以血浆中氯吡格雷浓度为横坐标，氯吡格雷与内标的峰面积比值为纵坐标，进行回归运算，求得的典型直线回归方程为：

Y=1.76×C+0.00151（W=1/C2），r=0.9993。

结果表明氯吡格雷在5-15000ng·L-1范围内线性良好，定量下限为5ng·L-1，RSD为4.7%。

3.4.3精密度与准确度

分别取12、120、1200、12000ng·L-1低、中1、中2、高四个浓度的质控（QC）样本200μL，每浓度6样本，按“3.2”及“3.3”项下方法处理与测定，连续测定3个分析批，以随行标准曲线计算实测浓度，用Excel软件将同一浓度3批共18个样本的实测浓度进行单因素方差分析从而计算批內批间精密度，结果表明低浓度质控样本实测浓度的批内RSD为7.0%，批间RSD为13.1%，RE在-17.8%-16.6%范围内；中1浓度质控样本实测浓度的批内RSD为2.0%，批间RSD为7.2%，RE在-3.3%-8.5%范围内；中2浓度质控样本实测浓度的批内RSD为1.4%，批间RSD为1.7%，RE在0.6%-4.8%范围内；高浓度质控样本实测浓度的批内RSD为0.8%，批间RSD为9.0%，RE在-5.5%-3.7%范围内。

3.4.4基质效应

按“3.2”及“3.3”项下方法处理6个不同来源空白血浆（每个来源4样本），得到空白血浆基质后，分别加入低、中1、中2、高四个浓度的氯吡格雷对照品溶液及内标溶液，以其进样得到的峰面积除以相应浓度的氯吡格雷对照品溶液及内标溶液直接进样得到的峰面积，计算血浆中内源性物质对氯吡格雷和内标的绝对基质效应。

血浆中内源性物质对低、中1、中2、高四个浓度血浆样本中氯吡格雷的绝对基质效应分别为（72.4±5.5）%、（72.0±7.9）%、（72.4±8.3）%、（76.7±7.1）%；血浆中内源性物质对内标的绝对基质效应为（69.0±5.5）%。

内标归一化的基质效应因子[15]为（105.2±3.5）%、（104.9±5.2）%、（104.4±4.9）%、（109.3±3.7）%，不同血浆间基质效应RSD均小于15%。

3.4.5提取回收率

按“3.2”及“3.3”项下方法，处理氯吡格雷低、中1、中2、高四个浓度的QC样本，每浓度6样本，以其进样得到的峰面积除以空白血浆经处理后直接加入低、中1、中2、高四个相应浓度的氯吡格雷对照品溶液及内标溶液后进样得到的峰面积，计算血浆中氯吡格雷和内标的提取回收率。

低、中1、中2、高四个浓度血浆样本中氯吡格雷的提取回收率分别为（92.2±9.4）%、（95.9±5.9）%、（99.4±5.2）%、（94.2±6.1）%，血浆样本中内标的提取回收率为（99.3±5.1）%。

3.4.6稳定性实验

稳定性实验结果表明氯吡格雷临床采集的全血在冰块（0℃）、冰水浴（4℃）、室温放置（25℃）放置40min后与立即测定的样本相比，RE在±15%以内，仍然稳定。

氯吡格雷血浆QC样本在室温（25℃）放置4h、反复冻融（-70℃）3次及冰冻（-70℃）保存38天条件、自动进样器（4℃）放置24h后，稳定性良好。

血浆稳定性实验结果见表1。

表1氯吡格雷血浆样本稳定性实验结果（n=3，

）

放置条件

加入量/ng·L-1

测定值/ng·L-1

RSD/%

室温（25℃）放置4h

12

12.99±0.11

0.8

120

128.2±1.5

1.1

1200

1248±12

1.0

12000

11570±90

0.8

-70℃反复冻融3次

12

11.71±1.21

10.4

120

118.0±3.0

2.5

1200

1224±21

1.7

12000

12520±60

0.5

-70℃冰冻38天

12

11.45±1.0

8.8

120

124.3±3.2

2.6

1200

1252±19

1.5

12000

12780±160

1.2

自动进样器（4℃）放置24h

12

11.61±0.16

1.3

120

127.5±2.3

1.8

1200

1256±12

1.0

12000

11730±50

0.4

4.结果

4.1药动学参数

应用经方法学确证的HPLC-MS/MS法测定受试者的血药浓度，绘制空腹和餐后服药的平均血药浓度-时间曲线，见图2。

将浓度数据用DAS3.2.3软件计算药动学参数。

受试者空腹和进食高脂高热量早餐后服药的药动学参数见表2。

表2受试者在空腹和高脂高热量饮食后口服75mg硫酸氢氯吡格雷片后氯吡格雷的主要药动学参数（n=60,

）

参数

空腹

高脂高热量饮食

Cmax/ng·L-1

1440±2397

4155±2117

AUC0-36h/ng·h·L-1

2268±3887

8691±3628

AUC0-∞/ng·h·L-1

2324±3899

8816±3668

t1/2/h

5.7±4.7

8.8±3.8

tmax/h

0.7±0.5

1.7±0.7

Vd/L

520115±471187

118826±59077

Cl/L·h-1

82365±70072

9949±4017

MRT0-36h/h

3.0±1.8

3.6±0.9

图260名中国健康受试者空腹和进食高脂高热量早餐后口服硫酸氢氯吡格雷片75mg后的平均血药浓度-时间曲线

4.2饮食影响分析

采用SPSS17.0软件对主要药动学参数进行统计分析，空腹和进食高脂高热量早餐后口服硫酸氢氯吡格雷片的tmax经Wilcoxon检验有显著性差异（P<0.05）；t1/2、Vd和Cl进行配对t检验，结果表明均有显著性差异（P<0.05）；Cmax、AUC0-36h和AUC0-∞先进性对数转换后，再做配对t检验，结果表明均有显著性差异（P<0.05）。

5.讨论

5.1色谱条件的优化

检测方法建立过程中发现，代谢物氯吡格雷酸在甲醇下会转换为氯吡格雷，影响测定准确度，因此本试验选择乙腈作为有机相。

由于实验样本量很大，所以本实验建立了简便的乙腈直接沉淀蛋白的样品处理方法，但实验过程中发现由于沉淀法带入色谱-质谱系统的血浆内源性物质较多，会引起质谱响应的变化，响应会随分析时间而变小，因此将实验初期的等度洗脱改为梯度洗脱。

先在68%乙腈的等度洗脱条件下，使样本及内标色谱峰洗脱出色谱柱，再以95%乙腈冲洗色谱柱，以洗脱血浆内源性杂质，避免对后续样本的影响，然后再以68%乙腈平衡色谱柱。

经过方法学考核证明该方法重现性优于等度洗脱。

另外，本研究选用氯吡格雷的氘代同位素氯吡格雷-d4作为内标，两者基质效应接近，可抵消基质效应对测定准确度的影响。

5.2质谱裂解途径的解析

氯吡格雷及内标氯吡格雷-d4相应的产物离子全扫描质谱图见图3。

由于化合物结构中同位素的存在，在正离子扫描时，氯吡格雷可产生的Q1离子m/z包括322、323、324、325、326，而内标氯吡格雷-d4可产生的Q1离子m/z包括326、327、328、329，为避免氯吡格雷326离子对内标的干扰，因此内标的Q1离子m/z选择为328。

本试验选择的氯吡格雷监测离子为m/z322→212，在进行氯吡格雷裂解途径分析时，RobinsonA[16]和ShinBS[17]认为m/z212是由氯吡格雷的准分子离子丢失去质子氯苯（111Da）形成，而本实验发现此裂解途径推测有误。

由于本实验采用的是同位素内标，氯吡格雷-d4的裂解途径应与氯吡格雷相同，按照上述文献推测，内标的监测离子应为328→212，但是在图3（B）中未发现212的离子，响应最大的离子峰为218的离子，其次为190、158，因此推测氯吡格雷-d4的质谱裂解途径为氯吡格雷-d4的准分子离子m/z328通过逆狄尔斯－阿尔德反应，重排失去质量数为110的中性分子产生m/z218的基峰。

m/z218的基峰裂解失去羰基形成m/z190的碎片离子峰，m/z190的碎片离子峰进一步裂解失去-CH3OH，产生m/z158的碎片离子峰。

图3氯吡格雷（A）和内标氯吡格雷-d4（B）[M+H]+的二级全扫描质谱图.

5.2样本量计算

根据《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》，在进行进食对口服药物制剂药代动力学影响的研究时，一般选用10-12例受试者，但是由于氯吡格