微生物学实验复习.docx
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微生物学实验复习.docx
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微生物学实验复习
实验一无菌操作技术
【用接种环挑取菌种】
(1)左手持细菌斜面培养物,右手持接种环,将接种环进行火焰灼烧灭菌(烧至发红),然后在火焰旁打开斜面培养物的试管帽(管帽不能放在桌上),并将管口在火焰上烧一下;
(2)在火焰旁,将接种针轻轻插入斜面培养物试管的上半部(此时不要接触斜面培养物),至少冷却5s后,挑取少许培养物(菌苔)后,再烧一下管口,盖上管帽并将其放回试管架中;
(3)用左手迅速从试管架上取出A管,在火焰旁取下管帽,管口在火焰上烧一下,将沾有少量菌苔的接种环迅速放进A管斜面的底部(注意:
接种环不要碰到试管口边)并从下到上划一直线,然后再从其底部开始向上作蛇形划线接种。
完毕后,同样烧一下试管,盖上管帽,将接种环在火焰上灼烧后放回原处。
如果是向盛有液体培养基的试管和三角烧瓶中接种,则应将挑有菌苔的接种环首先在液体表面的管内壁上轻轻摩擦,使菌体分散从环上脱开,进入液体培养基中。
实验二培养基的制备消毒与灭菌
【培养基配制实验原理】培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。
人工制备培养基的目的,在于给微生物创造一个良好的营养条件。
【培养基配制要素】营养:
碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无机盐;适宜的酸碱度和一定缓冲能力;一定的氧化还原电位。
【培养基的分类】根据培养基成分,可分为天然培养基和合成培养基(天然培养基主要成分是复杂的天然有机物质,如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、LB等;合成培养基用化学成分完全了解的纯化合药品配制而成的培养基,如高氏一号培养基和查氏培养基)。
根据物理状态,可分为固体培养基(加入凝固剂,如1.5%~2.0%琼脂)、半固体培养基(加入少量凝固剂,如0.2%~0.7%琼脂)、液体培养基(不含任何凝固剂)。
根据培养基用途,可分为基础培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)、营养培养基(加富培养基)(添加了血清、血液等)、鉴别培养基(含有特定化合物或试剂。
某种微生物在这种培养基上培养后,它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应,根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。
如酪素培养基、伊红美蓝培养基)、选择培养基(利用微生物对某种化学物质的敏感性不同。
在培养基中加入这类物质,抑制不需要的微生物生长,而利用所需分离的微生物生长,从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。
如无氮培养基、马丁氏培养基)。
[加富培养基与选择培养基的区别]
加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量,使其形成生长优势,从而分离到该种微生物;选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长,使其需要的微生物增殖,从而达到分离所需微生物的目的。
【培养基制备步骤】称量,溶化,补充水分、调pH,过滤,分装,加塞,包扎,灭菌,搁置斜面,无菌检查。
【培养基制备注意事项】
1、称量药品时,严防药品混杂。
称完一种药品后需要将牛角匙洗净、擦干,再称取另一药品。
瓶盖也不要盖错。
2、药品不要弄错。
如:
K2HPO4和KH2PO4、水合形式和无水形式的化合物要注意分辨。
3、培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。
因此,在混合培养基成分时,一般是按配方的顺序依次溶解各成分,甚至有时还需要将两种或多种成分分别灭菌,使用时再按比例混合。
4、对于微量成分,可以先配制成高浓度的储备液,按比例换算后再加入。
5、琼脂溶化过程中,要控制火力并不断搅拌,以免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。
6、不可用铜或铁锅加热溶化,以免离子进入培养基。
7、调pH值前先补足水分。
8、pH不要调过头,以免回调影响离子浓度。
9、固体分装不超过试管高度的1/5,不超过三角烧瓶容积的一半。
10、分装过程中,注意不要将培养基沾在管(瓶)口上以免污染棉塞而引起的污染。
11、配好培养基后要贴上标签,写清培养基类型、组别、配置时间。
【消毒与灭菌】
消毒是指采用物理、化学和生物的方法消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体的过程。
灭菌时指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。
1、加热灭菌:
(1)干热灭菌:
利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的,有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。
(2)湿热灭菌,0.1MPa,121℃,15~30min。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸气急剧将锅内冷空气从排气阀中趋尽,关闭排气阀,继续加热。
由于水蒸气无法排出,增加了灭菌锅内的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。
(细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。
在菌体受热时,当环境和细胞内的含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之凝固缓慢。
因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度要高,160~170℃,时间要长,1~2h,但干热灭菌温度不能超过180℃,否则,包裹器皿的纸或棉塞就会烧焦,甚至引起燃烧。
)
[在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大]
原因一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因为蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低;二是湿热的穿透力比干热大;三是湿热的水蒸气有潜热存在。
[高压蒸汽灭菌注意事项]
(1)使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气的膨胀大于水蒸气的膨胀压,所以,当水蒸气中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸气的温度低于饱和蒸汽的温度。
(2)当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼洒在工作腔体,要立即换水,冲洗腔体,仔细擦干锅盖垫圈上的水滴,否则他们会带来腐蚀和变质。
(3)要检查压力表上的指数为“0MPa”后才能打开锅盖。
(4)外来物质(金属、液体)不能堵塞通风孔,否则会引起装置故障、起火、短路。
2、过滤除菌:
通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。
最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分,但由于滤量有限,所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。
3、辐射灭菌:
(1)放射线辐照灭菌。
(2)紫外线灭菌:
用紫外灯进行的。
波长为200~300nm的紫外线都具有杀菌能力,其中以260nm的杀菌力最强;在波长一定的条件下,紫外线杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。
[紫外线杀菌机理]
因为紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联,从而抑制了DNA的复制;另一方面,由于辐射能使空气中的氧电离成[O],再使O2氧化生成臭氧或使水氧化生成过氧化氢。
臭氧和过氧化氢都具有杀菌作用。
[紫外线灭菌注意事项]
紫外线穿透力不大,所以,只适用于无菌室、接种箱,手术室内的空气及物体表面的灭菌,紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜;为了加强紫外线灭菌效果,在打开紫外灯前,可在无菌室内喷洒3%~5%石炭酸溶液,一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落,另一方面也可以杀死一部分细菌;无菌室的桌面、凳子可用2%~3%的来苏尔擦洗,然后再打开紫外灯照射即可增强杀菌效果。
【消毒与灭菌的注意事项】
1、灭菌的试管培养基冷至50℃左右再搁置,以防斜面上冷凝水太多。
2、斜面长度不超过试管总长的一半。
3、将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24~48h,以检查灭菌是否彻底。
【思考题】
1、培养基配制好后,为什么必须立即灭菌?
如何检查灭菌后的培养基是否为无菌?
答:
(1)如果不立即灭菌会使杂菌在培养基上生长,污染培养基。
一旦细菌污染了培养基,由于培养基有丰富的营养物质,细菌会在短时间内大量产生,这样就会消耗掉一部分营养物质;另一方面,杂菌生长过程中会产生有毒物质,影响后续培养物的生长。
(2)将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24~48h,以检查灭菌是否彻底。
2、如果要配制一种含有某抗生素的固体培养基,其中抗生素的终质量浓度(或工作浓度)为50微克/mL,你将如何操作?
(提示:
抗生素在高温下易失效)
答:
(1)配制成高浓度的抗生素储备液,按比例换算后再加入
(2)分别灭菌,抗生素用过滤除菌法灭菌,其他固体培养基成分用高压蒸汽灭菌法灭菌,使用时再混合。
实验三细菌的简单染色
【简单染色】
简单染色指利用单一染料对菌体进行染色。
染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物,前者赋予染料颜色特征,后者使染料能形成盐。
常用的微生物细胞染料都是盐,分酸性染料(酸性复红、伊红、刚果红)和碱性染料(美蓝、结晶紫、碱性复红、番红、孔雀绿)。
【微生物染色原理】
在中性、碱性和弱酸性溶液中,细菌细胞通常带负电荷;碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷,易与细胞结合使其着色;细胞处于酸性条件下(如细菌分解糖类产酸),所带正电荷增加,可采用酸性染料染色。
【简单染色步骤】
涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥、镜检。
1、涂片:
取一块干净的载玻片,平放,在载玻片中央滴一小滴生理盐水;用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔;用挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。
[注意事项]载玻片要洁净无油迹;滴生理盐水或取菌不宜过多;涂片要涂抹均匀,不易过厚。
2、干燥:
将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥,也可用吹风机低温吹干。
3、固定:
将已干燥的涂有菌膜的载玻片,涂面朝上,在酒精灯火焰上通过2~3次。
[固定原理]加热使细菌细胞的蛋白质凝固,从而固定细菌细胞形态,并使之牢固附着在载玻片上。
[注意事项]热固定温度不宜过高,否则会改变甚至破坏细胞形态。
4、染色:
将热固定的细菌涂片平放于载玻片架上,滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。
[染色时间]吕氏碱性美兰1~2min;石炭酸复红1min;草酸铵结晶紫1min。
5、水洗:
手持细菌染色涂片,置于废液缸上方,用洗瓶中自来水冲洗涂片,直至流下的水无色为止。
[注意事项]水洗时,不要直接冲洗涂面,而应使水从载玻片的一端流下;水流不宜过急,过大,以免涂片薄膜脱落。
6、干燥:
(1)自然干燥:
平放于室温,自然干燥;
(2)吹干:
用电吹风冷风或低温热风;(3)吸干:
平放在一张吸水纸上,上面覆盖一张吸水纸,将细菌涂面两面水分吸干。
7、镜检。
[注意事项]涂片干后镜检(防止水的折射,以便于观察)。
【油镜观察步骤】
1、下降载物台,转动转换器将油镜转至镜筒正下方。
2、在标本镜检部位滴上一滴香柏油。
3、从侧面注视,慢慢转动粗调螺旋,小心上升载物台,使油镜浸入油中,并几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本,以免压碎玻片,甚至损坏油镜镜头)。
4、调节聚光器及照明后,眼看目镜,微微转动粗调螺旋,当视野中有模糊的标本物象时,改用细调螺旋,并移动标本直至标本物象清晰为止。
5、使用完毕后,先用擦镜纸擦去镜头上的油,再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去镜头上残留油迹,最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。
【油镜工作原理】
1、增加照明亮度:
香柏油的折射率与玻璃相仿,可以减少通过光线的损失(使用油镜时,油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间,不是一层空气,而是隔一层油质,称为油浸系;如果玻片与物镜之间的介质为空气,则称为干燥系)。
2、增加显微镜的分辨率:
香柏油的折射率大于空气和水,使油镜的数值孔径值高于低倍镜和高倍镜,分辨能力增强(分辨率是指显微镜能辨别物体两点间的最小距离的能力,能辨别两点间最小距离=λ/2N·A,λ=光波波长;数值孔径是光线投射到物镜上的最大角度的一半正弦,乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积,N·A=n·sin(α/2),n=介质折射率,α=最大入射角,即镜口角)。
【油镜观察注意事项】
1、高倍镜下找到样品后再用油镜观察;
2、滴加香柏油后,先从侧面注视,调节粗准焦螺旋将镜筒小心下降,不要因下降镜头时用力过猛或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片,下降至几乎与标本接触时为止,注意切勿压到标本,以免压碎玻片,甚至损坏油镜镜头;使用完毕后,要用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上残留油迹。
实验四革兰氏染色法
【革兰氏染色法的原理】革兰氏染色实验是根据革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁的结构和组成成分不同而设计的。
当用结晶紫初染后,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂,能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚,类脂含量低,用乙醇脱色时细胞壁脱水,使肽聚糖的网状结构孔径缩小,透性降低,使结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
而革兰氏阴性菌由于细胞壁肽聚糖层较薄,类脂含量高,所以脱色时,类脂质被乙醇溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘复合物容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞染上复染剂的红色。
【革兰氏染色步骤】
制片,初染,媒染,脱色,复染,镜检。
1、制片。
[注意事项]
(1)要用活跃生长期的培养物进行革兰氏染色(因为革兰氏染色法是根据两类细菌细胞壁的结构和组成成分不同而将它们鉴别的,当菌体处于活跃生长期时,细胞壁的成分和结构最为典型,若菌龄太老,细胞壁的成分和结构都发生了变化,用老龄菌经常会出现假阳性或者假阴性的结果,特别是革兰氏阳性菌,如果培养时间过长,部分菌自行溶解或死亡,很容易呈阴性反应)。
(2)滴生理盐水和取菌不宜过多,涂片要均匀,不宜涂过厚,以免脱色不完全造成假阳性。
2、初染:
将玻片置于玻片架上,加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度),染色1~2min,倾去染色液,用自来水小心地冲洗。
3、媒染:
滴加碘液冲去水迹,再染1~2min,水洗。
4、脱色:
滴加95%乙醇,脱色20~30s立即水洗,终止脱色。
5、复染:
滴加番红,染色2~3min,水洗,最后用吸水纸轻轻吸干。
6、干燥后,置于显微镜下镜检。
若被染成蓝紫色,则为革兰氏阳性菌;若被染成红色,则为革兰氏阴性菌。
【革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较】
成分
G+
G-
肽聚糖
含量很高(50~90%)
含量很低(~10%)
磷壁酸
含量较高(<50%)
无
类脂类
一般无(<2%)
含量较高(~20%)
蛋白质
无
含量较高
【你认为哪些环节会影响革兰氏染色的正确性?
最关键的环节是什么?
】
(1)培养物的状态(取活跃期菌种);涂片不能太厚(太厚会脱色不完全而造成假阳性);染色的时间;脱色的时间。
(2)最关键的是脱色环节。
脱色时间一般为20~30s,脱色不足,阴性菌误染成阳性菌;脱色过度,阳性菌误染成阴性菌。
【现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应,怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色,以证明你的染色结果正确性?
】
可将此粗壮杆菌分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为混合涂片染色。
如果混合涂片上大肠杆菌呈红色,金黄色葡萄球菌呈蓝紫色,就说明染色结果是正确可靠的,因为已知大肠杆菌是革兰氏阴性菌,金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌,而在一张混合涂片上所有菌体的初染、媒染和脱色、复染过程都是同样完成的。
因而根据粗壮杆菌被染成了蓝紫色或红色就可以判断它是革兰氏阳性菌或阴性菌。
【革兰氏染色时,初染前能加碘液吗?
】
不能。
若初染前加碘液,碘就会和染料结合成复合物,使得染料分子不能穿过细胞壁进入细菌,达不到初染的效果。
【获得本实验成功的关键(注意事项)】
(1)选用活跃生长期菌种染色,老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
(2)涂片不易过厚,以免脱色不完全造成假阳性。
(3)脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性。
实验五细菌的荚膜染色
【荚膜染色的基本原理】
荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质,含水量高,其成分为多糖、糖蛋白或多肽;由于荚膜与染料的亲和力弱,不易着色,而且可溶于水,易在用水冲洗时被洗去,所以通常用衬托法染色(负染色法),使菌体和背景着色,而荚膜不着色,在菌体周围形成一透明圈;也可采取Anthony氏染色法,用结晶紫使细胞和荚膜都着色,再用硫酸铜水溶液冲洗,荚膜被脱色,但硫酸铜吸附在荚膜上呈淡蓝色,与深紫色的菌体区分。
【荚膜染色的方法】
1、湿墨水法:
制备细菌墨水混合液→加盖玻片→镜检。
结果:
背景灰色,菌体较暗,菌体周围荚膜呈现明亮透明圈。
2、干墨水法:
制备细菌墨水混合液→涂片→固定→染色→镜检。
(涂片时用两张载玻片,将混合液滴在载玻片一端,用另一张推片向混合液另一端平行滑动,使混合液铺成薄膜。
)
(甲醇固定,自然干燥)
[注意事项]固定和干燥均不能加热和用热吹风吹干,因为荚膜含水量高,加热会使其失水变形;同时,菌体失水收缩,会与周围染料脱离产生透明区,导致不产荚膜的细菌被误认为有荚膜。
甲基紫染液染色1~2min
结果:
背景灰色,菌体紫色,菌体周围荚膜呈现明亮透明圈。
3、Anthony氏法:
制片→固定→染色→镜检。
1%结晶紫染液染色2min,20%硫酸铜溶液脱色
结果:
背景灰色,菌体深紫色,菌体周围荚膜淡紫色。
实验六细菌的芽孢染色法
【芽孢】芽孢又称内生孢子,是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体,通常呈圆形或椭圆形;细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等是鉴定细菌的依据之一。
【芽孢的基本构造】从外向内依次为孢外壁、芽孢衣、皮层、芽孢壁、芽孢质膜、芽孢质、芽孢核区。
【关于芽孢】
1、形成芽胞需要一定的外界条件,这些条件因菌种而异。
炭疽芽孢杆菌在有氧条件下才能形成芽孢,而破伤风杆菌在无氧条件下形成芽孢。
2、芽孢对恶劣环境条件有很强的抵抗能力,尤其耐高温。
如肉毒梭状芽孢杆菌的芽孢,在沸水中可存活6h,在180℃的干热中,芽孢保持活力数年至数十年之久。
高温灭菌的主要目的就是杀死细菌的芽孢。
3、芽孢在适宜条件下萌发成新个体,但芽孢只产生一个营养体,所以芽孢不是一种繁殖方式。
【细菌芽孢的染色原理】细菌的芽孢具有厚而致密的壁,不易着色,若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色(芽孢呈无色透明状);芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点设计的;所有的芽孢染色法都基于同一个原则——除了用着色力强的染料外,还需要加热,以促进芽孢着色,再使菌体脱色,而芽孢上的染料难以渗出,故保留原有的颜色,然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽孢呈现出不同的颜色。
【细菌芽孢染色方法】
(1)Schaeffer-Fulton氏染色法:
制片→染色→脱色→复染→镜检。
5%孔雀绿染液加热染色,开始冒蒸汽时开始计时,维持5min;注意补充染液以免涂片干燥;0.5%番红复染2min。
(2)改良版Schaeffer-Fulton氏染色法:
改良步骤:
在EP管中制备菌悬液→EP管中加孔雀绿,沸水浴15~20min加热染色→制片固定。
实验七放线菌形态的观察
【放线菌】放线菌是一类具有丝状分枝的单细胞,主要以外生孢子的形式繁殖,革兰氏阳性,与细菌同属原核微生物。
放线菌菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状呈放射状生长,并因此而得名。
放线菌有特殊的土霉味。
分布:
含水量较低、有机物丰富、呈微碱性的土壤中。
每克土壤中约含放线菌孢子10*7个。
应用:
放线菌最突出的贡献就是它能产生大量的、种类繁多的抗生素;放线菌还是酶类、维生素的生产菌;有的放线菌有固氮能力;放线菌在自然界物质循环中也起重要作用,因为它们具有较强的分解复杂有机物的能力,对于土壤肥力的提高也有重要作用。
危害:
只有少数放线菌对人类构成危害,某些放线菌属菌种引起动物放线菌病(皮肤、脑、肺和足部感染),某些诺卡氏菌属菌种引起人和动物的诺卡氏菌病;还有少数放线菌能引起植物病害。
【放线菌结构】
菌落从外向内:
孢子丝、气生菌丝、营养菌丝(培养基内)。
营养菌丝:
又称基内菌丝、基质菌丝或一级菌丝,是孢子发芽后不断伸长、分枝并放射状在培养基内部和表面形成的大量色浅、较细的具有吸收营养和排泄代谢废物功能的丝状结构。
气生菌丝:
又称二级菌丝,是由基内菌丝向上向空间方向分化形成的颜色较深、直径较粗的分枝菌丝。
孢子丝:
是由气生菌丝分化形成的各种形状和着生方式的丝状结构。
营养菌丝
气生菌丝
位置
在培养基内和表面,位于下层。
在培养基上方,位于上层。
颜色
浅
深
直径
细
粗
【放线菌制片方法】
1、插片法:
(1)原理:
将放线菌接种在琼脂平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。
观察时,轻轻取出盖玻片,置于载玻片上直接镜检。
这种方法可以观察到放线菌自然生长状态下的特征,而且便于观察不同生长期的形态。
(2)步骤:
倒平板→接种→插片(无菌操作用镊子将灭菌盖玻片以大约45°角在接种线上插入琼脂内)→培养(将插片平板倒置,28℃培养3~5天)→镜检(用镊子小心拨出插片,用纸擦去背面培养物,将有菌的一面朝上放在载玻片上,直接显微镜观察)
[注意]宜用略暗光线;先低倍后高倍观察;染色后效果更好。
2、玻璃纸法:
(1)原理:
玻璃纸是一种透明的半透膜,具有半透膜特性,其透光性与载玻片的基本相同,将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表面,然后将放线菌接种于玻璃纸上,经培养,放线菌在玻璃纸上形成菌苔。
观察时,揭下玻璃纸,固定在载玻片上直接镜检。
这种方法既能保持放线菌自然生长状态,也便于观察不同生长期的形态特征。
(2)步骤:
倒平板→铺玻璃纸(无菌操作用镊子将灭菌的玻璃纸铺在高氏1号琼脂表面,用无菌玻璃涂布棒将玻璃纸压平)→接种(用接种环挑取菌种斜面培养物在玻璃纸上划线接种)→培养(将平板倒置,28℃培养3~5天)→镜检(在洁净载玻片上滴一滴水,用镊子小心取出玻璃纸,菌面朝上平贴在载玻片上,显微镜观察)。
[注意]勿碰动玻璃纸菌面的培养物;玻璃纸与玻片间勿留气泡;先低倍再高倍观察。
3、印片法:
(1)原理:
将要观察的放线菌的菌落或菌苔,先印在载玻片上,经染色后观察。
这种方法主要用于观察孢子丝的形态、孢子的排列及其形状等。
(2)步骤:
倒平板→接种→培养→印片(用接种铲或解剖刀将菌苔连同培养基切下一小块,菌面朝上放在载玻片上,取另一块载玻片在酒精灯上略微加热后,盖在菌苔上轻轻按压,使培养物——气丝、孢子丝、孢子,黏附在微热的载玻片上,印迹朝上,通过酒精灯火焰2~3次固定)→染色(用石炭酸复红染1min)→镜检。
[注意]印片时,不要用力太大压碎琼脂,也不要错动,以免改变放线菌形态。
实验八酵母菌形态观察和死活细胞鉴定
【酵母菌形态、大小、结构】酵母菌是单细胞真菌,并非系统演化分类的单元;酵母菌细胞的形态通常有球行、卵圆形、腊肠形等;比细菌的单细胞个体要大得多,一般为1~5微米×5~20微米;酵母菌无鞭毛,不能游动;酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、液泡、线粒体等,有的还具有微体。
【死活细胞鉴别原理】酵母活细胞可以进行新陈代谢,具有还原能力,可以将美蓝(蓝色)还原成无色,因此死细胞呈蓝色,活细胞呈无色。
【酵母菌繁殖方式】
(1)无性繁殖:
芽殖、裂殖、无性孢子(节孢子、掷孢子、厚垣孢子、芽生孢子)。
(2)有性繁殖:
子囊孢子。
【方法】
1、美蓝浸片的观察:
(1)步骤:
在载玻片中央滴加一滴吕氏碱性美蓝染色液,用接种环挑取少量酵母菌苔,混合均匀;用镊子取一块盖玻片,先将一边与菌液接触,然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上;将制片放置约3min,先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况,并根据颜色区别死活细胞;染色30min后再次观察,注意死活细胞数目的变化;用其他浓度的吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。
[注意]染液要取适量,过多会溢出,过少会产生大量气泡;盖玻片不宜平着放下。
(2)在一个视野里计数死细胞
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