TRIzol法提RNADNA和蛋白质.docx
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TRIzol法提RNADNA和蛋白质
TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA
TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离
一个样品的蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶
解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA勺完整性。
在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。
取出水相用
异丙醇沉淀可回收RNA用乙醇沉淀中间层可回收DNA用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品(50-100mg组织、5X106细胞)也适用于大量样品(》1g组织、>107细胞)。
对人,动物,植物组织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无蛋白质和DNA亏染,可用于NorthernBlot,dotblot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase
的DNasel处理RNA羊品,避免出现假阳性。
共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA勺得率,也可用于PCR和酶切。
蛋白质可用于WesternBlotting。
规格:
100ml黄色透明液体
储存条件:
2-8C避光保存12个月
注意:
请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
忌用乙醇擦洗,乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase?
亏染注意事项:
1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。
2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。
3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150C烘烤4小时,塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.01%v/v,放置过夜,高压灭菌。
注:
DEPOT致癌之嫌,需小心操作。
)
RNA勺提取
准备试剂:
氯仿,异丙醇,75%乙醇,无RNase的水或0.5%SDS溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤:
1.匀浆处理:
a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10%。
b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。
TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。
TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA亏染。
c.细胞悬液离心收集细胞,每5-10X106动物、植物、酵母细胞或
1X107细菌细胞加入1mlTRIzol,反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRN降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30C)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:
如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌
肉,植物结节部分等)可于2-8C10000Xg离心10分钟,取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA上清中含有
RNA处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置
3分钟。
6.2-8C10000Xg离心15分钟。
样品分为三层:
底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
7.把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进
一步操作见后。
用异丙醇沉淀水相中的RNA每使用1mlTRIzol加
入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8.2-8C10000Xg离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
移去上清。
9.用75%乙醇洗涤RNA沉淀。
每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇。
2-8C不超过7500Xg离心5分钟,弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA勺溶解性大大降低。
加入25-200卩I无RNase勺水或0.5%SDS用枪头吸打几次,55-60C放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。
RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解,-70C保存。
注意事项:
1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA0寸可加入少许糖原以促进RNA沉淀。
例如加800mlTRIzoI匀浆样品,沉淀RNA前加5-10卩gRNase-free糖原。
糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCF反应。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70C保存至少一个月。
RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8C一星期以上或-5至-20C一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600Xg离心30-60分钟。
预期产量:
1mg组织或1X106细胞提取RNA分别为:
肝和脾6-10卩g,肾3-4卩g,骨骼肌和脑组织1-1.5卩g,胎盘1-4
卩g,上皮细胞8-15卩g,成纤维细胞5-7卩g。
常见问题分析:
得率低:
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.RNA沉淀未完全溶解
A260/A280V1.65:
A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于
了TE中。
低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
B.样品匀浆时加的试剂量太少
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟
D.吸取水相时混入了有机相
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA亏染:
A.样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSC等),强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染:
沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。
这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA从含
有大量多糖的植物中提取RNA寸应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。
DNA勺分离
准备试剂:
乙醇0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)75%乙醇8mMNaOH操作步骤:
1.样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中
的DNA每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分
钟,2-8C不超过2000Xg离心5分钟。
2.移去上清,(如需分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含
10沱醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。
每用1mlTRIzol加入1ml
柠檬酸钠,室温放置30分钟,2-8C2000Xg离心5分钟,弃上清,重复一次。
3.用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1mlTRIzol加入1.5-2ml75%
乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8C2000Xg离心5分钟,弃上清。
4.室温放置晾干DNA5-15分钟,用8mMNaOH溶解DNA从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600卩l8mMNaOHDNA的浓度通常为0.2-0.3卩g/卩l。
提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaO的pH值为9,溶解DNA后可用TE,HEPE碉节pH从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000Xg离心10分钟除去。
DNA勺定量:
取一份溶于8mMNaOH勺DNA加水测A260值。
一单位A260
值相当于50卩g/ml双链DNA根据DNA产量可估计细胞数,人,大
鼠,小鼠1X106二倍体细胞含DNA勺量分别为7.1卩g,6.5卩g,5.8卩g。
预期产量:
1mg组织或1X106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4卩g骨骼肌,脑组织,胎盘2-3卩g人,大鼠,小鼠培养细胞(1X106)5-7
□g成纤维细胞5-7卩g
应用:
1.用于PCR溶于8mMNaOH勺DNA用0.1MHEPE碉pH至8.4,取0.1-1□gDNA用作模板。
2.酶切反应用HEPES或1mMEDTAS节pH至适当值。
每□gDNA使
用3-5单位的酶,80-90%的DNA是可消化的。
1ml8mMNaOH溶解的DNA样品pH值调节
FinalpH0.1MHEPES(□l)FinalpH1MHEPES(□l)
8.4867.223
8.2937.032
8.0101
7.8117
7.5159
注意事项:
1.DNA在中间层和有机相中时可在2-8C保存过夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2-8C可保存几个月。
3.DNA在8mMNaO溶液中4C可放置过夜,如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM可置于4C或-20C长期保存。
常见问题分析:
得率低:
A.样品匀浆和裂解的不彻底
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解
A260/A280V1.70:
A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于
了TE中
B.酚除去的不彻底,可用0.1M柠檬酸钠(含10沱醇)再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解:
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪
RNA亏染:
A.氯仿分层后水相去除的不干净
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠(含10沱醇)洗的不彻底
蛋白质的提取
准备试剂:
异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS操作步骤:
1.取沉淀DNAB剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。
每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2-8C12000Xg离心10分钟弃上清。
2.用含0.3M盐酸胍的95临醇洗涤蛋白质沉淀。
每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2-8C7500Xg离心5分钟,弃上清,重复两次。
用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟,用1%SD溶解蛋白质,反复吸打,50C温浴使其完全溶解,不溶物2-8C10000Xg离心10分钟除去。
分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20C保存备用。
注意事项:
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%L醇或无水乙醇中2-8C一个月以上或-5至-20C一年以上。
2.用0.1%SDS在2-8C透析三次,10000Xg离心10分钟取上清即可用于WesternBlot。
常见问题分析:
得率低:
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解蛋白质降解:
组织取出后没有马上处理或冷冻电泳时条带变形:
蛋白质沉淀洗涤不充分
Trizol
Trizol试剂是可即用的从动物、植物细胞和组织或微生物中提取总
RNA的试剂。
在样品裂解或匀浆过程中,Trizol可溶解细胞内含物,同时具有使蛋白变性、抑制RNase活性的作用,保持RNA的完整性。
可以从富含多糖、脂肪酸、蛋白质及RNase的样品中获得完整的RNA.经过Trizol试剂处理后的裂解物,仅仅只需加入氯仿混匀,离心后,便分为三种液相:
上层水相含有RNA中层的半固体相含有DNA下层的有机相含有少量的DNA和大量的蛋白质、多糖、脂肪酸和其它细胞碎片。
取出水相,用异丙醇可沉淀回收RNA,一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.6-1.8。
Trizol试剂可用于小量样品(50-100mg组织、5X106细胞),也可用于大量样品(>1g组织或>107细胞),对人、其它动物、植物和细菌组织都适用,整个操作步骤方便快捷,一个小时内即可完成反应,可同时处理大量不同样品。
提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染,可用于RT-PCRNorthernBlot、核酸酶保护实验、mRNA分离和体外翻译等。
包装清单:
Trizol50ml或者100ml说明书1份
保存条件:
2-8C保存,本试剂自订购之日起一年内有效。
注意事项:
1.所有离心管、枪头及相关溶液都必需无RNA酶污染。
耐高温器物可150C烘烤4小时以除去RNA酶,其它器物除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜,然后灭菌、烘干。
溶液需用灭菌的DEPCK配制:
加0.01%(体积比)DEPC至MiliQ级水中,处理过夜,灭菌即成DEPC水。
2.必需戴一次性手套操作,且尽量不要对着RNA羊品呼气或说话,以防RNA酶污染。
3.Trizol含有毒物质苯酚,避免接触皮肤或吸入。
为防止溅入眼睛,请戴防护眼镜或使用透明保护屏。
如皮肤接触Trizol,请立即用大量去垢剂和水冲洗,如仍有不适,请听取医生意见。
4.需自备氯仿,异丙醇,75%L醇(DEPC水配制),和DEPC水。
使用说明:
1.细胞裂解或组织匀浆。
a.贴壁细胞:
吸尽培养液,按照每10平方厘米细胞加入1mlTrizol,晃动3-5下,再用枪吹打2-3下,确保全部裂解,然后吸至离心管中。
b.悬浮细胞:
离心收集细胞,吸尽液体,每五百万至一千万动植物或酵母细胞,或一千万细菌,加入1mlTrizol适当vortex,确保全部裂解。
某些酵母和细菌如裂解不充分,可用匀浆器匀浆,或者用液氮研磨,确保全部裂解。
c.组织:
先将组织剪切成小块,放入普通玻璃匀浆器内,或者用液
氮研磨组织样品。
每50mg-80m昶织加入1mlTrizol,匀浆。
2.室温静置5-15分钟。
对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织,Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物,需12,000
xg,4C离心10分钟,然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中。
3.按照每毫升Trizol加入0.2ml氯仿,vortex混匀或猛烈晃动15秒,室温放置2-3分钟。
5.12,000xg,4C离心15分钟,然后吸取含总RNA的上层水相至
一新的离心管中,每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55ml。
6.按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇,颠倒数次混匀,室温沉淀10分钟。
7.12,000Xg4C离心10分钟,在管底可见胶状RNA沉淀,弃上清。
8.每毫升最初的Trizol加入1ml75%乙醇,vortex或颠倒混匀,
9.7,500Xg4C离心5分钟,弃上清。
再用离心机甩一下(>5,000rpm,离心1秒),小心吸尽液体。
10.待RNA略干后,加入20微升DEPC水溶解,-70C冻存。
注意,
切勿让RNA过分干燥,否则将极难溶解,且测出的A260/280值会低
于1.6。
问题指南
低得率:
A.样品裂解或匀浆处理不彻底;B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280V1.65:
A.检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。
低离子浓度和低pH条件下,A280值会较高;B.样品匀浆时加的试剂量太少;C.匀浆后样品未在室温放置5分钟;D.水相中混有有机相;E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:
A.组织取出后没有马上处理或冷冻;B.样品或提取的
RNA沉淀保存于-5--20C,未在-60--70C保存;C.细胞在胰酶处理时被破坏;D.溶液或离心管未经RNase去除处理;E.电泳时使用的甲酰氨pH低于3.5。
DNA污染:
A.样品匀浆时加的试剂体积太少;B.样品中含有组织溶剂(如乙醇,DMS等),强缓冲液或碱性溶液。
蛋白和多糖污染:
离心去上清后得到的RNA沉淀经以下操作应可去除这些污染:
在上一步中,每使用1mlTrizol,在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2NaCI)。
混合,离心,然后按照操作进行。
这种方法可使蛋白多糖和多糖留在溶液中,而高效沉淀出纯RNA从植物中提取RNA时,应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。
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