植物生理学中各项生理指标的测定方法.docx
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植物生理学中各项生理指标的测定方法
植物生理学中各项生理指标的
测定方法
.实验内容
实验1MDA(丙二醛)含量测定所需试剂:
10%三氯乙酸(TCA(纯)0.25%硫代巴妥酸
(纯)
实验2:
可溶性蛋白含量测定所需试剂:
考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸
实验3:
SOD超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂:
dl-甲硫氨酸(Met)NBTEDTA-Na2核
实验4:
CAT过氧化氢酶)活性(过氧化氢酶)测定所需试剂:
PBS(PH=7.0)30%H2O2
实验五:
Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性(即ASA-POD活性)测定所需试剂:
ASA(分子量167.12)(乙=胺四乙酸二钠)EDTA-Na2PBS(pH7.0)30%H2O实验6:
ASA(维生素C)含量测定
偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶
FeCI3(或FeCI3・6H2O
实验7:
GSH谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂:
NaH2PO42H2ODTNB(二硫代硝基苯甲酸)
PBS(PH6.8)
实验8:
脯氨酸测定所需试剂:
磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸
85%磷酸
试验9:
叶绿素含量测定。
80%丙酮
试验9:
GF活性测定
试验10:
过氧化氢含量测定。
三氯乙酸
试验11:
超氧阴离子含量测定
二.酶液和母液提取
1.酶液提取所需试剂:
50mmol/L磷酸缓冲液(PH=7.8)(内含1%(m/v)聚乙烯吡哆烷酮PVP),
O.lmmol/LEDTANa或EDTA,也可为(内含2%(m/v)PVP),
0.2mmol/LEDTANa或EDTA(先配制后用缓冲液定容)
2.ASA.GSH母液提取所需试剂:
5%偏磷酸
1.抗氧化酶酶液提取(SOD.POD.CAT:
1g(根据样品的量,少的可以适当减少)叶片加入预冷5ml.50mmol/L磷酸缓冲液(PH=7.8)
4°C冷冻15000g离心20分钟
上清液即为酶液(5C下保存一两天内备用,中短期用
-20C保存)
2.ASA.GSH母液提取:
0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液
4C冷冻14000g离心10分钟
上清液即为母液(5°C下保存备用)
(偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA)
酶液提取所需试剂:
PVP(聚乙烯吡哆烷酮):
1%(1g溶于100ml水),1000ml需称取10g,此处用PBS
EDTA-Na2:
0.1mmol/L(37.2mgEDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水),此处用PBS
PBS(缓冲液)配制方法:
①Na2HPO412H2O②NaHPO4・2H2O
取①71.64g,蒸馏水定容至1L,取②31.21g定容至1L,放置4C冰箱备用
PH=7.8取①91.5ml+②8.5ml=100ml(浓度0.2mol/L)
需要0.05mol/Lf将上述溶液烯释至400ml(0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V)
母液提取所需试剂:
5%偏磷酸:
称5g纯偏磷酸,定容至100ml蒸馏水(需加热溶解,温度在50-60C)偏磷酸有剧毒
(偏磷酸难溶解,先得用研钵提前研碎,后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容)
(现所用为38%HPQ所以需称65.7895g,定容至500ml)
三.实验步骤
实验1:
MDA含量测定
1.1所需试剂:
10%三氯乙酸(TCA(纯)称10g
定容至100ml
0.25%硫代巴妥酸(纯)称
0.25g用10%TCA定容至100ml
(配制时,可一次完成,先配TCA不要定容,再加入硫代巴比妥酸,然后定容,若难溶解,可以在磁力搅拌器上微热)
1.2步骤:
取0.3g叶片,加4ml磷酸缓冲液研磨,
加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸(溶于10%的三
氯乙酸)溶液
J摇匀
95°C加热15分钟
J快速冷却
3000g离心15分钟
取上清测定OD532,OD600,OD450值
按公式求MDA浓度=6.45X(OD32-OD。
。
)-0.56OD45°
(卩mol/L)
可溶性糖浓度=11.71XOD450(mmol/L)最后计算MDA含量(卩mol/gFW)=[4X(MDA浓度x)X10-3/0.1]
同时,可测得可溶性糖含量(mmol/gFW)=4X
(可溶性糖浓度x)X10-3/0.1
(用多波长测定,在测定之前一定要矫正基线,公式中
的参数可以直接在分光光度计上输入)注意:
以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零
MDA含量测定的改进
1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量,用量可以定为1.0、1.5或2.0(较好)ml。
2.硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸(溶于20%的三氯乙酸)溶液。
实验2:
可溶性蛋白含量
(参照Bradford方法测定),以BSA作为标准蛋白(牛血清蛋白)
2.1所需试剂及配制:
牛血清蛋白(BSA,考马斯亮蓝
G-250,95%^醇,85%磷酸
考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制:
称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml95%L醇,加入100ml85%的磷酸,最后蒸馏水定容到1L,混匀,放置过夜,过滤后贮放在棕色瓶中,常温下可放置一个月。
•标准曲线制作:
1标准溶液配制:
称取10mg牛血清蛋白标准液,溶于蒸馏水,定容至100ml,制成100卩g/ml的标准液,4°C下保存备用。
(必须是牛血清蛋白向水中溶解,不能颠倒)
2取6支具塞试管(10ml),按下表配制含0-100卩g/ml的牛血清蛋白液各1ml(★调零管)
★123456
020406080100
(卩g)
3各试管加入5mlG-250染色剂,翻转混合,放置2分钟'595nm比色,绘制过原点标准曲线(方程式)。
(相关系数要两个9以上)
2.2步骤:
1标准曲线(参考邹琦)(595nm比色)
注意:
制作通过原点的标准曲线,以含0卩g蛋白质液
调零
2取0.1g样品,加5ml蒸馏水提取,5000g离心10分钟,取上清1ml测定
31ml样液+5mlG-250液盖塞翻转混合数次,最后595nm比色,直接从标准曲线读含量。
(此方法反应十分迅速,2分钟即达到平衡,其结合物在室温下1小时内保持稳定)
实验3:
SOD酶活性
3.1步骤:
1.取50卩l酶液
1加入2ml39mmol/L甲硫氨酸(Met)
22ml0.225mmol/LNBT,(氮蓝四唑)
31ml0.6mmol/LEDTA-Na?
(①②③可以配制在一个试剂瓶里)
41ml0.012mmol/L核黄素,摇匀。
(现配现用)
2.(人工培养箱内)4000Lx日光灯下放置30分钟后,
温度控制在30°C,于暗处终止反应。
(用大烧杯套着小烧杯,将试管放在同心圆内,每隔
5min转过90度,转四次。
对照(不加酶液)每次至少对称地放3支,调零的不照光和不加酶液)
3.560nm处测吸光值,酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。
(实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后,一次加入5ml,然后依次加入核黄素和酶液,以不加酶液的照光管为对照。
)_
3.2所需试剂:
dl-甲硫氨酸(Met)39mmol/L1.1638g/g00ml以NBT0.225mmol/L(0.01840均克)/100ml
0.0368g/200ml
EDTA-Na0.6mmol/L0.0223g/100ml
核黄素0.012mmol/L0.0045g/L或
0.0045g/100ml用时稀释10倍
各试剂溶液均在用前配置,配置好后均应避光保存,尤其是核黄素,必须随用随配,避光保存。
试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法:
Met+NBT+EDTA-Na2
200mll+200ml+100ml
另外反应时间30分钟过长,改为20分钟适合
SOD舌性(酶单位u/gFW)=(A0-A1)*V/A0*0.5*FW*a
A0---对照照光管光吸收值;A1---样品管光吸收值。
V---样液总体积(ml)5mlFW---鲜重(g)1g
a---测定用样品的量(ml)0.1ml
实验4:
CAT活性(过氧化氢酶)
4.1所需试剂:
1PB(SPH=7.0)50mmol/L(61份50mmol/lNa2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4)
215mmol/L"0(以30%HQ配)
(取85.2卩L30%H2Q2,以50mmol/LPBS((PH7.0)定容至100ml)
4.2步骤:
1.3ml50mmol/LPBS(PH7.0)加入50卩l酶液
(加比色杯的盖子摇2-3下,让酶液与缓冲液充分分散)再加入5卩l15mmol/LH2Q摇匀(加比色杯的盖子摇2-3下,让酶液与缓冲液充分分散)。
2.240nm处作时间扫描(每0.5分钟测1次,共测3分钟)
3.CAT活性以每分钟消耗1卩mol的HO为一个酶活单位。
活性计算改动:
(以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u)(2005和2006年均是按OD值减少0.01算的)
(以每分钟OD直减少0.1为一个酶活单位u)
注意:
以PBS作空白调零50mmol/L
实验5:
APX活性(抗坏血酸过氧化物酶)(即ASA-POD舌性)
5.1所需试剂:
ASA(分子量167.12)0.3mmol=0.052836(g)(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2(以PBS配成0.1mmol/L=0.0372(g)/L)
50mmol/LPBS(pH7.0)
9mmol/LH2Q(以30%bD配制)
(51卩l30%H2Q2定容至100ml)
计算为:
K1=2.8,K2=3,K3=-1,K4=100可得到总取样(5ml酶液或1g样)的最终活性。
酶活性单位为卩mol/g(鲜重)・min
以后APX活性测定可参考沈文飚:
抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨
3ml反应液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA(或EDTA-Na2),0.1mmol/LH2O20.5(或0.3)mmol/LAsA最后加入适量酶液(20、50、100ul均可)启动反应,连续记录测定室温下290nm吸收值的变化。
以不加H2O2作为对照,H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。
室温下每分钟氧化1umolAsA的酶量作为一个酶活性单位(U)(吸光系数为2.8mmol/Lcm)
5.2步骤:
1.配反应液(50mmol/LPBS(pH7.0),内含0.1mmol/LEDTA-Na2,含0.3mmol/LASA)
2.样品
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