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222nm准分子灯对动物的影响研究
222rnnUV-C杀菌灯对易受紫外线辐射的小鼠的长期影响
概要
通常会主要发射254nm紫外线(UV)的杀菌灯用于表面消毒,但由于其会引起遗传毒性,因此不能用于人体皮肤。
作为替代方法,据报道,222-nmUVC具有与254-nmUVC相当的杀菌能力,而不会产生由紫外线引起的主要DNA损伤的环丁烷喀喔二聚体
(CPD)。
但是,尚无明确证据表明长期接触皮肤特别是在致癌方而具有安全性。
因此,我们使用缺乏干皮色素补充组A(Xpa)的高度光致癌表型小鼠,研究了222nmUVC对
皮肤的长期影响。
-)基因,涉及CPD的修复。
即使在高剂量的222-nmUVC照射下,
CPD的形成也只能被认为是表皮的最上层。
在没有观察到肿瘤XPA敲除小鼠和野生型小鼠通过反复照射222纳米UVC,使用其中已经表明在肿瘤产生的协议XPA敲除小鼠具有宽谱UVB照射。
此外,在222nmUVC暴露后,两只基因型小鼠均未观察到红斑和耳朵肿胀。
我们的数据表明,就皮肤癌的发展而言,222-nmUVC灯可安全用于人体皮肤消毒。
介绍
紫外线C(UVC)定义为波长100-280nm的紫外线。
太阳紫外线产生的UVC无法到达地球表面,因为该范围的紫外线被臭氧层吸收。
主要发射254-nmUVC的杀菌灯已用于灭菌,因为该波长可有效杀死细菌。
尽管254nmUVC灯可用于灭菌,但众所周知,它对皮肤和眼睛有害,分别导致红斑和角膜炎。
对人类和动物实验最关键作用的皮肤致癌致生殖毒性(1-4)o紫外线诱发的皮肤肿瘤的主要原因之一是在细胞DXA的双喀咤位点形成共价连接的二聚体,主要由环丁烷嗜咤二聚体(CPD)和啥咤(6-4)喀咤酮光产物(6-4PP)构成(§)。
双喀咤光产物实际上是基本上脱氨基的含胞喀咤的二聚体损伤,是高度易突变的DNA损伤,如果不修复会导致皮肤癌(0)。
尽管254nmUVC灯不是根据国际电工技术委员会的灯和灯系统的光生物安全性(IEC62471:
2006)的指导设计的,但会出现发射更短的UVC波长(207和222nm)的灯。
基于该观察(没有形成的CPD的观察是无害的鼠皮肤?
,8)o这些数据相当说服力,因为更短的波长没有到达鼠表皮细胞(210微米)的核,但做达到细菌核(《lum)时,以提供类似的杀菌功效254纳米UVC杀菌灯(?
-12)o此外,有证据表明,无毛小鼠每天10次暴露于222nmUVC不会产生CPD,这表明长期照射不会致癌(虫)。
但是,使用广谱UVB灯照射野生型小鼠时\已知能产生100%皮肤肿瘤发生率的动物模型需要更直接的证据表明222nmnm的紫外线对人体皮肤无致癌性。
发射280-370纳米的波长的UV,在312纳米(峰值工,15)o因此,我们通过对222nmUVC进行重复和长期照射无毛小鼠来研究222nmUVC的光致癌作用。
此外,我们还利用了色干性皮肤干燥症A组(XP-A),即a的动物模型敲除小鼠。
XP是一种常染色体隐性遗传性疾病,其特征在于多个和早发性恶性皮肤肿瘤,包括基底细胞癌,鳞状细胞癌和黑色素瘤的,在因缺乏日光暴露区域在dipyrimidine光化(修复为,17)。
XP患者在20岁之前罹患非黑色素瘤皮肤癌的风险增加了1万倍以上,而黑色素瘤的风险则增加了2000倍以上(珞)。
在XP临床亚型中,XP-A患者表现出最严重的表型。
同样,出敲除小鼠也非常过敏的UV和高度敏感的紫外线引起的皮肤癌变
(19-22)o
材料和方法
UVC源
氯化emission(Kr-Cl)准分子灯和滤光片将发射限制在200-230nm波长的UV中,最大输出波长为222nm,半峰全宽为2nm。
该程序集称为SafeZoneUVC®(UshioInc.,日本东京),该程序正在商标注册过程中。
灯泡单元由灯泡,空气冷却风扇,镜子和定制的带通滤光片(辐照器A)组成。
所安装的滤光片用于去除几乎所有的222nm主导波长(图1)o第二个222nmUVC灯单元(辐照器B)是使用三个滤镜的堆叠构造而成的,这些滤镜具有与辐照器A滤镜相似的特性。
辐照器B在235至280nm波长处的辐照量小于辐照器A的1%(图1)o使用S-172/UIT250累积紫外线仪(UshioInc.)测量了
222run的光强度,发现在距发射窗口300mm处为1mW・cnT:
。
对于254nmUVC
灯,辐照器是低压汞灯(FL-4WX1;ASONE,日本大阪)。
开始曝光之前,用UVD-S254/UIT-250(UshioInc.)测量辐照度。
距照射窗口11cm处的辐射强
度为400uW・cM。
1.2
200220240260280300320
Wavelength
图1
辐照器A.UVC区域的测量光谱,UV的230-235nm波长的积分强度是200-230nm波长的UV积分强度的0.26%,235-280nm波长的UV紫外线的积分强度是200-230nm波长的UV的积分强度。
积分强度为200-230nm波长的紫外线。
UVB区域,280-320nm波长UV的积分强度是200-230nm波长UV的积分强度的0.04%。
222nmlJVC灯被指定为辐照器A。
[在首次在线发布后,于2020年7月8日添加了更正:
此图已更新。
]
UVB源
一排六个TL20W/12RS荧光灯(Philips,埃因霍温,荷兰)用于照射小鼠。
这些灯发出从275到390nm的连续光谱,峰值在313nm。
该辐射的65%在UVB范围内。
用UVR-305/365D数字辐射计(日本东京的TokyoKogakuKikaiKK)测量,在40cm处的辐照度为3.8Jm』sM
老鼠
匕%与CBA,C57BL/6和CD-1嵌合背景(敲除小鼠生)回交至无毛从只Balb/"CAKUD小时近交系小白鼠。
使用9-20周龄的无毛白化即a+/+和即a-/-小鼠。
将小鼠饲养在无特定病原体的条件下,所有动物实验均根据神户大学医学研究生院动物实验指南进行。
对于皮肤肿瘤的产生,我们遵循了已发表的针对无毛小鼠的方案(以)。
每组有9只小鼠(12-13周)被放置在紫外线源
(222-nmUVC)下方30cm处,并以5.0kJm」照射野生型小鼠,每周三次,分别为0.5和L0kJ诋&基因敲除小鼠工每周两次,持续10周。
我们之前对每周一次0.25kJmY宽带UVB的Xpa基因敲除小鼠的研究被称为肿瘤产生率的阳性对照组(么)。
在222-nmUVC或UVB暴露10周后,我们乂监测了15周的肿瘤形成情况。
在实验期间,通过腹膜内给予戊巴比妥和吸入异氟酸的组合使小鼠镇静。
通过类似的方法在轻度镇静下进行耳肿胀的观察和测量。
在紫外线照射10周后观察15周后,使用异氟烷在吸入麻醉下通过颈脱位法处死小鼠。
当我们对小鼠进行重复暴露实验时,我们将它们在盒子中醒了几分钟,以便它们可以走动。
为了进行眼科评估,在实验方案结束时,使用即a敲除小鼠和野生型小鼠的222-nmUVC照射的眼睛用于皮肤肿瘤的产生和XPA敲除小鼠照射0.5千焦耳米宽频带UVB两次使用相同的曝光和观察协议一个星期。
《方法》中描述的所有实验方案均已由神户大学医学院研究生院实验动物研究所的审查委员会批准(批准号:
P180207-R2)和转基因生物委员会批准(批准号:
30-06)o
ELISA免疫组化
为了检测紫外线照射后任一基因型的血清CXCLL按照制造商的说明(R&DSystems)进行ELISA(21)。
免疫组织化学
为了检测小鼠皮肤中的CPD,在UVB照射3小时后收集标本。
将皮肤标本固定在10%中和的福尔马林中,并包埋在石蜡中。
如先前所述(区)进行了免疫组织化学染色,以检测针对CPD的单克隆抗体(TDM-21:
5000稀释)。
用BiozeroBZ-X710显微镜(Keyence,大阪,H本)观察标本。
统计
使用Student'st检验评估组间差异的显着性。
产值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
222nmUVC照射后CPD形成的评估
我们使用了222nmUVC灯,该灯几乎只发射222nmUVC。
灯泡单元包括一个灯泡,一个用于冷却的风扇,一个镜子和一个自定义的带通滤镜。
在本报告的其余部分(图1)中,将灯单元指定为“照射器A”。
首先,我们评估了222nmUVC照射后无毛白化病即a凝除(以下简称即a股除)和无毛白化病野生型
(以下称野生型)小鼠表皮中CPD的形成,如前所述,其中没有CPD形成在白化无毛小鼠的背部皮肤观察到的由单一照射4.5千焦耳米-222纳米UVC十天重复照射的4.5千焦耳米Y222纳米的UVC(13)o在254nmUVC或宽带UVB暴露后,观察到强CPDs阳性细胞。
当我们用1.0kJm-222nmUVC照射小鼠时.,两种基因型的小鼠表皮暴露3h后均未检测到CPD。
另一方面,在两种
在表皮的最上
基因型的小鼠中,用剂量为5.0基的222nmUVC照射后,
层,即角膜下区域,均对CPD染色非常微弱(图2)°
222nmUVC照射后CPD形成。
在222nmUVC暴露1.0或5.0kJm」后3小时,从即a敲除小鼠和野生型小鼠的背部皮肤中取出,并用针对CPD的单克隆抗体进行免疫组织化学。
插入的照片在表皮处放大;箭头指示淡淡染色的细胞。
比例尺:
50M1。
在254nmUVC(1.0kJm”或宽带UVB(1.0kJm。
后3h,每种基因型均显示出CPD的强阳性细胞。
222nmUVC辐照不会引起炎症反应
我们已经表明,UVB(280-315纳米)照射后的炎症反应,是发展皮肤癌(较强的促进因子?
1,23)o因此,我们研究了222nmUVC辐射是否可以引起小鼠皮肤炎症。
从这个意义上讲,我们认为以Xpa基因敲除小鼠为特征的模型可以预测人类皮肤肿瘤的形成,该小鼠具有高度光致癌的表型,对紫外线具有强烈的炎症反应
(1)。
当用10kJmy的222nmUVC辐照小鼠时,,估计是灭菌剂量的100倍(旦),两只基因型小鼠均未见红斑和耳朵肿胀,而254nmUVC暴露后两只基因型小鼠均未见红斑和耳朵肿胀(图也,b)。
接下来,我们测量了222nmUVC照射后的CXCL1血清水平,因为我们先前曾报道CXCL1是关键的炎症趋化因子,并参与了即a基因敲除小鼠的UV诱导的皮肤癌变
(2)。
在10kJmy一次暴露于222nm的UVC后,两只基因型小鼠的CXCL1血清水平均未升高,而在254nm的UVC或48nm的即a敲除小鼠中,CXCL1显着升高。
宽带UVB照射(图3c)o
mwniodLEURIMO半&X
t/TMQL。
上包x
(b)
0h24h48h72h96h
mmrnmm由由由由Rl
⑹(pg/mL)
图3
222nmUVC不会在小鼠皮肤中引起炎症反应。
(a)用222nmUVCnm,254nmUVC和宽带UVB照射野生型和Xpa基因敲除小鼠,并在指定的时间点观察红斑。
每组两只小鼠,观察并拍照。
(b)222nmUVCnm,254nmUVC和宽带UVB照射后耳朵肿胀。
误差棒代表标准误差。
产值显示在254纳米之间UVC差与5.0千焦耳米y和222纳米UVC与10.0千焦米Y每种基因型的小鼠的。
(c)222nmUVCnm后24、48和72h的CXCL1血清水平(野生型:
n=3,即a敲除:
A=8),254nmUVC(即a股除:
n=3)和宽带UVB(即a敲除:
a=4)o误差棒代表标准误差。
尸值表示为即a基因敲除小鼠在254nmUVC和5.0kJmY与222nmUVC在10.0kJm的差异。
慢性222nmUVC辐射未诱发皮肤肿瘤我们采用了一种方案,其中100%的/©a基因敲除小鼠在用宽带UVB照射10周后观察15周会发展为皮肤肿瘤(么)。
根据估计的灭菌剂量为0.1kJm-2222-nmUVC(8),与普通人群相比,XP患者发生UV诱发的皮肤肿瘤的易感性增加了10,000倍(当),对于野生型5.0kJmy以及即a基因敲除小鼠0.5和1.0kJm-每次暴露222nmUVC的剂量。
因此,我们以0.5或1.0kJmy的剂量用222-nmUVC照射了小鼠背部皮肤10周。
即a基因敲除小鼠每周两次,而5.0kJiny的野生型小鼠每周3次。
与我们之前的研究相反,即a基因敲除小鼠(0.25kJm%每周一次)的宽带UVB暴露引起皮肤肿瘤的发生率高达80%(21),我们发现,222nmUVC辐照,表明222nmUVC没有发挥光致癌作用(图4)<>尽管我们推测,长期222nmUVC暴露不会引起光致癌作用的原因之一是其在紫外线范围内的波长较短,只能到达表皮的最外层,而较低的渗透率阻止了其到达基底层,这是一个关键因素如果皮肤角质层未覆盖表皮或皮肤屏障受损,则仍需确保222-nmUVC的渗透水平(跄)。
我们观察到两种基因型的雄性小鼠的肿瘤发生率(a=2)在同一笼子里,使用相同的实验方案,通过互相抓挠和咬伤,导致持续的皮肤伤害。
尽管这两种基因型小鼠都有大量明显的背部皮肤伤口,但通过长期的222nmUVC照射仍未观察到肿瘤形成。
这些数据表明,即使皮肤屏障被破坏,222-nmUVC也不发挥光致癌作用
(见图S1)-
•WT222nm5.0kJ/m2
①snoE/s」OEBu-xs
M—o.OuO^2O><
①snoE/SJOEauss
jo・ou①6E」①><
•Xpa-KO222nm1.0kJ/m2
U024681012141618202224
(week)
慢性222-nmUVC不会引起皮肤肿瘤。
两种基因型小鼠的222nmUVC产生皮肤肿瘤。
绘制皮肤肿瘤/小鼠的平均数目。
每:
局两次对即a基因敲除小鼠进行0.5或l.OkJmy222nmUVC辐照,每周一次对0.25kJm宽带wb辐照,对野生型小鼠进行3次5.0kJmy222nm辐照。
每周10周,之后观察皮肤肿瘤发展15周。
所有组由九只小鼠组成。
我们先前对旗用一次0.25kJmy宽带UVB的Xpa基因敲除小鼠的研究被称为肿瘤产量的阳性对照组(虚线)(21)o
慢性222nmUVC对小鼠眼睛无影响
已经证实222nmUVC辐射不会在SpragueDawley大鼠中引起急性角膜损害或反应(药)。
在这项研究中,我们通过肉眼观察和组织病理学评估(图互)分析了222nmUVC暴露的几种慢性眼科作用,并将其与宽带UVB暴露进行了比较。
在眼睑和角膜,新血管形成和角膜混浊的分析中观察到尤%敲除小鼠具有宽谱UVB照射。
在组织学上,存在许多侵入并到达角膜中心的血管以及角膜基质中异常增加的细胞。
在Xpa的角膜混浊中观察到有疤痕的溃疡用宽带UVB照射的敲除小鼠。
在白内障清楚地观察到阳1敲除小鼠具有宽谱UVB照射,可见晶状体上皮细胞增殖和分层,与透镜皮质解体。
视网膜色素上皮细胞和外核层是在UV诱导的损伤(最敏感的空,27)<,在用宽带UVB照射的Xpa基因敲除小鼠中,还观察到内核层烫♦厚和中度受损的外核层。
另一方面,在所有这些检查中,所有222nmUVC照射的小鼠,无论即a基因型如何,在视网膜组织上均未显示出明显变化(图5)o),表明222-nmUVC被眼表吸收(羽),并且没有到达晶状体和视网膜。
图5
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慢性222nmUVC照射对眼睛无影响。
222nmUVC照射效果的眼科评估。
在每个紫外线源进行的慢性暴露实验结束后15周,苏木精和曙红染色的病理研究显示在角膜,晶状体(赤道和前壁)和视网膜中(图G。
箭头和星号分别表示角膜基质的新生血管形成和溃疡形成疤痕变化。
实心箭头和实心箭头分别表示增殖的分层晶状体上皮细胞和晶状体皮质混乱。
在视网膜中,显示了变薄的内核层(实心箭头)和中度受损的外核层(实心箭头)。
比例尺:
50Pmo
222nmUVC不会在小鼠皮肤中产生双喀咤光产物和炎症
反应
我们已经通过用5.0kJm』的222nmUVC照射在两种基因型的最外表皮层中鉴定出CPDs阳性细胞(图2)o当两个基因型小鼠用双倍剂量的222纳米UVC10干焦米照射%更清楚地看到的CPDs阳性细胞在最外层的表皮层在3小时照射后证实(图2的A)。
有趣的是,在向敲除小鼠中,在照射后观察到在此剂量表皮增厚,在72小时后的UV曝光(图峰值6b)中,未在野生型小鼠中观察到。
同样,在254nmUVC后即a敲除小鼠中发现明显的表皮增生
(图6b)o根据这些结果,我们调查了这种相对较高剂量的222-nmUVC的CPD形成和明显的表皮增厚是否仅由222-nmUVC本身或在235-280nm波长UV之间的其他小部分引起(图1)o)。
我们将222nmUVC的剂量设置为100kJm〈•以评估CPD的形成和表皮增厚。
如图6c所示,无论基因型如何,在表皮的最外层都观察到了丰富的CPDs阳性细胞。
我们构建了笫二个222nmUVC灯单元,即辐射器B,其设计目的是将235-280nm波长的紫外线的辐射剂量减少到辐射器A的辐射剂量的<1%(图1和6)。
d)o当我们使用具有照射器B中的相同剂量重新评估的CPDs形成和表皮增厚,100千焦米%的CPDs阳性细胞的数量明显减少(图6e)和显著表皮增厚峰值在72小时后的UV曝光在两种基因型中均未观察到通过辐照器A辐照的结果(图&)。
然而,两种基因型在用照射器B照射后24至96h均观察到轻微的表皮增生
(图§h)。
我们比较了来自辐射器A和B的222nmUVC,100kJm」的炎症反应,比较了耳肿胀和红斑。
在即a中观察到了血管舒张和耳朵肿胀敲除小鼠照射照射X当我们使用照射器B,无耳肿胀,但是耳朵的非常轻微的血管舒张,在指出尤%敲除小鼠。
在野生型小鼠中,任何一个照射器均未观察到任何影响(图6f,g)o这些结果表明,222nmUVC本身的炎症要小得多。
(a)
noUV
1。
kj、m2
Xpa-KOXpa-KOX^a-KOWT
BB-UVB254nm222nm
s100kJ、m2
irradiation(arbitraryunits)oooo—
irradiatk)n(arbitraryunits)ooooo
■;•••・sm)
24。
260280300320waveong-h
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IrradiatorA
IrradiatorB
Xpa-KOWT
■KUK、
-4(**c'tI.«/P
%、']♦,n.\
•qM・••*i,■
Earswelling
222nmUVC本身不会在皮肤中产生CPD和炎症反应。
(a)将a敲除小鼠和野生型小鼠的背部皮肤在222nmUVC中暴露于10kJm」后3h,并进行免疫组织化学检测CPD。
插入的照片在表皮处放大,其中阳性淡淡的染色细胞用箭头指示。
比例尺:
50Mmo(b)用苏木精和曙红染色后,在紫外线照射后的指定时间(10kJmY222-nmUVC,5.0kJm254-nmUVC和L0kJm宽带UVB)染色。
比例尺:
50(c)免疫组织化学检测即a皮肤中的G叨暴露后
3h,以100kJm-的高剂量照射222-nmUVC的基因敲除和野生型小鼠。
箭头指示阳性细胞。
比例尺:
50Mmo(d)辐照器B的光谱,显示235-280nm波长的紫外线强度降低至辐照器A剂量的<1%。
在UVC范围内,230-235nm波长的紫外线的积分强度为辐照器A的0.209%o200-230nm波长UV的积分强度,235-280nm波长UV的积分强度是200-230nm波长UV的0.001%,在UVB区域,280-320nm波长UV的积分强度为0.004%200-230nm波长的紫外线。
(e)免疫组化检测即a基因敲除小鼠和高剂量100kJm」照射的野生型小鼠中的CPD暴露3小时后,从辐射器B照射222nmUVCo箭头指示阳性细胞。
比例尺:
50%u(f)暴露于辐照器A和辐照器B后的红斑,敲除小鼠的耳朵血管扩张,头部鳞状红斑。
(g)在从辐射器A或辐射器B进行222nmUVC辐射后测得的耳部肿胀。
误差线代表标准误差。
(h)用辐照器A或辐照器B用100kJm」的222-nmUVC辐照后的组织学。
皮肤切片用苏木精和曙红染色。
比例尺:
50Mm。
讨论区
我们的结果表明,即使在即a基因敲除小鼠中,长期用222nmUVC照射小鼠也不会诱发非黑色素瘤皮肤肿瘤。
从理论上讲,有两个可能的原因。
一种是形成CPD的功效,CPD是与光致癌作用密切相关的主要光致DNA损伤,在约260nm处最高,而在较短和更长的波长处降低,而在222nm处CPD的产生约占其70%如前所述,在254nm处形成CPD的作用谱图(型)。
第二个是,222纳米UVC太短而穿透角质层到达基底细胞层,其中癌干细胞被认为是驻留(鼓,31)o然而,在表皮中在较高剂量下,5.0千焦米小鼠的两种基因型的最外层观察到的CPDs形成%这可以通过一个非常高的剂量为100千焦米来强调t
(图2和g一个,C)。
为了确定这是由于222nmUVC本身还是由222nmUVC灯照射的其他小部分所致,我们测量了222nm(JVC可以穿透人角膜组织的深度。
使用人类角质层测量了222nm处的光谱透射率,显示出近乎零的渗透率
(0.001%,见图S2)o根据先前的报告显示,由235-280nm波长的紫外线引起的CPD形成比由280-320nm波长的紫外线引起的CPD形成大10至100倍(2?
),我们假设来自辐照器A的一小部分较长波长的紫外线可能会导致CPD的形成。
因此,我们构建了辐照器B,该辐照器将235-280nm波长的紫外线辐射剂量降低到辐照器A产生的辐射剂量的<1%。
与两种基因型相比,辐照器B产生的CPDs阳性细胞数量均明显减少。
一种通过照射A(图产生6C,
E)。
总体而言,CPD的形成数量很少,(图2和弦)辐照器A的剂量要高于用于杀菌目的的剂量,这可能归因于紫外线波长235-280nm的一小部分。
但是,最重要的是,我们已经表明,无论安装在辐照器B还是辐照器A中,无论是安装在极高剂量下的222nmUVC灯都无法到达基底层。
这很重要,因为带有基底细胞的CPD在进入细胞周期时可能会维持易发癌的突变(丝)。
在最短的时间内,几天内最外层的表皮细胞CPD将运往角质层(殂),那么他们将不再具有转化能力。
另外,由于在角质层中角蛋白吸收了大部分222nmUVC,因此从理论上讲,只有一小部分最初入射的222nmUVC会到达表皮层。
实际上
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