三种荧光定量PCR检验方法比较.docx

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三种荧光定量PCR检验方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较

定量pcr：

以参考物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达成评定样本中靶基因拷贝数，称为定量PCR。

定量PCR可行性定量通常是在PCR扩增指数期进行。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：

（1）SYBRGreenI检测模式

SYBRGreenI是一个能和双链DNA结合发光荧光染料。

其和双链DNA结合后，荧光大大增强。

所以，SYBRGreenI荧光信号强度和双链DNA数量相关，能够依据荧光信号检测出PCR体系存在双链DNA数量。

SYBRGreenI最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

PCR扩增程序通常为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。

SYBRGreenI缺点：

因为SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBRGreenI优点：

SYBRGreenI优点是因为其缺点产生，因为它能全部双链 DNA相结合，所以对不一样模板不需尤其定制不一样特异性探针，通用性很好，而且价格相对较低。

这对科研是很有利，所以中国外在科研中使用比较普遍。

（2）水解探针模式（taqman探针）

TaqMan探针是一个寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针5’末端，而淬灭剂则在3’末端。

当探针和靶序列配对时，荧光基团发射荧光因和3’端淬灭剂靠近而被淬灭。

在进行延伸反应时，聚合酶5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团和淬灭剂分离，发射荧光。

一分子产物生成就伴伴随一分子荧光信号产生。

伴随扩增循环数增加，释放出来荧光基团不停积累。

所以Taqman探针检测是积累荧光。

PCR扩增程序通常是：

94℃～60℃40个循环。

常见荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

（3） 杂交探针模式（Beacon、FRET）

分子信标是一个呈发夹结构茎环双标识寡核苷酸探针，两端核酸序列互补配对，所以标识在一端荧光基团和标识在另一端淬灭基团紧紧靠近。

荧光基团被激发后产生光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生能量以红外而不是可见光形式释放出来。

分子信标茎环结构中，环通常为15-30个核苷酸长，并和目标序列互补;茎通常5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎结构。

荧光基团标识在探针一端，而淬灭剂则标识在另一端。

在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配正确茎环双链解开，假如有模板存在环序列将和模板配对。

和模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团和淬灭剂分开。

当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。

因为是酶切作用存在，分子信标也是积累荧光。

常见荧光基团：

FAM，TexasRed。

PCR扩增程序通常是：

94～55～72℃三步法，40个循环。

FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针5`端标识FAM荧光基团，另一探针3`端标识Red640荧光基团。

当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生荧光，作为Red640基团激发光被吸收，使Red640发出波长为640荧光。

当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长荧光。

因为FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。

常见荧光基团是：

LC-Red640，LC-Red705。

能用于实时荧光PCR定量方法很多，各有优缺点，应依据试验需要和目前试验条件选择适合自己方法。

下面为多种方法比较：

试验中部分好习惯：

加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完以后要归到最大计量位置，预防久而久之弹簧失去弹性。

一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注她人讨论经验，这几乎是最快提升捷径了;全部试剂全部自己配，出了问题才好找原因。

预防RNA酶污染方法：

1.全部玻璃器皿均应在使用前于180℃高温下干烤6h或更长时间。

2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

3.有机玻璃电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

4.配制溶液应尽可能用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。

然后用高压灭菌除去残留DEPC。

不能高压灭菌试剂，应该用DEPC处理过无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。

6.设置RNA操作专用试验室，全部器械等应为专用。

常见RNA酶抑制剂：

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：

是一个强烈但不根本RNA酶抑制剂。

它经过和RNA酶活性基团组氨酸咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶活性。

2.异硫氰酸胍：

现在被认为是最有效RNA酶抑制剂，它在裂解组织同时也使RNA酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈变性作用。

3.氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶活性。

4.RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）：

从大鼠肝或人胎盘中提取得来酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶一个非竞争性抑制剂，能够和多个RNA酶结合，使其失活。

5.其它：

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

因为DEPC不加选择修饰蛋白质和RNA，所以在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它和部分缓冲液（比如Tri）不能相容

在全部RNA试验中，最关键原因是分离得到全长RNA。

而试验失败关键原因是核糖核酸酶（RNA酶）污染。

RNA酶可耐受多个处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

研究人员造成污染RNA酶最关键潜在污染源是研究人员手。

所以进行RNA试验时应勤换手套。

但DEPC能和胺和巯基反应,所以含Tris和DTT试剂不能用DEPC处理

动植物总RNA提取-Trizol法：

Trizol法适适用于人类、动物、植物、微生物组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。

用Trizol法提取总RNA绝无蛋白和DNA污染。

RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly（A）+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1.将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超出所用Trizol体积10%。

2.研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml百分比加入氯仿，盖紧离心管，用手猛烈摇荡离心管15秒。

3.取上层水相于一新离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇百分比加入异丙醇，室温放置10分钟，1g离心10分钟。

4.弃去上清液，按每mlTrizol液加入最少1ml百分比加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5.小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，不然会降低RNA溶解度。

然后将RNA溶于水中，必需时可55℃-60℃水溶10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保留于-70℃。

[注意]

1.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值

2.加氯仿前匀浆液可在-70℃保留30天以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保留一周，-20℃保留十二个月。

总mRNA提取经验：

一、相关TrizolReagent需要试剂

1.Chloroform：

氯仿（分析纯）

2.Isoproplylalcohol：

异丙醇（分析纯）

3.75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）：

75%乙醇。

要求用分析纯无水乙醇并用0.01%DEPC处理过无Rnase水稀释。

4.RNase-freewater：

无Rnase水。

方法是：

将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃3小时）

5.一次性塑料手套

6.注意：

DEPC有致癌之嫌

二、相关TrizolReagent使用过程：

1.Homogenization（匀浆）

a.Tissues：

组织

每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超出Trizol试剂10%。

b.CellsGrowninmonolayer（单层细胞接毒后出现病变）

针对JEV细胞总RNA抽提法：

BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采取大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加维持液（含2%血清和HEPE8MEM）约5ml，维持天。

出现75%-100%病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两种常见规格：

大约45cm2，小约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。

Trizol试剂加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞数量，不然可造成DNA污染）具体方法以下：

（样品一定要新鲜）

（1）组织接入预冷EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，不然易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物根本分离。

（2）加氯仿0.2ml（每1mlTrizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，猛烈震荡15s，置室温2-3分钟。

（3）4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红、中层为酚-氯仿相、上层为无色水相。

RNA包含在水相中，水相体积约相当于所加Trizol试剂量60%。

（4）仔细吸收上层水相，移至另一EP管中。

（5）加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1mlTrizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。

（6）4℃离心，10000g×10min。

RNA沉淀为一层如凝胶样透明小块附在管底和管壁。

（7）弃上清液，加入预冷75%乙醇1ml（每1mlTrizol试剂加入75%乙醇最少1ml），震荡，充足洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。

弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无RnasedH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保留备用。

（8）抽提出细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。

于0.5cm厚石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：

A260/280ratio<1.6。

（9）分离组织10mg（纯组织）加800ulTrizol试剂。

（10）扩增产物判定。

DEPC处理方法以下：

1.DEPC处理：

（1）DEPC水：

100ml超纯水加入0.2mlDEPC，充足混匀，高压灭菌。

（2）Tip头（枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA器材（包含1ml、200μl、20μlTip头;EP管和PCR反应管等）：

用0.1%DEPC水（1000ml超纯水加入1mlDEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。

2.提取RNA，用DEPC水溶解。

3.RT：

我是用PCR仪来控制温度和时间，所以RT是在PCR反应管中作。

4.操作过程中要戴一次性手套，并常常换手套。

最好把要直接接触样品东西全部用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml0.1%DEPC水，在灭菌就行了;现在有进口RNASEFREE枪头买，直接用不用处理。

怎样消除污染：

机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其它打结包好后丢入垃圾桶。

（1）试剂：

mixer尽可能分装，不要原瓶数次取用。

（2）加样：

标准是DNA最终加，其它试剂根据体积大小从大往小加。

假如是同种引物和探针有多管话只是DNA不一样，那么采取方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀以后再分装到各个管子里去，这么能够有效地避免误差及污染。

另外，一般试验室轻易污染，且污染程度很高，和跑电泳还有质粒制备提取全部在同一个房间里有比较大关系，最轻易造成高浓度污染就是产物开盖和质粒稀释。

现在，中国外各个企业提供诊疗试剂盒大多采取了UNG来防污染。

Uracil-DNAN-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，起源于大肠杆菌重组克隆表示。

RNA定量：

RNA也最好最少要用电泳，首先定量，其次能够看看完整性。

至于用分光光度计比较不一样标本之间就更不准了。

RNA贮藏，最关键是温度，-20不够，最好-80，液氮最保险。

mRNA是不能替换蛋白水平分析，因为还有翻译效率和RNA降解速度影响。

RT-PCR有两种做法：

条件含有话可用kit进行一步法进行;若条件不太好话可分两步进行逆转录再PCR。

两步法结果愈加理想，条带特异性强且无拖尾现象，由此推测是体系愈加单一比较利于PCR进行。

一定要做内参，不作内参结果是不可信。

电泳能够不一起跑，没相关系，计算是相对表示程度，半定量和定量RT-PCR做全部是基因相对表示量，不是绝对表示量mRNA分离和纯化中。

步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样目标有两个，一个是破坏RNA二级结构，尤其是mRNAPoly（A+）尾处二级结构，使Poly（A+）尾充足暴露，从而提升Poly（A+）RNA回收率;另一个目标是能解离mRNA和rRNA结合，不然会造成rRNA污染。

所以此步骤不能省略。

下面，我们介绍一个能够确定RNA溶液中有没有残留RNA酶方法。

保温试验：

方法很简单，根据样品浓度，从RNA溶液中吸收两份1000ngRNA加入至0.5ml离心管中，而且用pH7.0Tris缓冲液补充到10ul总体积，然后密闭管盖。

把其中一份放入70℃恒温水浴中，保温1h。

另一份放置在-20℃冰箱中保留1h。

时间到了以后，取出两份样本进行电泳。

电泳完成后，比较二者电泳条带。

假如二者条带一致或无显著差异（当然，它们条带也要符合方法2中条件），则说明RNA溶液中没有残留RNA酶污染，RNA质量很好。

相反，假如70℃保温样本有显著降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。

PCR污染和对策：

PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最关键最常见污染问题，所以，扩增区仪器什么如枪头等要注意。

还有一个轻易忽略，最可能造成PCR产物污染形式是气溶胶污染;在空气和液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较猛烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪反复吸样全部可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，所以由其造成污染是一个值得尤其重视问题。

1.标本处理区，包含扩增摸板制备;

2.PCR扩增区，包含反应液配制和PCR扩增;

3.产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆制备。

各工作区要有一定隔离，操作器材专用，要有一定方向性。

如：

标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。

切记：

产物分析区产物及器材不要拿到其它两个工作区。

使用一次性吸头，严禁和PCR产物分析室吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶污染;

操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这么即能够降低操作，避免污染，又能够增加反应正确度。

反应液污染

可采取下列方法之一处理：

DNaseI法：

PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。

该方法优点是不需要知道污染DNA序列;

尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：

因为UV照射去污染作用对500bp以下片段效果不好，而临床用于检测PCR扩增片段通常为300bp左右，所以UNG预防作用日益受到重视和肯定。

1、提取mRNA时所用EP管、玻璃等器皿全部全部要用0.1%DEPC水浸泡。

然后烘干，高压灭菌，再烘干。

2、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。

那你用DEPC处理还有什么意义呢?

还要用双蒸水洗吗?

3、玻璃器皿干烤：

180度，8小时或更长时间;小器皿也能够用少许氯仿处理一下。

另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。