口蹄疫防治技术规范附件.docx

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口蹄疫防治技术规范附件

附件一：

间接夹心酶联免疫吸附试验（I-ELISA）

1 试验程序和原理

1.1利用包被于固相（I，96孔平底ELISA专用微量板）的FMDV型特异性抗体（AB，包被抗体，又称为捕获抗体），捕获待检样品中相应型的FMDV抗原（Ag）。

再加入与捕获抗体同一血清型，但用另一种动物制备的抗血清（Ab，检测抗体）。

如果有相应型的病毒抗原存在，则形成“夹心”式结合，并被随后加入的酶结合物/显色系统（*E/S）检出。



1.2由于FMDV的多型性，和可能并发临床上难以区分的水泡性疾病，在检测病料时必然包括几个血清型（如O、A、亚洲-1型）；及临床症状相同的某些疾病，如猪水泡病（SVD）。

2 材料

2.1 样品的采集和处理

    见附件四

2.2 主要试剂

2.2.1 抗体

2.2.1.1包被抗体：

兔抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及兔抗SVDV-160S血清。

2.2.1.2检测抗体：

豚鼠抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及豚鼠抗SVDV-160S血清。

2.2.2 酶结合物

    兔抗豚鼠Ig抗体（Ig）-辣根过氧化物酶（HRP）结合物。

2.2.3 对照抗原

    灭活的FMDV-“O”“A”“亚洲-I”各型及SVDV细胞病毒液。

2.2.4 底物溶液（底物/显色剂）

    3％过氧化氢/3.3mmol/L邻苯二胺（OPD）。

2.2.5 终止液

    1.25mol/L 硫酸。

2.2.6 缓冲液

2.2.6.1包被缓冲液  0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6。

2.2.6.2稀释液A  0.01mol/LPBS-0.05％（v/v）Tween-20，pH7.2～7.4。

2.2.6.3稀释液B  5％脱脂奶粉（w/v）- 稀释液A 。

2.2.6.4洗涤缓冲液  0.002mol/LPBS-0.01％（v/v）Tween-20。

2.3 主要器材设备

2.3.1 固相

    96孔平底聚苯乙烯ELISA专用板。

2.3.2 移液器、尖头及贮液槽

    微量可调移液器一套，可调范围0.5～5000μL（5～6支）；多（4、8、12）孔道微量可调移液器（25～250μL）；微量可调连续加样移液器（10～100μL）；与各移液器匹配的各种尖头，及配套使用的贮液槽。

2.3.3 振荡器

    与96孔微量板配套的旋转振荡器。

2.3.4 酶标仪,492nm波长滤光片。

2.3.5 洗板机或洗涤瓶,吸水纸巾。

2.3.637℃恒温温室或温箱。

3 操作方法

3.1 预备试验

   为了确保检测结果准确可靠，必须最优化组合该ELISA，即试验所涉及的各种试剂，包括包被抗体、检测抗体、酶结合物、阳性对照抗原都要预先测定，计算出它们的最适稀释度，既保证试验结果在设定的最佳数据范围内，又不浪费试剂。

使用诊断试剂盒时，可按说明书指定用量和用法。

如试验结果不理想，重新滴定各种试剂后再检测。

3.2 包被固相

3.2.1 FMDV各血清型及SVDV兔抗血清分别以包被缓冲液稀释至工作浓度，然后按图3-1<Ⅰ>所示布局加入微量板各行。

每孔50μL。

加盖后37℃振荡2h。

或室温（20～25℃）振荡30min，然后置湿盒中4℃过夜（可以保存1周左右）。

3.2.2 一般情况下,牛病料鉴定“O”和“A”两个型，某些地区的病料要加上“亚洲-I”型；猪病料要加上SVDV。

      图3-1：

定型ELISA微量板包被血清布局<Ⅰ> 、对照和被检样品布局<Ⅱ>

<Ⅰ>            <Ⅱ>1   2      3    4     5   6     7   8    9  10    11  12

A   FMDV“O”

C++C++

C+  C+

C-C-

S1  1

S3  3

S5  5

B        “A”

C++C++

C+  C+

C-C-

S1  1

S3  3

S5  5

C  “Asia-I”

C++C++

C+  C+

C-C-

S1  1

S3  3

S5  5

D   SVDV

C++C++

C+  C+

C-C-

S1  1

S3  3

S5  5

E   FMDV“O”

C++C++

C+  C+

C-C-

S2  2

S4  4

S6  6

F       “A”

C++C++

C+  C+

C-C-

S2  2

S4  4

S6  6

G  “Asia-I”

C++C++

C+  C+

C-C-

S2  2

S4  4

S6  6

H   SVDV

C++C++

C+  C+

C-C-

S2  2

S4  4

S6  6

试验开始，依据当天检测样品的数量包被，或取出包被好的板子；如用可拆卸微量板，则根据需要取出几条。

在试验台上放置20min，再洗涤5次，扣干。

3.3 加对照抗原和待检样品

3.3.1 布局

空白和各阳性对照、待检样品在 ELISA 板上的分布位置如图3-1<Ⅱ>所示。

3.3.2 加样

3.3.2.1第5和第6列为空白对照（C-），每孔加50μL稀释液A。

3.3.2.2先将各型阳性对照抗原分别以稀释液A适当稀释，然后加入与包被抗体同型的各行孔中，C++为强阳性，C+为阳性，可以用同一对照抗原的不同稀释度。

每一对照2孔，每孔50μL。

3.3.2.3按待检样品的序号（S1、S2...）逐个加入，每份样品每个血清型加2孔，每孔50μL。

 37℃ 振荡1h，洗涤5次，扣干。

3.4 加检测抗体

    各血清型豚鼠抗血清以稀释液A稀释至工作浓度，然后加入与包被抗体同型各行孔中，每孔50μL。

37℃振荡1h。

洗涤5次，扣干。

3.5 加酶结合物

    酶结合物以稀释液B稀释至工作浓度，每孔50μL。

    37℃振荡40min。

洗涤5次，扣干。

3.6 加底物溶液

试验开始时，按当天需要量从冰箱暗盒中取出OPD，放在温箱中融化并使之升温至37℃。

临加样前，按每6mLOPD加3％双氧水30μL（一块微量板用量），混匀后每孔加50μL。

37℃振荡15min。

3.7 加终止液

    显色反应15分钟，准时加终止液1.25mol/LH2SO4。

50μL/孔。

3.8 观察和判读结果

终止反应后,先用肉眼观察全部反应孔。

如空白对照和阳性对照孔的显色基本正常,再用酶标仪（492nm）判读OD值。



4 结果判定

4.1 数据计算

    为了便于说明，假设表3-1所列数据为检测结果（OD值）。

    利用表3-1所列数据,计算平均OD值和平均修正OD值（表3-2）

4.1.1各行2孔空白对照（C-）平均OD值；

4.1.2各行（各血清型）抗原对照（C++、C+）平均OD值；

4.1.3各待检样品各血清型（2孔）平均OD值；

4.1.4计算出各平均修正OD值（＝［每个

（2）或（3）值］－［同一行的

（1）值］。

表3-1. 定型ELISA结果（OD值）

C++         C+          C-         S1           S2           S3

AFMDV“O”

1.841.74

0.560.46

0.060.04

1.621.54

0.680.72

0.100.08

B     “A”

1.251.45

0.400.42

0.070.05

0.090.07

1.221.32

0.090.09

C“Asia-I”

1.321.12

0.520.50

0.040.08

0.050.09

0.120.06

0.070.09

D  SVDV

1.081.10

0.220.24

0.080.08

0.090.10

0.080.12

0.280.34

C++        C+         C-         S4            S5         S6 

EFMDV“O”

0.940.84

0.240.22

0.060.06

1.221.12

0.090.10

0.130.17

F     “A”

1.101.02

0.110.13

0.060.04

0.100.10

0.280.26

0.200.28

G“Asia-I”

0.390.41

0.290.21

0.090.09

0.100.09

0.100.10

0.350.33

H  SVDV

0.880.78

0.150.11

0.050.05

0.110.07

0.090.09

0.100.12

表3-2.平均OD值/平均修正OD值

          C++            C+          C-      S1         S2         S3

A  FMDV“O”

1.79/1.75

0.51/0.46

0.05

1.58/1.53

0.70/0.65

0.09/0.04

B      “A”

1.35/1.29

0.41/0.35

0.06

0.08/0.02

1.27/1.21

0.09/0.03

C “Asia-I”

1.22/1.16

0.51/0.45

0.06

0.07/0.03

0.09/0.03

0.08/0.02

D  SVDV

1.09/1.01

0.23/0.15

0.08

0.10/0.02

0.10/0.02

0.31/0.23

                 C++          C+            C-      S4         S5          S6

E  FMDV“O”

0.89/0.83

0.23/0.17

0.06

1.17/1.11

0.10/0.04

0.15/0.09

F      “A”

1.06/1.01

0.12/0.07

0.05

0.10/0.05

0.27/0.22

0.24/0.19

G “Asia-I”

0.40/0.31

0.25/0.16

0.09

0.10/0.01

0.10/0.01

0.34/0.25

H  SVDV

0.83/0.78

0.13/0.08

0.05

0.09/0.05

0.09/0.04

0.11/0.06

4.2 结果判定

4.2.1 试验不成立

    如果空白对照（C-）平均OD值＞0.10，则试验不成立，本试验结果无效。

4.2.2 试验基本成立

    如果空白对照（C-）平均OD值≤0.10，则试验基本成立。



4.2.3 试验绝对成立

    如果空白对照（C-）平均OD值≤0.10，C+ 平均修正OD值＞0.10，C++ 平均修正OD值＞1.00, 试验绝对成立。

如表2中A、B、C、D行所列数据。

4.2.3.1如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≤0.10，则该血清型为阴性。

如S1的“A”、“Asia-1”型和“SVDV”。

4.2.3.2如果某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。

如S1为“O”型；S3为“Asia-I”型。

4.2.3.3虽然某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0.10，但不大于其他型的平均修正OD值的2倍，则该样品只能判定为可疑。

该样品应接种乳鼠或细胞，并盲传数代增毒后再作检测。

如S2“A”型。

4.2.4 试验部分成立

    如果空白对照（C-）平均OD值≤0.10，C+ 平均修正OD值≤0.10，C++ 平均修正OD值≤1.00, 试验部分成立。

如表2中E、F、G、H行所列数据。

4.2.4.1如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≥0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。

例如S4判定为“O”型。

4.2.4.2如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0.10～1.00之间,而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，该样品可以判定为该最高OD值所在血清型。

例如S5判定为“A”型。

4.2.4.3如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0.10～1.00之间,但不比其他型的平均修正OD值大2倍，该样品应增毒后重检。

如S6“亚洲-I”型。

注意：

重复试验时，首先考虑调整对照抗原的工作浓度。

如调整后再次试验结果仍不合格，应更换对照抗原或其他试剂。

附件二

反向间接血凝试验（RIHA）

1 材料准备

1.1  96孔微型聚乙烯血凝滴定板（110度），微量振荡器或微型混合器，0.025mL、0.05mL稀释用滴管、乳胶吸头或25μL、50μL移液加样器。

1.2  pH7.6、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.6、0.05mol/L  PB），pH7.6、50%丙三醇磷酸缓冲液（GPB），pH7.2、0.11mol/L磷酸缓冲液（pH7.2、0.11mol/L  PB），配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录A（规范性附录）。

1.3 稀释液I、稀释液II，配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录B（规范性附录）。

1.4 标准抗原、阳性血清，由指定单位提供，按说明书使用和保存。

1.5敏化红细胞诊断液：

由指定单位提供，效价滴定见中华人民共和国国家标准（GB/T19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录C（规范性附录）。

1.6  被检材料处理方法见中华人民共和国国家标准（GB/T19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录E（规范性附录）。

2 操作方法

2.1 使用标准抗原进行口蹄疫A、O、C、Asia-I型及与猪水泡病鉴别诊断。

2.1.1被检样品的稀释：

把8只试管排列于试管架上，自第1管开始由左至右用稀释液I作二倍连续稀释（即1:

6、1:

12、1:

24……1:

768）,每管容积0.5mL。

2.1.2按下述滴加被检样品和对照：

2.1.2.1在血凝滴定板上的第一至五排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0.05mL，每排的第7孔滴加第7管稀释被检样品0.05mL，以此类推至第1孔。

2.1.2.2每排的第9 孔滴加稀释液I0.05mL,作为稀释液对照。

2.1.2.3每排的第10孔按顺序分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病标准抗原（1：

30稀释）各0.05mL，作为阳性对照。

2.1.3 滴加敏化红细胞诊断液：

先将敏化红细胞诊断液摇匀，于滴定板第一至五排的第1～10孔分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病敏化红细胞诊断液，每孔0.025mL，置微量振荡器上振荡1分钟～2分钟,20℃～35℃放置1.5小时～2小时后判定结果。

2.2使用标准阳性血清进行口蹄疫O型及与猪水泡病鉴别诊断。

2.2.1每份被检样品作四排、每孔先各加入25μL稀释液II。

2.2.2每排第1孔各加被检样品25μL，然后分别由左至右作二倍连续稀释至第7孔（竖板）或第11孔（横板）。

每排最后孔留作稀释液对照。

2.2.3滴加标准阳性血清：

在第一、三排每孔加入25μL稀释液II；第二排每孔加入25μL稀释至1:

20的口蹄疫O型标准阳性血清；第四排每孔加入25μL稀释至1:

100的猪水泡病标准阳性血清；置微型混合器上振荡1分钟～2分钟，加盖置37℃作用30分钟。

2.2.4滴加敏化红细胞诊断液：

在第一和第二排每孔加入口蹄疫O型敏化红细胞诊断液25μL；第三和第四排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液25μL；置微型混合器上振荡1分钟～2分钟，加盖20℃～35℃放置2小时后判定结果。

3 结果判定

3.1按以下标准判定红细胞凝集程度：

“++++”—100%完全凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围；“+++”—75%凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点；“++”—50%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点；“+”—25%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉积于孔底；“－”—不凝集，红细胞完全沉积于孔底成一圆点。

3.2操作方法2.1的结果判定：

稀释液I对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集试验方成立。

3.2.1若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫A型；若只第二排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫O型；以此类推。

若只第五排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为猪水泡病

3.2.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。

3.2.3如出现2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为底）浓度以上者即可判为阳性，其余判为阴性。

3.3操作方法2.2的结果判定：

稀释液II对照孔不凝集试验方可成立。

3.3.3.1若第一排出现2孔以上的凝集（++以上），且第二排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第三、四排不出现凝集判为口蹄疫O型阳性。

若第三排出现2孔以上的凝集（++以上），且第四排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第一、二排不出现凝集则判为猪水泡病阳性。

3.3.3.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。

附件三

正向间接血凝试验（IHA）

1 原理

    用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。

    抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。

若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。

这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。

2 适用范围

    主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。

3 试验器材和试剂

3.196孔110°V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板

3.2 微量移液器（50μL25μL）取液塑咀

3.3 微量振荡器

3.4O型口蹄疫血凝抗原

3.5O型口蹄疫阴性对照血清

3.6O型口蹄疫阳性对照血清

3.7 稀释液

3.8 待检血清（每头约0.5ml血清即可）56℃水浴灭活30分钟

4 试验方法

4.1 加稀释液

    在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50μL。

4.2 稀释待检血清

    取1号待检血清50μL加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50μL移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3 孔……直至第9孔混匀后取出50μL丢弃。

此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：

1:

2⑴、1:

4⑵、1:

8⑶、1:

16⑷、1:

32⑸、1:

64⑹、1:

128⑺、1:

256⑻、1:

512⑼。

    取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意！

每取一份血清时，必须更换塑咀一个。

4.3 稀释阴性对照血清

    在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。

此时阴性血清的稀释倍数依次为1:

2⑴、1:

4⑵、1:

8⑶、1:

16⑷。

第6-7孔为稀释液对照。

4.4 稀释阳性对照血清

    在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50μL，对倍数稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。

此时阳性血清的稀释倍数依次为1：

2-1：

4096。

4.5 加血凝抗原

    被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加O型血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μL。

4.6 振荡混匀

    将血凝板置于微量振荡器上1-2分钟，如无振荡器，用手轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。

盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5-2小时判定结果，也可延至翌日判定。

4.7 判定标准

    移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:

16孔，稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。

    阳性血清对照1:

2-1:

256各孔应出现“++”—“+++”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内）。

在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。

例如1号待检血清1-5孔呈现“++”—“+++”凝集，6-7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:

128。

接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:

128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗体效价达到1:

256（第8孔）呈现“++”凝集为免疫合格。

5 检测试剂的性状、规格

5.1 性状

5.1.1 液体血凝抗原：

摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底。

5.1.2 阴性对照血清：

淡黄色清亮稍带粘性的液体。

5.1.3 阳性对照血清：

微红或淡色稍混浊带粘性的液体。

5.1.4 稀释液：

淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。

5.2 包装

5.2.1 液体血凝抗原：

摇匀后即可使用，5ml/瓶。

5.2.2 阴性血清：

1ml/瓶，直接稀释使用。

5.2.3 阳性血清：

1ml/瓶，直接稀释使用。

5.2.4 稀释液：

100ml/瓶，直接使用，4-8℃保存。

5.2.5 保存条件及保存期

5.2.5.1 液体血凝抗原：

4-8℃保存（切勿冻结），保存期3个月。

5.2.5.2 阴性对照血清：

-15~-20℃保存，有效期1年。

5.2.5.3 阳性对照血清：

-15~-20℃保存，有效期1年。

6 注意事项

6.1 为使检测获得正确结果，请在检测前仔细阅读说明书。

6.2 严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。

6.3 勿用90°和130°血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。

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6.4 用过的血凝板应及时在水龙头冲净血球。

再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37℃恒温箱内干燥备用。

检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。

血凝板应浸泡在洗液中（浓硫酸与重铬酸钾按1：

1混合），48小时捞出后清水冲净。

6.5 每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。

“-”表示完全不凝集或0-10%血球凝集。

“+”表示10-25%血球凝集   “+++”表示75%血球凝集。

“++”表示50%血球凝集     “++++”表示90-100%血球凝集。

6.6 用不同批次的血凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原的效价，取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。

6.7 收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使