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基因工程考试题
第二章DNA重组克隆的单元操作
练习题
限制性内切核酸酶(练习题)
一、填空题
1.严格地说限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌
的现象。
3.1970年,Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶,能够特异性的切割DNA,
这个酶后来被命名为,这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段,可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小.一般在20~40kDa,通常由亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA,极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA,或DNA/RNA杂合双
链。
这类酶的专一性强,它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求,而且对更远的碱基也
有要求,因此,Ⅱ类酶既具有专一性,也具有专一性,一般在识别序
列内切割。
切割的方式有,产生末端的DNA片段或的DNA
片段。
作用时需要作辅助因子,但不需要和。
6.完全的回文序列具有两个基本的特点,就是:
(1)
(2)。
7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基,也有识别多序列的限制性内切核酸酶。
根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析,限制性内切核酸酶识别序列具有倾向,即它们在识别序列中含量较高。
8.EcoK是I类限制性内切核酸酶,分子组成是α2β2γ,分子量300kDa。
在这些亚基中,
o亚基具有作用;β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是。
9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫。
10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的,第一个大写字母取自,第二、第三两个字母取自,第四个字母则用表示。
11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’—GRCGYG-3’,其中R,Y。
12.在酶切反应管加完各种反应物后,需要离心2秒钟,其目的是和。
13.部分酶切可采取的措施有:
(1)
(2)(3)等。
14.第一个分离的限制性内切核酸酶是;而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是。
15.限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同,但识别的序列都是,它们属于。
16.由于DNA是由4种碱基组成的,所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是。
17.SalI和NotI都是哺乳动物中识别序列稀有的酶,在哺乳动物基因组的5kb片段中,找到NotI切点的概率是。
18.部分酶切是指控制反应条件,使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割,它的理论依据是。
19.I类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的,切割位点的识别结合有两种模型,一种是,另一种是。
20.限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。
二、判断题
1.限制与修饰现象是宿主的一种保护体系,它是通过对外源DNA的修饰和对自身DNA
的限制实现的。
2.限制性内切核酸酶在DNA中的识别/切割位点的二级/三级结构也影响酶切效率。
一
般来说,完全切割质粒或病毒DNA,要比切割线状DNA需要更多的酶,最高的需要20倍。
3.如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端,那么接近末端的程度也影响
切割,如HpaⅡ和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。
4.能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌,其本身的基因组中没有被该核酸酶
识别的序列。
5.限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图
谱而后者是一个连锁图。
6.用限制性内切核酸酶HaeⅢ分别切割载体DNA和供体DNA后,可用E.coliDNA连接
酶进行连接。
,
7.已知某一内切核酸酶在一环状DNA上有3个切点,因此,用此酶切割该环状DNA,可得
到3个片段。
8.迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA,又能作用于单链DNA。
9.基因工程中使用的Ⅱ类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性,而且有甲基化酶的
活性。
10.DNA多态性就是限制性片段长度多态性。
11.用限制性内切核酸酶PstI切割质粒pBR322后,再用外切核酸酶ExoⅢ进行系列缺失,
可得到一系列大小不同的缺失突变体。
12.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变,是导致一些酶的星活性的主要
原因之一,防止的办法是在酶切反应体系中,将甘油的浓度控制在5%以下。
13.具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRⅡ末端的载体中。
14.从EsherichiacoliK中分离的限制性内切核酸酶命名为EcoK。
15.同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA,得到的片段的两个末端都是相同的。
16.在限制与修饰系统中,修饰主要是甲基化作用,一旦位点被甲基化了,其他的限制
性酶就不能切割了。
17.稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。
三、选择题(单选或多选)
1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质,下列描述中只有【】不太恰当。
A.由作用于同一DNA序列的两种酶构成
B.这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
C.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰
D.不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统
2.天然PstI限制性内切酶的来源是【】
ABacillusamyloliquefaciens
BEscherichiacoli
CHaemophilusinfluenzae
DProvidenciastuartii
EStreptomyceslividans
E.不同探针的使用
3.Ⅱ型限制性内切核酸酶:
【】
A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列
B.仅有内切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一种酶提供
C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列
D.有外切核酸酶和甲基化酶活性
E.仅有外切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一种酶提供
4.Ⅲ型限制性内切核酸酶:
【】
A.由两个亚基组成,仅识别半甲基化位点。
甲基化位点相对于限制位点的位置(上游或下
游)决定了DNA是被甲基化还是被限制
B.不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥:
MS亚基促使甲基化,R亚基促使限制
C.由两个亚基组成,在识别位点附近识别并进行甲基化或限制
D.在错配修复中起关键作用,因为酶结合到DNA上是以结构扭曲为基础而不是序列错误识别
E.是光依赖型酶,是嘧啶二聚体进行“光反应”的关键酶,它们能使胸腺嘧啶二聚体间的共价键断裂
5.分析限制性内切核酸酶切割双链DNA所得到的DNA片段的长度有助于物理作图,
这是因为:
【】
A.即使只用一种限制酶,因为DNA是线性的,所以也可以迅速确定限制性片段序列
B.内切酶在等距离位点切割DNA,同时对于每个生物体的长度是特异的
C.DNA的线性意味着单限制性酶切片段的长度之和等于DNA的总长,而双酶切产生的重叠片段则产生模糊的图谱
D.这些内切酶的消化活性是物种特异的
E.这一技术同时为核苷酸序列提供了广泛信息
6.通过限制性片段分析,可以对等位基因进行精确的分析比较,其原因是:
【】
A.限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的一个
B.它利用限制性位点作为遗传标记
C.一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的
D.它不依赖于变异等位基因产物的功能。
E.限制性内切核酸酶的切点被限制在DNA的编码区域内
7.限制性片段长度多态性(RFLP)是:
【】
A.用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术
B.二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别
C.物种中的两个个体限制性图谱间的差别
D.两种物种个体间的限制性图谱差别
E.两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别·
8.为了正确地构建一个真核基因组的物理图谱:
【】。
A.必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳)
B.必须从单倍体细胞(配子)中分离DNA,这样避免了由二倍体细胞中同源染色体的存在而产生的干扰信息
C.必须进行单个染色体分析,这只能在细胞分裂后期进行
D.必须找到对于每个染色体只切割一次的限制酶
E.必须首先分离核DNA和细胞器DNA,然后对它们分别作图
9.下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?
【】
A.限制酶是外切酶而不是内切酶
B.限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割
C.同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的
D.一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA,产生黏末端
E.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,产生平末端
10.因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是:
【】
A.J.LederbergB.WArberC.H.SmithD.FSanger
11.第一个被分离的Ⅱ类酶是:
【】
A.EcoKB.HindⅢC.HindⅡD.EcoB
12.双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列,这种序列一般具有下列特
征:
【】
A.有对称轴B.两条链的5’3’方向的序列相同
C.是Ⅱ类酶的识别序列D.可增强基因的表达
13.在下列进行DNA部分酶切的条件中,控制那一项最好?
【】
A.反应时间B.酶量C.反应体积D.酶反应的温度
14.在下列试剂中,那一种可以螯合Ca2+离子?
【】
A.EDTAB.柠檬酸钠C.SDSD.EGTA
15.在下列工具酶中,那一种可以被EGTA抑制活性?
【】
A.S1单链核酸酶B.末端转移酶C.碱性磷酸酶D.Bal31核酸酶
16.限制性内切核酸酶可以特异性地识别:
【】
A.双链DNA的特定碱基对B.双链DNA的特定碱基序列
C.特定的三联密码D.以上都正确
17.在下列酶中,催化反应不需要ATP的是()
A.EcoKB.EcoBC.T4DNA连接酶D.BamHl
18.下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中,正确一项的是()。
A.Sau3AIB.E.coRIC.hindIIID.Sau3A1
19.限制性内切核酸酶的星号活性是指:
【】
A.在非常规条件下,识别和切割序列发生变化的活性。
B.活性大大提高;C.切割速度大大加快;D.识别序列与原来的完全不同
20.下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?
【】
A.甘油含量过高B.反应体系中含有有机溶剂
C.含有非Mg2+的二价阳离子D.酶切反应时酶浓度过低
21.DNA被某种酶切割后,电泳得到的电泳带有些扩散,下列原因中,那一项不太
可能?
【】
A.酶失活B.蛋白质(如BSA)同DNA结合
C.酶切条件不合适D.有外切核酸酶污染
22.关于回文序列,下列各项中,【】是不正确的
A.是限制性内切核酸酶的识别序列B.是某些蛋白的识别序列
C.是基因的旁侧序列D.是高度重复序列
23.关于宿主控制的限制修饰现象的本质,下列描述中只有【】不太恰当
A.由作用于同一DNA序列的两种酶构成
B.这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
C.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰
D.不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统
24.限制性核酸内切酶是由细菌产生的,其生理意义是【】
A修复自身的遗传缺陷B促进自身的基因重组
C强化自身的核酸代谢D提高自身的防御能力E补充自身的核苷酸消耗
25.根据酶切活性对盐浓度的要求,限制性核酸内切酶可分成【】
A2大类B3大类C4大类D5大类E6大类
26.下列五个DNA片段中含有回文结构的是【】
AGAAACTGCTTTGACBGAAACTGGAAACTGCGAAACTGGTCAAAG
DGAAACTGCAGTTTCEGAAACTGCAGAAAG
27.下列五个DNA片段,最可能含有SstI酶切位点的是【】
AGGAGAGCTCT;BGAGCACATCT;CCCCTGTGGGA
DATCCTACATG;EAACCTTGGAA
28.T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起,其底物的关键基团是【】
A2'-OH和5'-P;B2'-OH和3'-P;
C3'-OH和2'-P;D3'-OH和5'-P;E5'-OH和3'-P
29.Bal31工具酶是一种【】
A只切双链DNA的外切酶;B双链单链DNA均切的外切酶
C双链单链DNA和RNA均切的外切酶;D双链单链RNA均切的外切酶
E只切双链RNA的外切酶
四、简答题
1.现分离到X82噬菌体的一个突变型,它同野生型的噬菌斑相当不同,并已分离到这两种噬菌体的DNA,请设计一个实验,初步鉴定是点突变、插入突变还是缺失突变?
2.说明SangerDNA测序法的原理。
3.在酶切反应缓冲液中加入BSA的目的是什么?
机理是什么?
4.Fredrick和McClarin等用一个由13个碱基对的DNA片段与EcoRI、反应,然后分离到酶和DNA共结晶的复合物,通过X射线分析发现了什么?
5.有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。
你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用?
6.某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时,出现了星号活性,请分析可能的原因?
7.在序列5’—CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列,该位点的序列可能是什么?
8.下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列:
GAATCG,AAATTT,GATATC,ACGGCA?
为什么?
9.用连接酶将Sau3AI(,bGATC)切割的DNA与经BamHI(G'GATCC)切割的DNA连接起来后,能够被BamHI切割的机率有多大(用百分比表示)?
10.用Klenow酶填补的办法可使5’黏性末端转变成平末端。
这种方法常使DNA上的某些限制酶的识别位点消失。
请问,对于下列限制酶,用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失?
BamHI(GGATCC);TaqI(TCGA),BssHⅡ(GCGCGC)。
11.请推测细菌的染色体上是否会有编码识别8个碱基的内切酶?
怎样验证?
12.当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时,若要进行双酶切,应采取什么措施?
为什么?
五、问答题
1.什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modificationsystem,R-Msystem)
2.细菌的限制—修饰系统有什么意义?
3.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
4.I类限制酶具有哪些特点?
在基因工程中有什么作用?
5.Ⅲ类限制酶有哪些特点?
6.何谓限制性内切核酸酶的切割频率?
7.什么是限制性内切核酸酶的星号活性?
受哪些因素影响?
8.双酶消化法(doubledigests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。
9.什么是DNA多态性(DNApolymorphism)?
10.限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。
11.计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离:
AluI:
5’AGCT3”,EcoRI:
5’GAATTC3’
3TCGA5’3’CTTAGG5’
AcyI:
5’GPuCGPyC3’
3’CPyGCPuG5’
(注:
Py二任何一种嘧啶:
Pu二任何一种嘌吟)
12.为什么大多数内切酶被称为“限制”酶。
13.据Science杂志报道:
一种重要的遗传疾病可由导致DNA中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导。
设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。
六、概念题
1.回文结构
2.同裂酶
3.同位酶
4.同尾酶
限制性内切核酸酶(参考答案)
一、填空题
1.限制—修饰系统的一个组成部分;双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构
2.1952;限制和修饰
3.HindⅡ
4.限制性酶切图谱
5.2~4个相同的;切割位点;识别位点的;平切和交错切;平;具有突出黏睦末端;Mg2+;
ATP;SAM
6.
(1)能够在中间划一个对称轴,两侧的序列两两对称互补配对;
(2)两条互补链的5’3’的序列组成相同,即将一条链旋转180°,则两条链重叠
7.4~6;GC
8.限制性内切核酸酶的作用;甲基化酶;识别DNA
9.限制性片段长度多态性(RFLP)
10.属名的第一个字母;种名的前两个字母;株名
11.代表A或者是T;代表G或者C
12.混合均匀;防止部分酶切
13.
(1)减少酶量;
(2)缩短反应时间;(3)增大反应体积
14.EcoK;EcoRl
15.GGCC;异源同工酶
16.4n
17.1/200
18.酶切速度是不均衡的’
19.限制酶移动;DNA弯曲
20.50%
二、判断题
1.错误。
对外源DNA的限制,对自身DNA的修饰。
2.正确。
3.正确。
4.错误。
细菌本身基因组中核酸酶的识别序列因C或A残基的甲基化作用而受到保护,可免遭切割。
5.正确。
6.错误。
限制性内切核酸酶HaeⅢ切割DNA产生平末端的DNA片段,E.coliDNA连接酶不能连接平末端。
7.正确。
8.错误。
9.错误。
Ⅱ类限制性内切核酸酶没有甲基化酶的活性。
10.错误。
DNA多态性是指中性突变不低于1%的一种群体,一般是不能检测的。
如果这种突变发生在限制性内切核酸酶的识别位点上,就会改变酶切的模式,可以通过电泳检测出来。
所以,RFLP是DNA多态性的一部分。
11.错误。
限制性内切核酸酶PstI切割DNA后产生3,突出的黏性末端,而外切核酸酶ExoⅢ只能从突出的5,端降解DNA。
12.正确。
13.正确。
14.错误。
应是EcoK。
15.错误。
同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA,得到的片段的两个末端不一定相同。
如果识别序列不是完整的回文序列,产生的末端就不相同。
16.错误。
限制与修饰是一对保护系统,修饰了就不能被同一系统中的限制性内切核酸酶切割,但是对不同限制—修饰系统中的酶没有作用。
17.错误。
在某种生物基因组DNA中切割频率很低的酶称为稀有酶。
三、选择题(单选或多选)
1.B.;2.D.;3.B.;4.C;5.C;
6.B.,D.;7.C.;8.A.,E.;9.B.,C.,D.,E.;10.B.;
11.C.;12.a,B.,C.;13.B.;14.D.;15.D.
16.B.;17.D.;18.D.;19.A.;20.D.;
21.A.;22.D.;23.B.;24..D.;25.B.;26.D.;27.A.;28.D.;29.B.
四、简答题
1.答:
用RFLP分析法。
2.答:
SangerDNA测序法是建立在两个基本原理之上:
(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5,端向3,端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程);
(2)可延伸的引物必须能提供游离的3,羟基末端,双脱氧核苷酸由于缺少游离的3,羟基末端,因此会终止聚合反应的进行。
如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应,则会获得4组长度不同的DNA片段。
通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。
3.答:
目的是保护酶活性,机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度,防止酶失活。
4.答:
发现:
具有活性的EcoRI是一个二聚体,它们同DNA结合形成一个直径为50A的球形结构,两个EcoRI位于DNA的两侧。
5.答:
某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基,因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。
另一种避免限制酶切割的途径是抑制SAMase的活性,该酶制造S—腺苷甲硫氨酸。
某些限制酶作用时需要S—腺苷甲硫氨酸。
然而,噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应。
6.答:
盐离子浓度不对,温度不对,甘油浓度过高。
7.答:
回文序列是:
5’-CATATG-3’
8.答:
GATATC;AAATUF,因为它们是回文序列。
9.答:
25%。
10.答:
BssHⅡ不会。
11.答:
关于这个问题没有明确的答案。
这些酶的作用不仅仅限于噬菌体的感染,因为大多数噬菌体并不含有8个碱基序列的酶切位点,一种可能是8个碱基的酶是质粒整合后加上去的,作为质粒附加系统的一部分。
12.答:
注意星活性,先低盐,后高盐;先低温酶,后高温酶;并且可以直接在换酶前将第一种酶失活,再加第二种酶,否则,易产生星活性。
或使用通用缓冲液。
五、问答题
1.答:
细菌中有作用于同一DNA的两种酶,即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。
而且,这两种酶作用于同一DNA的相同部位,把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。
2.答:
不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。
修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰,由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰,限制酶就不能进行切割。
由于外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化,宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我,并将人侵的外来DNA分子降解掉。
所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。
3.答:
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号。
基本原则:
3—4个字母组成,方式是:
属名+种名+株名+序号;
首字母:
取属名的第一个字母,且斜体大写;
第二字母:
取种名的第一个字母,斜体小写;
第三字母:
(1)取种名的第二个字母,斜体小写;
(2)若种名有词头,且已命名过限制酶坝,j取词头后的第一字母代替。
第四字母:
若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而
定,但用正体。
顺序号:
若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等,用正体。
4.答:
I类限制性内切核酸酶的分子量较大,一般在30万道尔顿以上,通常由三个不同的亚基所组成。
例如限制性内切核酸酶EcoB是由R(135kDa),M(62kDa)和S(55kDa)三种亚基组成的复合酶,这三个亚基分别由不同的基因编码。
全酶的总分子量为449kDa,共5个亚基,其中R亚基和M亚基各两分子。
I类酶不仅是一种内切核酸酶,同时在酶
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