基因工程药物研发的基本过程.docx
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基因工程药物研发的基本过程
基因工程药物研发的基本过程
基因工程药物的研发分为上游和下游两个阶段:
上游阶段:
主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。
目的基因获得后,最主要的就是目的基因的表达。
选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能,其次是表达的量和分离纯化的难易。
此阶段的工作主要在实验室完成。
下游阶段:
从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。
此阶段是将实验室的成果产业化、商品化,主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立,新型生物反应器的研制,高效分离介质及装置的开发,分离纯化的优化控制,高纯度产品的制备技术,生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造,电子计算机的优化控制等。
血管抑制素(angiostatin,简称AGN)是纤溶酶原
的一个酶解片段,相当于其1~4Kringle区,具有抑
制皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿
瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑
制因子[1,2],对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消
化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研
究价值和应用前景.
PCR产物的T载体克隆
(一) 重组T质粒的构建
一.原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种:
T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:
首先,T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
因为DNA片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。
对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。
为了减少自环的高本底,可对载体进行5’除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端,所以除磷后载体不会自环。
一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。
通过这种方法可大大减少由载体的自
环造成的高本底。
对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。
双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。
TaqDNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pGEM-TEasyVector末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。
二.材料与方法
1材料
外源DNA片断
2仪器、用具
移液枪、碎冰
3试剂
pMD18-TVector;Ligationbuffer;T4ligatease;rATP
4方法
连接体系如下:
16℃连接过夜。
(二) 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定
1材料
E.coliJM109菌株
2仪器、用具
超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器
3试剂
(1)CaCl2、LB平板(见附录);SOC培养基(见附录);SOB培养基
(2)RNaseA1;BufferS1;BufferS2;BufferS3;BufferW1;无水乙醇的BufferW2a
(3)1×电泳缓冲液(TAE);溴化乙锭溶液(EB)[有毒,小心];琼脂糖;6×加样缓冲液
(4)酚;氯仿;异戊醇
(5)ddH2O;10×PCRBuffer(Mg2+plus);dNTP;M13+;M13-;TaKaRarTaq酶
4方法
1.大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)取大肠杆菌JM109保存液50μl,接种于4mlLB(或SOB)液体培养基中,37℃,300rpm振荡培养过夜,第二天取50μl转接到新的4mlLB(或SOB)液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35~0.4,在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中,冰浴10min。
(2)4℃,5000rpm离心2min,去上清液。
(3)加入750μl预冷的0.1MCaCl2重悬菌体,冰浴30min。
(4)4℃,5000rpm离心2min,弃上清液。
(5)加入100μl冰冷的0.1MCaCl2轻轻重悬菌体,冰浴2h后,4℃保存备用。
2.重组DNA的转化
(1)将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。
(2)于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物,冰浴30min。
(3)将离心管转入42℃水浴,热冲击90秒,然后不要摇动离心管,迅速将其放在冰上2min。
(4)在离心管中加入SOC培养基300μl,枪头混匀,37℃、150rpm温和摇振60min。
(5)将200μl转化菌液均匀地涂布于含50mg/mlAmp、20mg/mlX-gal、200mg/mlIPTG的LB平板上,37℃倒置培养过夜,挑选白色菌落进行鉴定。
注意事项:
①制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作,同时注意近火无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染。
②42℃热处理时很关键,转移速度要快,且温度要准确。
③菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。
3.重组质粒的鉴定
方案一菌落PCR
(1)制备PCR混合液:
(2)用经灭菌的10μl枪头(不用牙签)挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中
(3)盖上离心管得盖子,在沸水上温育10min。
(4)将步骤⑶的样品冷却至室温,离心数秒,然后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。
(5)按以下条件进行PCR反应:
94℃预变性3min;然后进行30个循环反应,其温度循环条
件为:
94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min;循环结束后72℃再延伸5min。
(6)取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二质粒PCR
1.碱裂解法少量制备质粒DNA
(1)用离心管收集4ml在LB培养基(含Amp)中培养过夜的菌液,14000rpm离心30秒,弃尽上清。
(2)用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分悬浮细菌沉淀。
(3)加入250μlBufferS2,温和但充分地上下翻转混合4-6次,此步骤不宜超过5min。
*BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH,降低溶菌效率。
(4)加入400μlBufferS3,温和地上下翻转8-10次,室温静置2min,14000rpm离心10min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部,应再上下翻转数次,12000g离心3min。
(5)将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中,将步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中,5500rpm离心1min。
(6)弃滤液,将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中,加入500μlBufferW1,5500rpm离心1min。
(7)弃滤液,将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中,加入700μl已加无水乙醇的BufferW2,5500rpm离心1min,以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的Buffer
W2洗涤一次。
(8)弃滤液,将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中,14000rpm离心1min。
(9)连滤液一并弃掉收集管,将DNA-prepTube置于一新的1.5ml离心管中,在silica膜
中央加入25-30μlEluent或去离子水。
(10)室温静置2min,14000rpm离心1min洗脱DNA。
(11)取5μL样品,1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。
2.抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。
(1)加TE稀释质粒DNA溶液至300μL。
(2)加等体积的酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),震荡混匀,静置3min。
(3)14000rpm离心5min,吸上清液,加等体积的酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),混匀,静置3min。
(4)14000rpm离心5min,吸上清液,加等体积的氯仿:
异戊醇(24:
1),混匀,静置3min。
(5)14000rpm离心5min,吸上清液,加2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀后-20℃放置15min,沉淀质粒DNA。
(6)14000rpm离心13min,弃上清液,沉淀加入200μL70%乙醇洗涤一次,室温干燥,用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀,-20℃保存待用。
(7)取5μl样品,1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
3.质粒PCR
(1)PCR反应体系如下:
(2)PCR扩增反应条件:
94℃预变性3min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:
94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min;循环结束后72℃再延伸5min。
(3)取5μlPCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,方法与试验二相同。
PCR产物克隆大致分为两类,平滑末端连接和粘性末端连接,平滑末端比粘性末端的连接效率要低很多。
平滑末端连接:
载体为平末端,可用EcoRV或SmaI酶切,同时为了防止载体自连,对载体做了去磷酸处理。
PCR产物为磷酸化的平末端产物:
一般高保真聚合酶扩增得到,高保真聚合酶有很强的3’→5’外切酶活性。
或将非平末端的PCR产物使用DNA聚合酶进行平末端处理。
对于平末端的PCR产物还需要进行磷酸化处理,使其5’磷酸化。
粘性末端连接:
1、酶切克隆:
在PCR引物的5’端引入与载体匹配,不同识别位点的限制性酶切位点,载体使用同样的限制性切酶酶切,进行连接,通常可以得到定向克隆的结果。
2、TA克隆:
TA克隆系统由Invitrogen公司(SanDiego,CA)发展而来的商业性试剂盒,它用PCR产物的克隆和测序。
其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3’T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(MCS)中。
TA克隆没有方向性。
聚合酶链式反应
科技名词定义
中文名称:
聚合酶链式反应
英文名称:
polymerasechainreaction;PCR
定义1:
用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。
所属学科:
生态学(一级学科);分子生态学(二级学科)
定义2:
体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。
所属学科:
水产学(一级学科);水产生物育种学(二级学科)
定义3:
通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。
所属学科:
细胞生物学(一级学科);细胞生物学技术(二级学科)
定义4:
由穆利斯(K.B.Mullis)于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。
所属学科:
遗传学(一级学科);分子遗传学(二级学科)
本容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
目录[隐藏]
[概述]
[PCR原理]
[PCR反应体系与反应条件]
1.1.标准的PCR反应体系
2.2、PCR引物设计
3.3、模板的制备
4.4、PCR反应条件的控制
[PCR步骤]
1.1.DNA变性
2.2.退火
3.3.延伸
[PCR检测]
[PCR反应特点]
1.特异性强
2.灵敏度高
3.简便、快速
4.对标本的纯度要求低
[PCR的循环参数]
1.1、预变性(Initialdenaturation)
2.2、循环中的变性步骤
3.3、引物退火(Primerannealing)
4.4、引物延伸
5.5、循环数
6.6、最后延伸
[PCR仪器]
PCR实验室的建立方法
1.1、实验室布局
2.2、设置标准
3.
(一)试剂储存和准备区
4.
(二)标本制备区
5.(三)基因扩增区和产物分析区
[概述]
[PCR原理]
[PCR反应体系与反应条件]
1.1.标准的PCR反应体系
2.2、PCR引物设计
3.3、模板的制备
4.4、PCR反应条件的控制
[PCR步骤]
1.1.DNA变性
2.2.退火
3.3.延伸
[PCR检测]
[PCR反应特点]
1.特异性强
2.灵敏度高
3.简便、快速
4.对标本的纯度要求低
[PCR的循环参数]
1.1、预变性(Initialdenaturation)
2.2、循环中的变性步骤
3.3、引物退火(Primerannealing)
4.4、引物延伸
5.5、循环数
6.6、最后延伸
[PCR仪器]
∙PCR实验室的建立方法
1.1、实验室布局
2.2、设置标准
3.
(一)试剂储存和准备区
4.
(二)标本制备区
5.(三)基因扩增区和产物分析区
[编辑本段]
[概述]
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶(DNApolymeraseI)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的Klenow
PCR流程
fragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的细菌(Thermusaquaticus)分离出来的。
它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的酶,但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。
而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的,Dr.Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
[编辑本段]
[PCR原理]
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
[编辑本段]
[PCR反应体系与反应条件]
1.标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液
10μl
4种dNTP混合物
200μl
引物
10~100μl
模板DNA
0.1~2μg
TaqDNA聚合酶
2.5μl
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水
100μl
PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即:
引物(PCR引物为DNA片段,细胞DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。
引物有多种设计方法,与PCR在实验中的目的决定。
但基本原则相同
PCR所用的酶主要有两种来源:
Taq和Pfu。
分别来自两种不同的噬热菌。
其中Taq扩增效率高但已发生错配。
Pfu扩增效率弱但有纠错功能。
所以实际使用时根据需要必须做不同的选择
模板即扩增用的DNA,可以是任何来源,但有两个原则,第一纯度必须较高,第二浓度不能太高以免抑制
缓冲液的成分最为复杂,除水外一般包括四个有效成分:
缓冲体系,一般使用HEPES或MOPS缓冲体系;一价阳离子,一般采用钾离子,但在特殊情况下也可使用铵根离子;二价阳离子,即镁离子,根据反应体系确定,除特殊情况外不需调整;辅助成分,常见的有DMSO、甘油等,主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构
2、PCR引物设计
PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。
设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的基本原则
①引物长度:
15-30bp,常用为20bp左右。
②引物碱基:
G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
③引物部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。
⑦引物的5′端可以修饰。
如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
v引物设计软件
PrimerPremier5.0(自动搜索)*
vOligo6(引物评价)
vVectorNTISuit
vDNAsis
vOmiga
vDNAstar
vPrimer3(在线服务)
3、模板的制备
PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。
模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。
也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。
法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
标本处理的基本要除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。
多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。
难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。
所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
4、PCR反应条件的控制
①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子
②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5mmol/L
③底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200umol/L
④TaqDNA聚合酶2.5U(100ul)
⑤引物浓度一般为0.1~0.5umol/L
⑥反应温度和循环次数
变性温度和时间95℃,30s
退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右,一般在45~55℃
延伸温度和时间72℃,1min/kb(10kb)
Tm值=4(G+C)+2(A+T)
循环次数:
一般为25~30次。
循环数决定PCR扩增的产量。
模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的扩增量。
但循环数并不是可以无限增加的。
一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。
[编辑本段]
[PCR步骤]
标准的PCR过程分为三步:
1.DNA变性
(90℃-96℃):
双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
2.退火
(25℃-65℃):
系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3.延伸
(70℃-75℃):
在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。
如图所示:
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
[编辑本段]
[PCR检测]
PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。
荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。
电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。
但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。
近年来以荧光探针为代表的检测方法
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- 基因工程 药物 研发 基本 过程