第四章核酸.docx
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第四章核酸
第四章核酸
第一节概论
⏹一、核酸的发现和研究简史
⏹
(一)核酸的发现
⏹1868年瑞士青年科学家Miescher在外科绷带脓细胞分离得到细胞核,从中提取出一种含磷量很高的酸性化合物称为核素。
⏹1889年Altmann发明了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法。
首次提出了核酸的名称。
⏹1894年Hammars证明了酵母核酸中的糖是戊糖。
⏹1909年Levene年确定戊糖是2-脱氧-D-核糖。
⏹19世纪末~20世纪初Kossel鉴定了碱基。
⏹
(二)核酸的早期研究
⏹Levene“四核苷酸假说”阻碍了核酸的研究。
⏹20世纪40年代,显微紫外分光光度法、组织化学法、亚细胞单位的分离与化学分析法的应用,推翻了“四核苷酸假说”。
⏹(三)DNA双螺旋结构模型结构的建立
⏹早期分子生物学的三个学派:
⏹结构学派:
Astbury用X-射线结晶学技术研究生物大分子的三维结构,并认为研究其起源和功能是分子生物学的主要任务。
⏹信息学派:
Delbruck,Schrodinger、S.Luria认为生命的本质是信息传递的问题:
信息如何被编码?
如何保持其稳定性?
偶然的变异是如何产生的?
⏹生化遗传学派:
用生物化学的方法阐明基因是如何行使功能而控制特定性状的。
⏹1953Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型。
说明了基因的结构、信息和功能三者的关系,使三个学派得到统一,并推动了分子生物学的发展。
⏹1956年Kornberg发现DNA聚合酶。
DNA双螺旋立体结构
⏹1961年JacobMonod提出操纵子学说,并假设了RNA的功能。
⏹1965年Holley测定了酵母丙氨酸RNA的核苷酸序列。
⏹1966年Nirenberg破译了遗传密码。
⏹1970年发现了逆转录酶。
⏹(四)生物技术的兴起
⏹七十年代前期DNA重组技术的建立的基础:
⏹DNA的切割技术—工具酶的发现和应用。
⏹分子克隆—DNA体外重组体的无性繁殖。
⏹1975,1976快速测序—酶法与化学法测序技术的建立。
⏹基因重组技术可应用于改变生物机体的性状特征、改造基因、以至改造物种。
导致了新的生物技术产业群的兴起。
⏹1981年Cech发现了核酶—催化功能。
⏹1983年Simons,Mizuno反义RNA—调节功能。
⏹(五)人类基因组计划开辟了生命科学的新纪元
⏹1990年人类基因组计划实施庞大的人类基因组计划,在经过各国科学家的多年努力,已取得巨大的成就。
十多种低等模式生物的基因组序列测定已完成;
⏹第一个多细胞生物——线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年底完成;
⏹人类基因组的全序列提前到2003、4、14完成。
⏹生命科学已进入了后基因组时代,研究重心已从基因测序转移到基因的功能。
⏹功能基因组学
⏹蛋白质组学
⏹结构基因组学
⏹RNA组学
⏹二、核酸的种类和分布
⏹
(一)、类别:
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)。
⏹核糖核酸(RNA)分成三类:
⏹1、信使RNA(mRNA):
单链差别较大,其顺序决定蛋白质的氨基酸顺序。
⏹2、转移RNA(tRNA):
携带氨基酸,核糖体上,每种氨基酸至少有一种tRNA。
⏹3、核糖体RNA(rRNA):
不稳定,与核蛋白结合。
⏹二、分布:
⏹1、DNA:
⏹原核生物集中于核区.
⏹真核生物细胞核,线粒体、叶绿体亦含有DNA.
⏹原核、真核生物的质粒
⏹病毒含有DNA或RNA.
⏹2、RNA
⏹存在于细胞质和细胞核中。
⏹发现了许多新的具有特殊功能的RNA:
⏹如反义RNA,核酶等.
⏹病毒和亚病毒RNA有许多种:
正链RNA病毒、负链RNA病毒、类病毒、卫星病毒等.
⏹三、核酸的生物功能
⏹
(一)DNA是主要的遗传物质
⏹1、细菌转化实验
⏹2、噬菌体侵染实验
⏹证明了DNA是主要遗传物质
⏹3、有些病毒的遗传物质是RNA.
⏹
(二)RNA参与蛋白质的生物合成
⏹rRNA占细胞总RNA的80%,它是装配者并起催化作用.
⏹tRNA占细胞总RNA的15%,它是转换器,携带氨基酸并起解译作用.
⏹mRNA占细胞总RNA的3~5%,它是信使,携带DNA的遗传信息,并起蛋白质合成的模板作用.
⏹(三)RNA功能的多样性
⏹1、控制蛋白质合成.
⏹2、作用于RNA转录后加工与修饰.
⏹3、基因表达与细胞功能的调节.
⏹4、生物催化与其他细胞持家功能.
⏹5、遗传信息的加工与进化.
第二节核酸的结构
⏹核酸全部磷酸二酯键断裂核苷酸
⏹核苷酸磷酸单酯键断裂核苷+磷酸
⏹核苷糖苷键断裂碱基+核糖
⏹核酸部分磷酸二酯键断裂寡核苷酸
⏹一、核苷酸
⏹
(一)核酸中的糖
⏹D—核糖D—2脱氧核糖
⏹二者都是β型。
⏹差别:
2位羟基是否脱氧。
脱氧核糖与核糖
⏹
(二)碱基:
⏹1、嘌呤碱
⏹2、嘧啶碱
⏹3、稀有碱基
⏹稀有碱基大部分都是甲基化碱基
⏹tRNA稀有碱基约占10%
嘌呤碱基和嘧啶碱基
⏹(三)核苷:
戊糖与碱基通过糖苷键相连,C—N糖苷键。
⏹糖C1与嘧啶碱N1与嘌呤碱N9相连,碱基与糖环垂直。
⏹根据核苷中所含戊糖的不同,分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。
⏹命名先冠以碱基名称,糖环C加‘,碱基不加’。
⏹核苷的顺式结构和反式结构。
⏹ RNA某些修饰化和异构化的核苷,碱基、核糖均可被修饰,主要是甲基化。
⏹tRNA、rRNA还含有少量假尿嘧啶核苷。
核苷
⏹(四)核苷酸
⏹戊糖羟基的磷酸化成核苷酸。
⏹核糖核苷糖环上有3个自由羟基。
⏹脱氧核糖核苷糖环上有2个自由羟基。
⏹环化腺苷酸是细胞功能的调节分子和信号分子。
核苷酸
⏹二、核酸的共价结构
⏹
(一)核酸中核苷酸的连接方式
⏹RNA通过3‘,5‘–磷酸二酯键连接的核苷酸。
⏹DNA通过3‘,5‘–磷酸二酯键连接的核苷酸。
⏹表示方法:
书写顺序5‘——3’。
核苷酸的组成与连接
⏹1、线条式:
竖线碳链、碱基、磷酸
⏹2、文字式:
⏹5'pApCpTpTpGpApApCpG3'DNA
5'pApCpUpUpGpApApCpG3'RNA
⏹此式可进一步简化为:
⏹5'ACTTGAACG3'
5'ACUUGAACG3'
⏹
(二)DNA
⏹1、一级结构
⏹DNA的一级结构A、T、G、C通过3`,5`-磷酸二酯键连接,C’1—碱基,C’2——脱氧。
⏹碱基:
A、T、G、C
⏹脱氧核糖
⏹没有侧链
DNA的一级结构
⏹DNA的相对分子量非常大,通常一个染色体就是一个DNA分子,最大的染色体DNA可超过108bp.能编码的信息量十分巨大。
。
⏹细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因组成操纵子,有共同的调控序列,较少重复序列。
⏹真核生物的基因是断裂的,有内含子功能相关基因不组成操纵子,调控序列占比重大,有较大重复序列。
⏹越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。
⏹2、二级结构
⏹
(1)、模型建立的依据:
⏹aChargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各种生物的DNA的碱基组成。
结果显示:
⏹摩尔数:
A=T;G=C;A+C=G+T;A+G=C+T
⏹
(2)、DNA双螺旋的结构特征:
⏹A、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕,右手螺旋;
⏹B、骨架:
内侧——碱基垂直于纵轴;
⏹外侧——磷酸与戊糖、彼此通过3’、5’磷酸二酯键,糖环平面与纵轴平行。
⏹大沟宽1.2nm,深0.85nm;
⏹小沟宽0.6nm,深0.75nm;
⏹C、直径:
2nm,二相邻碱基高度0.34nm,二核苷酸夹角36度,旋转一周10个核苷酸,一周高度3.4nm;
⏹D、碱基互补配对:
A、T形成两个氢键;GC形成三个氢键,碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。
⏹(三)DNA二级结构的多态性
⏹DNA分子结构可受环境的影响而改变
⏹B型DNA:
在相对湿度92%下制得的纤维是B型结构,适中。
⏹A型DNA:
在相对湿度75%下制得的纤维是A型结构,宽短。
⏹Z型DNA:
碱基与中心的倾角9℃,细长。
⏹三股螺旋DNA.
⏹人工合成DNA发现,第三股嵌在大沟里。
⏹2、三级结构:
⏹细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中,双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。
⏹超螺旋,三级结构中的一种。
⏹DNA压缩总原则:
多级螺旋,4级压缩。
⏹(三)RNA
⏹1、RNA结构的特点
⏹RNA与DNA结构十分相似,二者相比有几点不同:
⏹
(1),核糖:
⏹
(2),碱基:
A、G、C、U
⏹(3),二者在三维结构上的区别——RNA不具有规则的氢键结构,单链形式存在,只是回折,局部配对,不配对形成突环。
⏹2、tRNA
⏹•由70--90个核苷酸组成,在蛋白质合成过程中具有转运氨基酸、识别密码子的作用,在DNA反转录合成及基因表达调控中起着重要的作用。
⏹
(1)、结构特点:
⏹A、有较多的稀有碱基,多为转录后加工而来。
⏹B、3`末端为氨基酸接受臂CCA。
⏹C、5`末端作为GorC。
⏹2、二级结构—三叶草形:
⏹叶柄是双螺旋氨基酸臂;突环三大一小。
⏹A、接受臂:
接受活化AA,末端为CCA。
⏹B、TψC环:
ψ假鸟嘧啶,有TψC顺序。
⏹C、额外环:
变化最大区域,不同tRNA不同大小额外环。
⏹D、反密码环:
7个核苷酸组成,环中部反密码子。
三对碱基组成。
⏹E、二氢尿嘧啶环:
8---12核苷酸,两个二氢尿嘧啶。
⏹3、rRNA
⏹rRNA占RNA总量的80%以上,核糖体由大小两个亚基组成,大小亚基分别几种rRNA和数十种蛋白质组成。
⏹rRNA与几十种蛋白质组成的细胞颗粒——核糖体是细胞内合成蛋白质的工厂。
核糖体上催化肽键合成的是rRNA,蛋白质只是维持rRNA的构象,起辅助作用。
⏹4、mRNA
⏹
(1)原核生物mRNA结构特征
⏹原核生物的mRNA链上有多个编码区(多个基因),为多顺反子,5’和3‘端各有一段非翻译区。
⏹多顺反子:
一个转录本加工而成的mRNA序列中包含多个基团。
⏹编码区:
mRNA中以AUG为起点,以终止密码子为终点,编码AA的一系列密码子序列。
⏹
(2)真核生物mRNA结构特征
⏹真核生物的mRNA都是单顺反子。
⏹单顺反子:
一个转录本加工而成的mRNA序列只代表一个基因。
⏹mRNA5’端都有帽子结构。
⏹绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾。
⏹帽子结构功能:
⏹a、增加mRNA稳定性,保护mRNA免遭5’外切酶的攻击。
⏹b、有助于核糖体对mRNA的识别和结合,使翻译得以正确起始。
⏹mRNApoly(A)尾功能:
⏹A、防止mRNA降解,大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。
⏹B、是mRNA穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。
⏹C、与翻译有关;切除poly(A)尾会影响翻译起始。
第三节核酸的性质及研究方法
⏹一、核酸的水解:
⏹
(一)酸水解:
⏹磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。
⏹磷酸酯键比糖苷键稳定;
⏹嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定;
⏹嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定。
⏹
(二)碱水解
⏹RNA的磷酸酯键易被碱水解;DNA的磷酸酯键对碱稳定。
⏹原因:
⏹1、RNA核糖上2‘-OH基,在碱性条件下形成磷酸三酯,磷酸三酯极不稳定,随即水解,产生2’,3‘环磷酸酯,进而分解成2’,3’核苷酸
⏹2、DNA核糖上无2‘-OH基,不能形成磷酸三酯中间物,因此可以抵抗碱水解。
⏹(三)酶水解:
⏹1、核糖核酸酶
⏹
(1)牛胰核糖核酸酶:
⏹专一性切割位点:
嘧啶核苷-3‘-磷酸与其它核苷酸之间的连键。
⏹产物:
3’-嘧啶核苷酸;或以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。
⏹水解机制:
同碱相似。
⏹
(2)核糖核酸酶T1
⏹专一性切割位点:
3‘-鸟苷酸与其相邻的5‘-核苷酸之间的连键。
⏹ 产物:
3‘-鸟苷酸;或以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸。
⏹(3)核糖核酸酶T2
⏹ 专一性切割位点:
3‘-腺苷酸与其相邻的5‘-核苷酸之间的连键。
⏹ 产物:
3‘-腺苷酸结尾的寡核苷酸。
⏹脱氧核糖核酸酶
⏹
(1)牛胰脱氧核糖核酸酶:
切断双链或单链DNA成为5‘-磷酸为末端的寡核苷酸,平均长度4个核苷酸。
⏹
(2)牛脾脱氧核糖核酸酶:
切断双链或单链DNA成为3‘-磷酸为末端的寡核苷酸,平均长度6个核苷酸。
⏹(3)链球菌脱氧核糖核酸酶:
产物为5‘-磷酸为末端的寡核苷酸,长短不一。
⏹(4)限制性内切酶:
在细菌中发现这类酶,主要降解外源DNA,对自身DNA无作用。
⏹特点:
切割位点往往是回文结构;具有高度专一性,识别双链特定的位点,将两条链切开成粘性,平头末端;用于染色体结构分析、基因测序的分析、基因的体外重组。
⏹二、核酸的酸碱性质
⏹1、碱基的解离
⏹嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮和取代基具有结合和释放质子的能力,因此是兼性离子;
⏹胞嘧啶的解离;
⏹胸腺嘧啶的解离;
⏹腺嘌呤的解离;
⏹鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离;
⏹2、核苷的解离:
糖的存在增加了酸性解离
⏹3、核苷酸的解离:
⏹磷酸基的存在,使核苷酸具有较强的酸性。
⏹三、核酸的紫外吸收:
⏹碱基的共轭双键决定了核酸有紫外吸收。
⏹最大光吸收值260nm,是核酸定量以及定性的基础。
⏹用A260/A280的比值可以判断样品的纯度:
⏹纯DNA的A260/A280比值应大于1.8,
⏹纯RNA应达到2.0;
⏹摩尔吸光系数ε(P)值;ε(P)=A/CL。
⏹单核苷酸ε(P)值大于单链多核苷酸;
⏹单链核苷酸ε(P)值大于双链核苷酸,
⏹因此核酸变性时,ε(P)值增高,称增色效应;核酸复性时,ε(P)值降低,称减色效应。
⏹四、核酸的变性、复性及杂交
⏹
(一)变性:
⏹1、概念:
双螺旋氢键的断裂,不涉及共价键---磷酸二酯键断裂。
⏹2、引起变性的因素:
⏹1)温度的升高;
⏹2)碱酸度改变;
⏹3)尿素、甲醛等。
⏹3、变性的特点:
⏹1)结构变成无规则线团;
⏹2)260nm紫外吸光度升高,粘度下降;
⏹3)爆发式,变性发生在很窄的温度范围,有一个相变的过程。
⏹熔解温度(Tm值):
双螺旋失去一半时的温度。
⏹4、影响DNATm的因素:
⏹
(1)DNA均一性:
⏹均质DNA熔解过程在一个较窄的温度范围内;异质DNA熔解过程在一个较宽的温度范围内。
⏹
(2)G-C含量:
⏹G-C含量越高Tm值愈高;
⏹原因:
GCA=T
⏹测定Tm可以推算出DNA碱基的百分组成。
⏹经验公式:
XG-C=(Tm-69.3)X2.44;
⏹(3)介质离子强度
⏹离子强度较低的介质中,Tm值较低,熔解温度范围较宽;
⏹离子强度较高的介质中,Tm值较高,熔解温度范围较窄。
⏹RNA的变性:
⏹螺旋区较少,变性Tm值较低;tRNA螺旋区较多,变性Tm值较高,类似于DNA。
⏹
(二)复性
⏹两条分开的链重新闭合为双螺旋称复性,复性可部分恢复理化性质,变性DNA骤然降温不能复性,据此可制备单链核酸探针。
⏹缓慢冷却复性称退火。
片段越大复性越慢;浓度越大复性越快。
双螺旋呼吸:
双链DNA配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中,特别是在稳定性较低的富含A-T的区段。
在微观上,常常出现瞬间的单链泡状结构,这种现象称为双螺旋的呼吸作用。
一些蛋白质可识别这种结构,并在单链结构下阅读和识别DNA内部所含信息。
⏹(三)核酸的杂交:
⏹1、概念:
不同来源的分子,经热变性后冷却复性,如异源间某些区域有相同的序列,则会形成杂交分子。
(四)、DNA聚合酶链反应(PCR)
•原理:
•1、变性:
通过加热使双链DNA变成单链DNA。
•2、退火:
温度突然降低,引物与模板链局部形成杂交链。
•3、延伸:
在DNA聚合酶的作用下,进行DNA链延伸反应。
•以上三步为一个循环。
基本步骤:
•1、设计一对引物:
应尽量减少非特异产物。
•2、优化反应体系:
适量模板,引物,4种dNTP,TaqDNA聚合酶,Mg+。
•3、选择热循环温度:
变性温度,退火温度,延伸温度。
•4、鉴定扩增产物:
一般用凝胶电泳。
⏹2、Southern杂交:
固相杂交
⏹样品酶解
⏹五、核酸含量的测定:
⏹1、定磷法:
样品灰化:
浓硫酸或过氯酸处理生成无机磷+钼酸胺磷钼酸+还原剂钼蓝。
⏹2、定糖法:
RNA戊糖糠醛+苔黑酚+三氯化铁绿色
⏹DNA脱氧戊糖羟基酮醛+二苯胺蓝色
⏹3、紫外吸收法:
测碱基
⏹六、核酸的凝胶电泳
⏹用与核酸的分离、鉴定。
⏹核酸带负电荷正极,超螺旋最快,线形次之,开环最慢。
⏹1、琼脂糖凝胶电泳:
核酸大片段,
⏹2、聚丙烯酰胺凝胶电泳:
核酸小片段。
⏹溴化乙锭(EB),紫外光下萤光显色。
⏹思考题:
⏹1、简述tRNA、rRNA、mRNA在蛋白质合成中的作用。
⏹2、试比较DNA和RNA在结构和功能上的区别。
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- 第四 核酸