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报告正文
报告正文
(一)立项依据与研究内容
1.项目的立项依据
肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic1ateralsclerosis,ALS)是神经系统变性病中的代表性疾病之一,同时也是一种进行性致死性疾病,病变主要选择性地侵犯上下两级运动神经元。
由Charcot于1869年首次报道,迄今在该疾患治疗上仍一筹莫展,归根到底对于其病因及发病机制在理论上认识十分有限。
ALS按发病形式分为散发性(SALS)和家族性(FALS)。
两者有相似的临床和病理特征。
强烈提示两者之间虽有病因方面的差异,但在部分信号传导通路环节上可能有着相似的发病机制。
然而,患者出现临床症状时,就已经有大量运动神经元死亡,神经活检可见运动神经元线粒体肿胀,空泡变性、轴突肿胀、胞内包涵体。
这些改变究竟是运动神经元变性的原因?
或仅仅是神经元损伤的阶段性结果?
不得而知。
故寻找始发的病变有助于阐明发病机制。
大量实验证实亚临床期甚至胚胎发育期的运动神经元就出现了病理、电生理、生化方面的异常。
研究者发现2周龄SODl突变小鼠脊髓组织中出现运动神经元线粒体肿胀、胞质空泡形成,其发生早于肌无力的出现[1]。
而运动神经元电生理异常也分别在出生1周的SODl突变新生小鼠、胚胎发育期15天(E15)的胎鼠得到证实[2,3]。
对胚胎发育更早期的运动神经元研究发现,E12.5天的SODl突变胎鼠运动神经元nNOS转录增高,并出现涉及多个分子:
细胞色素C、caspase3生理性凋亡途径易感性增高,极易被邻近胶质细胞释放的细胞因子,如NO激活[4]。
而SODl突变小鼠及ALS患者的星形胶质细胞NOS水平增高,分泌N0增多[5,6]。
SODl突变的运动神经元线粒体肿胀,苍白,呼吸链复合物活性低下[7]。
有人推测线粒体功能障碍可能是导致神经元死亡的始因[1],由此激发了一系列的神经元变性级联反应:
细胞能量缺失→神经元膜电位异常→细胞凋亡[8]。
而且线粒体DNA(mtDNA)的突变或缺失(遗传性或获得性)被认为是导致线粒体功能障碍的关键原因之一[9]。
mtDNA缺失的细胞更易受到外界因素的刺激而诱发凋亡[10]。
那么以线粒体为中心的一系列重要的异常变化:
mtDNA的突变或缺失、电生理异常及凋亡易感性增高发生在胚胎发育生物学的哪一个时间阶段?
胚胎发育过程中细胞生存与死亡调控的建设性作用与所带来的病理生理性效应究竟情况如何?
导致这些异常变化的始因是什么?
哪些异常变化是导致运动神经元变性的直接原因?
以上系列问题均是重点需要解决的问题。
尽管出生后运动神经元功能负荷较其他类型细胞重,但SODl突变基因必须同时累及运动神经元与相应的胶质细胞才会出现选择性的运动神经元变性凋亡[11-13]。
因此,我们推测可能有以下情况发生:
FALS患者在胚胎发育的过程中,突变基因所致的毒性作用可能导致尚处于早期分化的神经干细胞mtDNA的突变或缺失、细胞线粒体功能异常、凋亡易感性增高。
而神经元分化之前这一阶段是FALS病理损伤机制发生的重要时刻。
活性异常的胶质细胞可能承担了启动病理机制的的伴侣细胞的角色。
这一假说若能被证实,则可能一定程度证实FALS是缘于干细胞分化阶段异常的疾病。
而SALS的mtDNA在外界因素及异常活性的胶质细胞的影响下产生突变或及缺失,最终的病理损伤信号传导通路与FALS相似。
转基因小鼠的胚胎体积小,取材困难,因此极大地限制了人们对于ALS疾病还处于胚胎发育“超早期”阶段病变的研究。
目前人们获得的最早的病变证据局限于小鼠胚胎12.5天。
显然,人类ALS发病时程与鼠ALS发病时程不同,人与鼠的种属差异使得对动物行之有效的治疗方案对人无效,这充分说明用动物所得到的数据没有完全真实的、适时地反映人类ALS发病机制的实际过程。
总之,现有的研究ALS的动物模型不能完全真实、客观地反映人类ALS发病机制、限制了人们对ALS疾病处于胚胎发育超早期病变的研究,而刚好此阶段又是最关键的时刻,故寻找能够更客观、准确、全面再现ALS病理、生物化学的疾病模型是明晰ALS发病机制的关键任务。
人胚胎干细胞(hESC)系的建立为解决这一问题提供了契机。
它来源于种植前胚胎内细胞团的高度未分化细胞,具有发育的全能性,在一定条件下能分化出成体动物的所有组织和器官。
故胚胎干细胞是研究多细胞谱系发育的独一无二的体外模型[14,15]。
近期,人类胚胎干细胞能在体外成功的诱导分化为运动神经元[16],为ALS发病机制及治疗的研究提供了全新的契机,带来了曙光。
与转基因动物相比,用人类胚胎干细胞作为研究模型不仅可以进行疾病早期发病机制探讨,可控性的观察疾病发生发展的全过程,更能真实的反映人类ALS发病机制,而且体外细胞模型能很好地克服体内模型存在的内环境干扰,易于添加并观察干预因素对疾病发生发展过程的影响。
本研究拟用我实验室建立的人类胚胎干细胞系(hESCs),用HIV病毒介导SODlG93A突变基因转导,筛选并纯化SOD1G93A+hESCs,建立ALS的体外细胞模型,观测是否能准确、全面再现ALS病理变化。
诱导SODlG93A+hESCs体外向神经干细胞、运动神经元祖细胞、星形胶质细胞祖细胞、运动神经元及星形胶质细胞分化,并在体外纯化扩增以上细胞。
用人类胚胎干细胞体外诱导向运动神经元分化模仿神经元发育过程,从细胞水平及分子水平动态观察SODl突变基因对不同分化时空阶段的细胞的影响,包括形态学、电生理、线粒体DNA及功能、细胞凋亡的影响。
试图从神经发育过程中,发现超早期病理变化,寻找运动神经元变性的始因和关键性时间段,探讨ALS病理性改变的启动与发病机制。
长期以来,以ALS等为代表的中枢神经系统选择性细胞系损伤所致的变性疾病如:
老年性痴呆和Parkinson病等一直是人类面临的巨大挑战,针对其神经细胞变性目前治疗无方。
用人类胚胎干细胞建立各种神经系统变性疾病模型,尤其是建立像ALS这样的经典性疾病的模型,在体外动态观察疾病的发生发展,有助于发现疾病的源头和关键环节,为临床上治疗FALS和SALS提供有效的治疗靶点和理论依据,为神经系统变性疾病提供新的整体治疗思路。
参考文献
1Bendotti,C.CalvaresiN,ChiveriL,eta1.EarlyvacuolizationandmitochondrialdamageinmotorneuronsofFALSmicearenotassociatedwithapoptosisorwithchangesincytochromeoxidasehistiochemicalreactivity.J.NeurolSci.,2001;191:
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6AnneserJM,CooksonMR,IncePG.,eta1.Glialcellsofthespinalcordandsubcorticalwhitematterup-regulateneuronalnitricoxidesynthaseinsporadicamyotrophiclateralsclerosis.Neuron,2001,17,401-411
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8LudolphAC,MeyerT,RiepeMW.TheroleofexcitotoxicityinALS-whatistheevidence?
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9BealMF.MitochondriaandthepathogenesisofALS.Brain.2000Jul;123(Pt7):
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10WangJM,SilvaJP,ClaesMeta1.IncreasedinvivoapoptosisincellslackingmitochondrialDNAgeneexpression.PNAS,2001;98(7):
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11GongYH,ParsadanianAS,AndreevaA,eta1.RestrictedexpressionofG86RCu/Znsuperoxidedismutaseinastrocytesresultsinastrocytosisbutdoesnotcausemotoneurondegeneration.J.Neurosci,2000;20
(2):
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12PramatarovaA,LaganiereJ,RousselJ,eta1.Neuron-specificexpressionofmutantsuperoxidedismutase1intransgenicmicedoesnotleadtomotorimpairment.J.Neurosci,2001;21(10):
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13ClementAM,NguyenMD,RobertsEA,eta1.Wild-typenonneuronalcellsextendsurvivalofSODlmutantmotorneuronsinALSmice.Science,2003;302(5642):
113-117
14陈红,钱坤,张苏明,朱桂金。
人胚胎干细胞建系及体外诱导分化的研究进展.生殖医学,2004,13(6):
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15LevenbergS,GolubJS,AmitM,eta1.Endothelialcellsderivedfromhumanembryonicstemcells.ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(7):
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16LiXJ,DuZW,ZarnowskaED,eta1.Specificationofmotoneuronsfromhumanembryonicstemcells.NatBiotechnol,2005;23
(2):
215-221.
2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题
研究内容:
1用hESCs建立ALS的细胞模型
(1)构建携带人SODlG93A突变及野生型SOD1(SODlwt)HIV病毒载体。
(2)病毒载体扩增、浓缩、滴度测定。
(3)含有目的基因的病毒转导hESCs、筛选出稳定表达SODlG93A及SODlwt细胞株。
(4)稳定表达人SODlG93A及SODlwt细胞株的鉴定及生物学特性分析。
(5)SODlG93A+及SODlwt+hESCs体外扩增。
2检测新模型是否能全面再现ALS病理改变
将SODlG93A+hESCs体外诱导为运动神经元(MNCs):
运动神经元线粒体肿胀、空泡变性、胞内包涵体是ALS典型的病理变化,故以上病理指标是检测新模型是否能全面再现ALS病理变化的金指标。
3用SOD1G93A+hESCs从细胞水平及分子水平研究ALS的发病机制
(1)将SODlG93A+及SODlwt+hESCs体外分别诱导为神经干细胞(NSCs)、运动神经元祖细胞(MPCs)、胶质祖细胞(GPCs)、运动神经元(MNCs)及星形胶质细胞(ALCs),纯化并扩增。
(2)检测不同发育阶段线粒体功能及形态:
膜电位、呼吸链IⅡⅢⅣ酶活性及量。
(3)检测不同发育阶段细胞电生理学特性:
膜电位,动作电位。
(4)检测不同发育阶段一氧化氮合成酶(nNOS)活性。
(5)观察并对比不同发育阶段细胞对NO诱导的凋亡途径敏感性:
细胞色素C释放及量,Capase3量。
(6)观察并对比SOD1G93A+对不同发育阶段mtDNA的影响。
研究目标:
(1)利用人胚胎干细胞来建立能够更客观、准确再现人ALS的病理、生物化学改变的细胞模型。
(2)从细胞水平及分子水平动态观察SODl突变基因对不同分化时间阶段的细胞的影响,探讨ALS病理性改变的启动与发病机制。
(3)为临床治疗提供有效的治疗靶点和整体神经变性病治疗的新策略。
拟解决的关键问题:
理论上:
(1)应用SODlG93A+hESCs建立ALS新型细胞模型,在胚胎发育生物学发生发展的时间与空间阶段中寻找始动性的异常变化,探讨ALS超早期发病机制。
(2)可能在一定程度上证实FALS是缘于干细胞分化阶段异常的疾病。
技术上:
(1)获得高浓度、高纯度的病毒载体。
(2)提高人胚胎干细胞稳定转染的效率。
(3)分别获得SODlG93A+及SODlwt+hESCs、NSCs、MPCs、GPCs、MNCs、ALCs并扩增。
3.拟采用的研究方案及可行性分析
研究方案:
1小鼠成纤维细胞饲养层的制备及hESCs复苏。
2建立携带SODlG93A突变及SODlwtHIV病毒载体:
利用SODlG93A及SODlwt小鼠(可购买)RT-PCR获得人SODlG93A突变及SODlwt的cDNA。
将不同的cDNA插入pSIN18.cPPT.hEF-1_p.EGFP.WPRE质粒(由HerzogR教授,Germany馈赠)SalI位点。
3用包装质粒(packagingplasmid)pCMV△R8.91、外壳质粒(envelopevector)pMD.G(由HerzogR教授,Germany馈赠)及含有目的基因的质粒转染包装细胞293T,48~72小时收集上清,过滤、浓缩,滴度测定。
4病毒转导hESCs,筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
5SouthernBlot鉴定含有目的基因的细胞株。
6对SODlG93A+及SODlwt+hESCs生物学特性进行鉴定:
体外分化全能性,体内形成畸胎瘤能力,免疫细胞化学对细胞表面分子SSEA-3/4,TRA-1-60,TRA-1-81,AKP检测,PCR检测OCT-4的表达及核型分析。
7SODlG93A+及SODlwt+hESCs体外诱导分化。
(1)采用5步法诱导获得NSCs、GPCs、ALCs。
用FACS分离纯化NSCs(nestin+)、GPCs(A2B5)及ALCs(GFAP+)。
(2)采用4步法诱导获得MPCs、MNCs。
用FACS分离纯化MPCs(Pax6,Soxl)、MNCs(Isletl/2+,ChAT+),同时检测SODlG93A+MNCs是否具有ALS疾病典型病理改变:
采用光镜、电镜观察线粒体的肿胀、空泡形成;HE染色及免疫细胞化学检测胞内异常蛋白聚集(抗ubiquitin、SODl)。
8将分离纯化的细胞配对为6组:
(1)SODlG93A+hESCs(实验组)及SODlwt+hESCs(对照组)。
(2)SODlG93A+NSCs(实验组)及SODlwt+NSCs(对照组)。
(3)SODlG93A+MPCs(实验组)及SODlwt+MPCs(对照组)。
(4)SODlG93A+GPCs(实验组)及SODlwt+GPCs(对照组)。
(5)SODlG93A+MNCs(实验组)及SODlwt+MNCs(对照组)。
(6)SODlG93A+ALCs(实验组)及SODlwt+ALCs(对照组)。
获得的所有细胞均进行以下实验:
(1)采用Rhodaminefluorescence法检测线粒体膜电位:
实验细胞用Rhodamine-123(R-123)孵育,R-123被线粒体选择性吸收,而它的吸收依赖于线粒体膜电位。
R-123荧光用激光共聚焦在530nm检测,R-123荧光与线粒体膜电位呈线性关系,线粒体膜电位去极化时,R-123荧光增强,膜电位垮塌时,荧光消失。
对照细胞用PSS液孵育。
(2)呼吸链ⅠⅡⅢⅣ酶活性及量的改变:
分光光度法检测活性,Western-Blot检测蛋白量的变化
(3)采用全细胞膜电位测定并记录不同发育阶段细胞的静息膜电位及动作电位
(4)一氧化氮合成酶(nNOS):
RT-PCR分析nNOS的转录,Western-Blot检测nNOS蛋白量
(5)观察并对比不同发育阶段细胞对NO诱导的凋亡途径敏感性:
A:
细胞色素C的空间分布及释放量的变化:
在SOD1转基因小鼠无症状期及早期诊断的散发性ALS患者发现细胞色素C的释放,而胞浆内细胞色素C的多少影响到细胞的增殖和凋亡。
因此测定细胞色素C空间分布的改变及释放量的变化有重要意义。
细胞色素C空间分布:
破碎细胞,分离线粒体和胞浆,用抗细胞色素C抗体作免疫过氧化物酶染色,用WestemBlot定量检测线粒体及胞浆内细胞色素C,用Fmito/Ftotal-Fmito分析它的分布。
细胞色素C的释放量采用selectivedigitoninpermibilization方法完成。
B:
Caspase3:
采用过氧化物酶染色的方法,利用Caspase3活性检测试剂盒检测其活性;Western-Blot检测Caspase3的量。
6观察并对比SODlG93A+对不同发育阶段mtDNA的影响。
提取不同发育阶段细胞的总DNA。
PCR引物己完成设计,可由上海博亚生物技术有限公司合成。
将不同发育阶段细胞的mtDNA分别进行PCR扩增,凝胶图像分析系统检测电泳产物条带的平均灰度值。
纯化后PCR产物测序,与基因库数据对照(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),将实验组及对照组mtDNA测序结果与公布的mtDNA序列做对照,分析结果。
可行性分析:
(1)立论依据中的提出的科学假说在理论逻辑推导上有充分的依据和佐证。
(2)本课题小组成功地分离培养了2株人胚胎干细胞系并完成相关鉴定,相关报道已投稿著名的英国牛津大学出版杂志(HumanReproduction),已录用,见“附件清单”。
(3)本课题小组有着丰富的干细胞建系、培养、体外分化及基因转染的经验。
对小鼠及人胚胎干细胞在体外向神经干细胞、神经元的分化的条件及基因转染已进行了探索,部分文章已被国内核心期刊刊用和录用,见“近期发表的相关文章”。
(4)本项目的申请人有着较强的科研履历和良好的履约记录。
曾承担并完成各级科研课题,国家自然科学基金课题多项,国家教育部重大科技项目l项。
申请者所在单位为国家自然科学基金管理先进单位,能提供全方位的支持和管理。
4.本项目的特色及创新之处
(1)ALS模型的创新:
由于既往动物模型的局限性,限制了人们对ALS疾病处在胚胎发育最关键时刻——超早期病变的研究,而使用人胚胎干细胞建立ALS的细胞模型在理论上有充分的依据,方法可行,现阶段国内外尚未见报道。
(2)本研究可能发现胚胎发育超早期病变,为提出FALS是干细胞疾病这一创新理论提供实验基础。
(3)使用人类胚胎干细胞模型来真实的反映人类ALS发病机制,探索性研究疾病超早期病理生理机制,并可控性地观察疾病发生发展的关键性过程,技术路线方面在以往ALS研究中未曾见到过。
(4)本研究为今后进一步实施干细胞移植治疗ALS提出新的理论基础。
5.年度计划及预测进展
项目计划进度安排
2006.1~2006.12:
上半年完成SODlG93A及SODlwt突变病毒载体构建、下半年完成病毒扩增,浓缩及滴度测定。
2007.1~2007.12:
上半年完成SODlG93A+及SODlwt+hESCs的转导及阳性细胞扩增。
下半年完成胚胎干细胞生物学特性鉴定。
2008.1~2008.12:
上半年完成SOD1G93A+及SODlwt+hESCs外向NSCs、MPCs、GPCs、MNCs及ALCs的分化、扩增及纯化。
下半年观察SODlG93A对不同分化时空阶段的细胞的影响。
预期研究成果
1获得SODlG93A+突变新型干细胞株,为ALS研究提供新的细胞模型。
2可能发现在干细胞阶段出现的病理变化,为成立FALS是干细胞疾病提供理论性成果。
3可能发现mtDNA的突变或缺失,为ALS治疗提供新靶点。
4在国际杂志上发表3~4篇SCI研究论文,参加国际学术会议,组织鉴定并申报科技奖项。
(二)研究基础与工作条件
1.研究基础
(1)本试验室已建立2株人胚胎干细胞系,相关文章已投稿HumanReproduction,已录用,见“附件清单”。
(2)本课题小组成员完成小鼠及人胚胎干细胞体外向神经干细胞的分化研究,部分相关文章已在国内统计源期刊录用。
见“近期发表的相关文章”。
(3)已获得HIV载体pSINl8.cPPT.hEF-1_p.EGFP.WPRE、包装质粒(packagingplasmid)pCMV△R8.9l、外壳质粒(envelopevector)pMD.G,见“附件清单”。
(4)本课题小组成员已完成对小鼠胚胎干细胞及人胚胎干细胞基因转染条件的探索,部分文章被国内核心期刊录用。
见“近期发表的相关文章”。
(5)本项目申请人长期从事胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞及神经系统变性疾病的基础及应用研究。
有多篇相关文章在国内外核心期刊上发表。
见“近期发表的相关文章”。
并参加过国家自然基金重点项目1项“缺血神经元死亡与保护机制研究(No:
39730170)”,主持完成相关面上项目2项:
“衰老神经细胞DNA损伤与修复在脑缺血过程中的作用(No:
39730170)”和“短暂脑缺血再灌注后神经细胞顿抑现象及其机制的研究(No:
30070825)”。
在研项目“成体多潜能先祖细胞移植后功能性分化及基因修饰治疗Duchenne肌营养不良及其机制研究(No:
30370505)”进展情况好。
以第2负责人的身份参加了国家教育
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