包涵体的纯化和复性总结最全的前人经验概要.docx

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包涵体的纯化和复性总结最全的前人经验概要

<包涵体的纯化和复性总结

二、包涵体的洗涤 

1、包涵体的洗涤问题 

通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体 

对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T（37 KDa）在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。

但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。

8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验

三、关于包涵体的溶解：

1、 请教GST包涵体溶解 

<<<<2、包涵体的溶解

十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？

可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了

3、有关包涵体的溶解问题 

强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。

SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。

另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。

还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。

对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?

我在4度放了半个月，目前没出什么问题 

5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?

BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。

具体有什么影响我也不是很清楚。

做完裂解之后加Triton　X－100轻摇３０min，蛋白溶解的会多些<<<<四、包涵体的复性

1、包涵体如何复性

包涵体的复性主要有两种方式：

1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释

2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂

其中透析很适合实验室应用，但是时间长。

另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。

还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确

包涵体的复性还要注意以下几点：

1.首先要获得较高纯度的包涵体。

2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。

3.透析前后均要离心

4.透析不能太快.

5.纯化的最佳条件要摸索。

小技巧：

1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100.

2） 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性

3）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h

4） 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h

5） 复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解） 

6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。

好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。

<<<<我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。

包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。

因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。

这段文字可以参考：

用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。

渗透休克 用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/min离心0.5 min去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。

加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。

作如下处理：

上清用三氯乙酸（TCA Trichloroacetic acid） 沉淀，加1/10体积100% TCA （w/v），涡漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min离心5 min，100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥1 h，加V1/2体积1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。

超声波裂解细菌 渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min，然后13000 r/min离心5 min，-20℃保存上清、细菌沉淀。

上清进行TCA沉淀，处理同上。

沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反复处理，洗涤包涵体。

包涵体按培养菌100×OD600/3 ul体积加1% SDS溶解，加等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。

1.2.7重组融合蛋白的纯化

<<<

按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。

或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。

洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。

然后12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。

3、包涵体复性2

精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。

另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。

你可以试一试。

对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。

或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。

我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。

我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正确的二硫键。

复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。

5、包涵体复性问题 

包含体复性三大原则：

<<<<1。

低浓度

2。

平缓梯度

3。

低温

有蛋白析出最大的可能型是：

蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。

此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：

8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。

6、包涵体复性形成聚集物

关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！

7、复性中蛋白析出！

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。

复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。

此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。

但是复性的比率应该很低。

若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；

另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。

8、包涵体复性液配方

对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。

对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；不过复性过程主要是注意以下几个问题：

1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；

2） 温度适宜选择4℃；

3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL；

4） 复性时间一般为24-36小时；

5） 低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；；EDTA可以防止蛋白降解；

6） 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。

还有就是你的蛋白质的特性

9、什么叫复性成功

复性效果的检测：

根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

1，凝胶电泳：

一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

2，光谱学方法：

可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

3，色谱方法：

如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，

4，生物学活性及比活测定：

一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

5，黏度和浊度测定：

复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

6，免疫学方法：

如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命活动。

当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。

目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律：

如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。

相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。

另外，还向这位战友荐一文章，有关包涵体蛋白复性的文章！

<<<<10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功

问：

最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性条件下将包涵体溶解，经复性，透析后用GSH sepharose 4B纯化，结果得到了比较纯的融合蛋白，这是否说明GST的活性已得到恢复（因为能与GSH结合），请问这种情况下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？

由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。

如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？

如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？

溶液中的GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？

是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢？

答：

1）。

不可以。

GST 具体多大忘记了，但做为TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相对应的抗体做PULL DOWN，亲和纯化等。

但蛋白的活性是需要构象存在的，一小段TAG 空间结构几乎没有，就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA 对应的抗体结合。

2）。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

3）。

免疫动物要求抗原体种尽量小。

在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。

4） GST为26kd,你得到的蛋白活性应通过 目的蛋白功能分析才能验证是否复性。

GST融合蛋白可以免疫动物，但抗体纯化须用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G进一步纯化，去掉抗GST抗体，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去 ＧＳＴ，再免疫动物.GSH,Tris 是小 分子，没影响。

5） 既然目的蛋白没有活性，何来得活性鉴定，复性是否成功，就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构，这就要看你目的蛋白的特异性，和天然的目的蛋白片断进行比较，看其复性是否彻底，这必须有个对照，才能知道复性是否完全。

不知道你得到目的蛋白有什么用处，如果是用来做抗原，就没有必要进行活性鉴定了。

变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。

最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。

6） 做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些

另外，你看没看过菌液上清里的蛋白量？

那里可能有许多的有活性的蛋白呀

五、包涵体的纯化

复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。

（注：

当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。

）

六、综述以及其他

1、蛋白复性和纯化在线资料

1. 包涵体表达的蛋白的复性 

2. 重组蛋白纯化方法

组织细胞的破碎 

目标蛋白的粗提 

蛋白质沉淀方法 

色谱分离  

2、综述

蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。

可以参考以下文章。

该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。

包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性

包涵体：

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性：

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成：

主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2、重组蛋白的氨基酸组成：

一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3、重组蛋白所处的环境：

发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素：

1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。

2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。

3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。

4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。

破菌：

1、机械破碎

2、超声破碎

3、化学方法破碎

分离：

1、离心：

5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。

2、过滤或萃取方法：

洗涤：

由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。

此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

溶解：

常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。

其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。

去垢剂：

如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。

问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

极端pH：

可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。

如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。

有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。

这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。

变性剂的使用浓度和作用时间：

一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。

有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。

增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。

还原剂：

由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。

还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。

在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。

还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。

对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

复性：

通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。

对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用的方法有：

稀释复性：

直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

透析复性：

好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

超滤复性：

在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

柱上复性：

是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。

常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

还原剂的去除：

还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。

但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有：

空气氧化法：

在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。

氧化还