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CYP含量测定公式
CYP450含量测定公式
万方数据
第18卷第4期中国实验方剂学杂志
V01.18.No.42012年2月
ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae
Feb.,2012
葛根散对急性酒精性肝损伤小鼠肝微粒体
CYP450含量及CYP2E1活性的影响
田维毅1,王庆学2,王文佳1,杨柱2
4
(1.贵阳中医学院免疫教研室,贵阳
550002;2.贵阳中医学院中医基础教研室,贵阳
550002)
[摘要]
目的:
考察经典解酒方葛根散对急性酒精性肝损伤小鼠肝微粒体细胞色素P450(CYP450)含量及细胞色素
P450—2El(CYP2E1)活性的影响。
方法:
实验小鼠分葛根散高、中、低剂量组、正常对照组和模型对照组,各给药组分别给予葛根散水煎剂(按生药量计,20,10,5g?
kg“)ig,对照组代以等体积蒸馏水,每天1次,连续10d;每天给药30rain后,模型对照组和各给药组以15mL?
kg“56%白酒ig,正常对照组代以等体积蒸馏水,以血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及肝脏系数为参考指标,制备急性酒精性肝损伤小鼠模型;取小鼠肝组织检测葛根散对肝微粒体CYP450含量及CYP2E1活性的影响。
结果:
与正常对照组比较:
模型对照组血清ALT、AST水平及肝脏系数显着升高(P<0.01),肝微粒体蛋白含量无明显变化,CYP450含量及CYP2E1活性显着提高(P<0.01)。
与模型对照组比较:
葛根散各剂量组血清ALT,AST水平及大剂量组肝脏系数呈明显降低(P<0.05或P<0.01),肝微粒体蛋白含量无明显变化,CYP450含量明显增多(P<0.01)且有剂量差异性(P<0.05),CYP2E1活性显着降低(P<0.01)且有剂量差异性(P<0.01)。
结论:
葛根散对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能具有良性干预作用,能提高酒精性肝损伤小鼠肝微粒体CYP450含量和降低CYP2E1活性。
[关键词】
葛根散;急性酒精性肝损伤;CYP450;CYP2E1
[中图分类号]R285.5
[文献标识码】
A
[文章编号】
1005-9903l2012)04-0183-04
EffectofGegenPowder
on
CYP450ContentofLiver
Microsomal
and
ActivityofCYP2Elin
Mice
AcuteAlcohol-inducedLiver
Injury
TIANWei—yil,WANG
Qing.x,ue2,WANGWen-jial,YANG
Zhu2+
[收稿日期]20110817(004)
[基金项目】
贵州省科技厅基金项目(黔科合J字[200812290);贵州省省长专向基金项目(黔科合专字[2008]白号)
7
[第一作者]
田维毅,教授,硕士生导师,从事中西医结合研究,E-mail:
tianweiyil972@sina.corn[通讯作者]
’杨柱,博士,教授,硕士生导师,从事中西医结合研究,E-mail:
yangzhu6402@sina.corn
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183?
万方数据
第18卷第4期中国实验方剂学杂志
V01.18.No.42012年2月
ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae
Feb.,2012
(1.LabofImmunology,Guiyang
College
ofTraditional
Chinese
Medicine(TCM),Guiyang
550002,"China;
2.Lab
ofBasic,Guiyang
College
ofTCM,Guiyang550002,China)
[Abstract]0bjective:
To
observetheeffectsof
JiejiurecipesofGegenpowder
on
the,cytochromeP450
(CYP450)content
oflivermicrosomalandtheactivityCYP2E1inmice
acute
alcohol—inducedliver
injurymodel.
Method:
Mouse
were
dividedintonormalcontrolgroup,modelgroupandGegenpowderhigh,mediumnadlow
dosegroups.Gegenpowderof20,10,5g?
kg~,wasgivenoncea
dayandcontinuing
ten
days.After30minutesof
administrationeveryday,themouseofmodelgroup
andtreatmentgroupswere
orallygiven56%alcoholof
15mL?
kg~toestablishacutealcohol—inducedliver
injurymodel,and
thelevelofALT,ASTinserumandliverindexwereobserved;ContentofCYP450andtheactivityofCYP2E1
were.detected.Result:
Compared
withnormalcontrolgroup,thelevelofALT,ASTandliverindexinmodelgrouphadobvious
enhance(尸<0.01),the
content
ofmicrosomalproteinhad
no
significantchange,the
content
ofCYP450andtheactivityofCYP2E1were
significantly
raised(P<0.01).Compared
withmodelgroup,thelevelofALT,ASTandliverindexinGegen
powdergroupshadobvious
reduction(P<0.05or
P<0.01),the
content
ofmicrosomalproteinhad
no
significant
change,thecontentofCYP450wasincreasedsignificantly(P<0.01),theactivityof‘CYP2E1wassignificantly
decreased(P<0.01)and
therewas
a
significantdifferencebetweendifferentdosage
groups(P<0.05).
Conclusion:
Gegenpowderindicatesthetherapeuticeffecton
acute
alcohol-inducedliver
injury,it
can
be
contribute
toincreaseing
the
content
ofCYP450andreduceingtheactivityofCYP2E1
[Keywords]
Gegenpowder;acutealcohol-inducedliver
injury;CYP450;CYP2E1
细胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)是生特勒托利多上海公司),OptimaMAX.XP型超速低
物体内参与物质代谢的主要酶系,广泛存在于肝、
温离心机(美国贝克曼),uV.5500型紫外一可见分光
脑、肺、肾等多种组织细胞的线粒体、细胞核包膜及光度计(上海元析)。
7
微粒体中。
肝微粒体是CYP450在肝细胞内最主要1.3药物与试剂
实验方剂葛根散系金?
张子和
的分布场所。
11。
肝微粒体CYP450是一组混合功能《儒门事亲》解酒方,由甘草、葛根§葛花、缩砂仁、贯
氧化酶系,其主要成分之一CYP450—2El(CYP2E1)众各等份组成,组方药材购自上海同仁堂大药房,经对乙醇等肝毒性物质具有特异性代谢作用,在酒精鉴定为正品,按原方比例制备水煎剂并调整(生药)
性肝病的发病机制中起着至关重要的作用嵋1。
浓度为1g?
mL“备用;56%红星二锅头白酒为北京
CYP2E1诱导产生的自由基不但氧化细胞膜的脂质
红星股份有限公司产品(批号081215)丙氨酸转氨
和蛋白,导致肝细胞结构与功能的损害旧。
;还可以
酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)检测试剂盒购自刺激肝星状细胞分泌胶原,参与肝纤维化过程H1。
南京建成生物工程研究所,牛血清白蛋白购自德国前期研究显示:
急性酒精中毒小鼠出现肝组织病变
Sigma公司(含量99%),氨基呲啉购自北京化学试明显、肝功能损伤严重、肝细胞大量凋亡;葛根散等
剂公司(批号091022),NADPH购自德国Sigma公
解酒方对上述病理改变具有不同程度改善作用。
为
司(含量95%)。
了深入探索解酒方葛根散的作用机制,本文以血清2方法
,
谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平及肝脏2.1
动物分组与处理实验动物分为正常对照组、
系数为参考指标,制备急性酒精性肝损伤小鼠模型,模型对照组、葛根散大、中、小剂量给药组,每组15给予葛根散水煎剂ig干预,探索该方对实验小鼠肝只。
根据药理实验动物给药折算方法,按成人(按
微粒体CYP450含量及CYP2E1活性的影响。
60
kg计算)每天常规用药60g折算实验用药量,葛
1材料
根散大高、中、低剂量分别为生药20,10,5
g?
kg—
1.1动物清洁级昆明种小鼠,雄性,20~22g,购
ig,不同浓度水煎剂给药体积均为0.2mL,每天1自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号
次。
正常对照组和模型对照组代以等量蒸馏水。
每
SCXK(沪)2007-0005]。
天给药30min后,模型对照组和各给药组用56%5红
1.2仪器ABl35-S型梅特勒托利多电子天平(梅
星二锅头白酒ig,15mL?
kg~,每天1次,正常对照
?
184-
田维毅,等:
葛根散对急性酒精性肝损伤小鼠肝微粒体CYP450含量及CYP2E1活性的影响
组代以等量蒸馏水。
所有动物常规饲养,连续10
末次ig
24
d。
乙酸1.5
mL,7000
r?
rain。
离心10rain后,取上清,
h后杀鼠取材检测相关指标。
h后开始禁食(不禁水);24h后每只小鼠
加入Nash试剂1mL,60℃水浴10min后,紫外分光光度计412nm波长处扫描。
以系列浓度的甲醛为横坐标、A值为纵坐标,求得甲醛线性回归方程。
分别吸取待测微粒体0.5mL,Hepes缓冲液0.4
mL,20
2.2小鼠血清ALT,AST水平及肝脏系数的检测
末次ig
12
经眼眶采血,低温离心制备血清,按试剂盒要求检测
ALT,AST水平;采血后,迅速颈椎脱臼处死,取出肝
g?
L“氨基比林0.1
mL,37
oC水浴3rain后
脏,剪去表面韧带和结缔组织,用KCl-蔗糖缓冲液
(0.15
tool?
L~KCI-O.2
加入100
mmol?
L~NADPH0.01
mL,37℃水浴30
tool?
L。
1蔗糖)(pH7.5)洗
rain。
其余步骤同甲醛标准曲线制备,依据甲醛标准
万方数据
净表面血污,用滤纸吸去水滴,称肝重以计算肝脏曲线计算酶活性,以p,mol?
rain~?
mg。
蛋白表示酶
系数。
活性。
2.3小鼠肝微粒体CYP450的含量检测
参照文
2.5数据统计所有数据输入计算机用SPSS13.0
献方法¨。
。
上述肝脏称重后,剪碎,再用KCL一蔗糖
统计软件进行统计,结果以互±s表示,组间采用t检
缓冲液洗2次,充分去除肝脏血液。
按3mL(KCL一
验。
P<0.05有统计学意义。
蔗糖缓冲液缓)?
g一(肝脏组织)比例加入缓冲液,3
结果
置冰浴中制备组织匀浆。
然后以10
000
Xg,4℃离
3.1对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT,AST水平
心20rain,再取上清以105000×g,4oC离心60
及肝脏系数的影响
与正常对照组比较,模型对照
rain,弃上清,淡红色沉淀物即为肝微粒体。
将肝微组血清ALT,AST水平及肝脏系数明显升高(P,<
粒体沉淀取出后用Tris.蔗糖缓冲液(0.05
tool?
L。
1
0.01);与模型对照组比较,葛根散各剂量组血清
Tris-O.25
tool?
L。
蔗糖)(pH7.5)悬浮,经超声细胞
ALT,AST水平及大剂量组肝脏系数有不同程度降粉碎仪混匀,一80℃保存待测。
将待测肝微粒体样低(P<0.05或P<0.01);与葛根散大剂量组比较,
本稀释50倍,采用牛血清白蛋白制备标准曲线,按
葛根散小剂量组血清ALT,AST水平明显较高(P<
Lowery法检测肝微粒体蛋白浓度。
吸取Tris一蔗糖
0.05或P<0.01),肝脏系数无差异显着。
见表1。
缓冲液5.5mL,加入稀释为5g?
L。
的待测微粒体
3.2对急性酒精性肝损伤小鼠肝微粒体CYP450
悬液0.5mL及10%连二亚硫酸钠0.04mL,立即混
含量及CYP2E1活性的影响
与正常对照组比较:
匀。
等量分装到2个比色杯中,分别作为对照和样模型对照组肝微粒体CYP450含量及CYP2E1活性本,于样本池中比色杯充一氧化碳30s,紫外分光光显着提高(P<0.01),但微粒体蛋白含量变化不明度计450nm向490nm扫描并计算CYP450含量。
显;与模型对照组比较:
葛根散各剂量组肝微粒体
计算公式如下(nmol?
mg“)。
CYP450含量显着提高(P<0.05或P<0.01),
蛋白=AA(450
nm一490
nm)×1
000÷91
X稀
CYP2E1活性显着降低(P<0.Ol’),但微粒体蛋白含释后蛋白浓度(g?
L。
1)
量变化不明显;与葛根散大剂量组比较:
葛根散小剂2.4小鼠肝微粒体CYP2E1活性检测参照文献
量组肝微粒体CYP450含量显着降低(P<0.05),方法∞1。
以0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.3,0.4,0.5CYP2E1活性显着提高(P<0.cfl),但微粒体蛋白含
mmo]?
L。
1系列浓度甲醛各1mL,加入12.5%三氯
量变化不明显。
见表2。
表1葛根散对酒伤小鼠血清ALT。
k,ST水平及肝脏系数的影响(;±s)
注:
与模型对照组比较1’P<O.05,2’P<0.0l;与葛根散大剂量组比较3’P<O.05,4’P<0.01(表2同)。
?
185?
第18卷第4期2012年2月
中国实验方剂学杂志
ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae
V01.18,No.4
Feb.,2012
’
表2葛根散对急性酒精性肝损伤小鼠肝微粒体P450含量及P4¥0-2E1活性的影响(;±s)
万方数据
组别
.…
剂量
肝微粒体蛋白含量
n
.
.
/g‘kg~/mg?
g一
正常对照一149.3124±1.1713
模型对照一
131o.9351±1.0322葛根散
20
1312.2896±1.130810
1512.1624±1.2601
5
13
11.2968±1.0113
4讨论
CYP450是一种多功能氧化还原酶,因其一氧
化碳结合物的吸收光谱高峰在450nm处,故叫
P450。
肝微粒体CYP450是肝药酶中最重要的酶系,参与各种外源物(如药物、化学毒物、致癌物等)
和内源物(如类固醇激素、维生素D、胆酸等)在体内的代谢过程。
CYP2E1是CYP450的一个重要亚
型,主要在肝脏表达。
一些疏水性的外来物质经
CYP2E1转化后形成极性更大的物质排出体外,而
有时可能被转化为细胞毒、致癌、致突变作用更强的
物质,因此其生物学效应具有双面性。
乙醇是典型的CYP2E1诱导剂,对CYP2E1诱导可增加乙醛的产生,同时形成蛋白复合物、产生活性氧、导致DNA修复功能降低、减少氧的利用、耗竭谷胱甘肽、介导自由基生成、脂质过氧化,从而导致毒性发生。
体内外研究证实,CYP2E1在酒精性肝病的发病机制中主要参与脂质过氧化反应,与氧自由基和羟自由基的生成有关∞o。
越来越多的研究表明,CYP2E1与各种肝病的关系密切。
因此,探索解酒方剂对肝微粒体CYP450含量及CYP2E1活性的影响,对研究其解酒机制和防治酒精性肝损害具有重要意义。
表1实验结果显示:
①白酒ig导致实验小鼠血清ALT、AST水平及肝脏系数显着改变,提示本实验中实验小鼠肝损伤明显,作为急性酒精性肝损伤动物模型可靠;②葛根散一定剂量下能不同程度地缓解酒伤
小鼠血清ALT、AST水平及肝脏系数的改变幅度,且
具有剂量差异性,这可能是该方防治酒精性肝损害的部分机制,这与我们前期研究结果一致。
7|。
表2实验结果显示:
①急性酒精性肝损伤小鼠肝微粒体CYP450含量显着升高(P<0.01),这可能与乙醇诱导其主要亚型CYP2E1大量表达有关;②葛根散各剂量组酒伤小鼠肝微粒体CYP450含量较模型对照
组有进一步升高(P<0.05或P<0.01),这可能是
因为该方具有诱导肝微粒体中包括CYP2E1在内的某些CYP450酶类表达的作用,也可能与肝微粒体CYP450酶系参与葛根散化学物质的转化代谢有关;③葛根散各剂量组酒伤小鼠肝微粒体CYP2E1
?
186?
细胞色素P450含量
氨基比林N.脱甲基酶
.
.
.
/nmol?
mg“
/斗mo卜min~?
mg。
0.5127±0.0710”0.2078±0.01072’0.7012±0.1104
0.3215±0.0112
1.1832±0.11172’0.2319±0.01472)1.0097土0.11032)0.2406±0.01622)
0.8991±0.10111,”0.25874-0.01032,4)
活性显着降低(P<0.01),这可能与葛根散含有CYP2E1抑制物有关,或者是因为该方通过降低血乙醇水平而减弱乙醇对CYP2E1的诱导作用;④模型对照组肝细胞微粒体蛋白较正常对照组无明显变化,提示乙醇对肝微粒体蛋白总量的影响不大;⑤葛根散各剂量组小鼠肝微粒体蛋白含量较正常对照组明显增多(P<0.05或P<0.01),这可能与肝微粒体CYP450含量增多的现象具有同样的机制。
总之,本文初步考察到葛根散对急性酒精性肝损伤小鼠肝微粒体P450含量及CYP2E1活性具有不同程度的干预作用,其具体机制及其对该方解酒防醉的意义尚待进一步探索。
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