固相萃取反相高效液相色谱法同时测定浓缩果汁中的11种有机酸精.docx
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固相萃取反相高效液相色谱法同时测定浓缩果汁中的11种有机酸精
FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY
食品科技
2010年第35卷第7
期Simultaneousdeterminationof11organicacidsinconcentratedjuicesusingSPE-reverse-phasehighperformanceliquidchromatography
KONGXiang-hong1,FUXing-long1,2,YAOBing-hua2,HEQiang1,ZHANGLei2
(1.ShaanxiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Xi′an710068;2.DepartmentofAppliedChemistry,Xi′anUniversityofTechnology,Xi′an710054
Abstract:
Amethodwasdevelopedforthedeterminationofthetartaricacid,quinicacid,malicacid,shikimic
acid,Vc,aceticacid,maleicacid,lacticacid,succinicacid,fumaricacidandcitricacidinjuicesusingreverse-phasehighperformanceliquidchromatography.ThesamplewasdilutedbywaterandthenwaspurifiedbyC18solid-phaseextraction(SPE.Reverse-phaseliquidchromatographicanalysiswasperformedontheinstrumentofAgilent1100seriesequippedwithadiodearraydetectorandautosampler.ThecolumnwasAichromBondAQC18(25cm×4.6mm,5μm.Themobilephasewas0.02mol/LNH4H2PO4(pH2.8-Methanol(99∶1,v/vwithaflowrateof0.8mL/min.Thedetectionwavelengthwas210nm.Theretentiontimeforalloforganicacidsinthepear,apple,strawberryandpomegranatejuiceswerelessthan15minafterthesamplestreatedbySPE.Thecalibrationcurvefortheorganicacidswasingoodlinearitywithacorrelationcoefficientofupwards0.990.The
固相萃取-反相高效液相色谱法
同时测定浓缩果汁中的
11种有机酸
孔祥虹1,付兴隆1,2,姚秉华2,何
强1,张
磊2
(1.陕西出入境检验检疫局,西安710068;2.西安理工大学应用化学系,西安710054
摘要:
建立了反相高效液相色谱(RP-HPLC同时测定果汁中酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、
Vc、乙酸、马来酸、乳酸、琥珀酸、富马酸以及柠檬酸的方法。
样品直接用水稀释后,再经C18固相萃取柱分离后,采用AichromBondAQC18(25cm×4.6mm,粒径5μm色谱柱分离,二极管阵列检测器检测,外标法定量。
以0.02mol/LNH4H2PO4溶液(pH2.8-甲醇(体积比为99∶1为流动相,在0.8mL/min下等度洗脱,于210nm波长下检测。
1次可以同时测定果汁中的11种有机酸,有机酸的标准曲线相关系数均在0.9900以上,回收率在85.1%~95.5%之间,对苹果汁、草莓汁、梨汁以及石榴汁中的有机酸进行了分析检测,该方法杂质干扰小,回收率高、重现性好,能够对苹果汁、草莓汁、梨汁以及石榴汁中的有机酸进行准确的定性定量分析。
关键词:
固相萃取;反相高效液相色谱法;有机酸;浓缩果汁
中图分类号:
TS207.3
文献标志码:
A
文章编号:
1005-9989(201007-0291-05
收稿日期:
2009-10-21
基金项目:
国家质检总局科研项目(2007IK166;陕西省科研项目(2008K01-06。
作者简介:
孔祥虹(1965—,男,硕士,高级工程师,主要从事食品检测方面的研究及开发工作。
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食品科技
2010年第35卷第7
期
有机酸(如苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、富马酸等是果汁中主要的风味营养物质。
果汁中的有机酸可以促进消化腺活动,有助于食物的吸收,改善患者的食欲。
天然果汁营养丰富,深受消费者青睐。
果汁中有机酸的含量的高低与果汁产品的品质有密切关系,同时也受生产技术和加工工艺的影响。
乳酸是评价果汁产品质量的一项重要指标。
在乳酸菌的作用下,果汁中的碳水化合物发酵生成乳酸,同时在合成苹果酸的过程中也会产生富马酸,因此,若苹果汁中含有富马酸,就有可能添加了合成苹果酸。
然而,在不添加合成苹果酸的情况下,过度的加工条件也能产生富马酸,这是因为在果汁浓缩过程中,苹果酸受热会生成富马酸,因此,相同条件下生产的鲜榨苹果汁比浓缩苹果汁含有较少的富马酸。
如果苹果汁中柠檬酸的含量超出一定的值,对苹果汁而言,可能加入了柠檬酸或其他果汁。
所以一些厂家在果汁的生产过程中会经常添加一些合成有机酸或者将价廉的果汁掺假到价钱比较昂贵的果汁中以获得高额利润,然而国际市场对其含量具有严格的限制,同时我国没有具体制定具体果汁中一些特殊有机酸含量的标准,故研究果汁中有机酸的定性定量检测方法至关重要。
目前测定有机酸的方法主要有光度法[1]、酶法[2]、毛细管电泳法[3]、薄层色谱法[4]、气相色谱法[5]、离子色谱法[6-9]以及高效液相色谱法等[10-13],但这些方法的前处理基本上都是用水直接稀释样品,杂质干扰大,分离效果不好。
固相萃取(SPE技术具有溶剂使用量少、高效、快速的优点[14],已经被证明是一种去除基质干扰物、降低离子抑制、富集目标分析物、改善分析系统性能的有效工具,在LC以及LC/MS分析样品前处理上得到了广泛的应用。
本文在前人研究的基础上,利用固相萃取-反相高效液相色谱法,对果汁中11种有机酸的测定方法进行了研究,并应用于实际样品的分析。
1实验部分1.1
试剂与仪器
酒石酸(纯度99.5%、奎宁酸(纯度99.5%、苹果酸(纯度99.6%、莽草酸(纯度99.5%、Vc(纯度
99.6%、乙酸(纯度99.5%、马来酸(纯度99.6%、乳酸(纯度99.5%、琥珀酸(纯度99.5%、富马酸(纯度99.5%以及柠檬酸(纯度99.5%:
美国Su-pelco公司;乙腈和甲醇:
色谱纯,美国Tedia公司;NH4H2PO4和用H3PO4:
分析纯,天津化学试剂厂;浓缩果汁:
陕西出入境检验检疫局技术中心食品实验室;其他试剂:
分析纯;水为超纯水。
Agilent1100型HPLC仪:
配四元泵、二极管阵列检测器、自动进样器及色谱数据工作站:
美国Agilent公司;HS501digitalIKA-WERK·E振荡器:
德国IKA公司;OasisMAX固相萃取柱:
美国Waters公司;RapidTraceSPE:
美国CaliperLifeSciences公司;自动电位滴定仪:
瑞士万通809;Milili-QAdvantageA10/Elix超纯水系统:
法国Millipore公司。
1.2
对照品溶液的制备
准确称取酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、Vc、乙酸、马来酸、乳酸、琥珀酸、富马酸以及柠檬酸对照品适量,分别置于50mL容量瓶中,用水溶解并定容,超声振荡均匀后得到酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、Vc、乙酸、马来酸、乳酸、琥珀酸、富马酸以及柠檬酸(浓度均为10.00mg/mL的单一对照品储备液。
其他不同浓度的各对照品溶液由储备液稀释得到。
1.3
样品的提取与进化
称取浓缩果汁样品5.00g(精确至0.01g,将pH调至8~10,加水定容至20mL,涡旋振荡溶解,使其混合均匀,以待下一步的净化处理。
分别用5mL甲醇、5mL水预处理MAX固相萃取小柱后,将稀释的果汁过柱富集,控制流速在1.0~1.5mL/min范围,依次用3mL5%氨水、3mL甲醇淋洗固相萃取小柱,弃去全部流出液,氮气吹干10min,用5mL5%甲酸甲醇洗脱,收集洗脱液,于40℃水浴中氮气吹干,最后用流动相定容至1.00mL,过0.45μm微孔滤膜,取滤液用于U-PLC-MS/MS分析。
1.4色谱分析条件
色谱柱AichromBondAQC18(25mm×4.6mm,5μL;流动相包括(A0.02mol/LNH4H2PO4溶液(用H3PO4调pH至2.8、(B水,采用等度洗脱(体积比
recoveryratiooftheorganicacidswas85.1%~95.5%andthecoefficientofvariationwasless4%.Theresultsindicatethatthismethodishandy,fast,veraciousandpracticalfortheroutineanalysisoforganicacidsinjuices.
Keywords:
SPE;reverse-phasehighperformanceliquidchromatography;organicacids;fruitjuicesconcentrate
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期为99:
1,流速0.8mL/mim;色谱柱温度:
35℃;检测波长:
210nm;进样量:
10μL。
在上述色谱
条件下,对11种有机酸的混合标准溶液及浓缩果汁样品进行分析,其HPLC色谱图见图1。
2结果与讨论
2.1
样品前处理条件的选择
果汁的主要成分是糖、有机酸以及色素等,
除糖在紫外区没有吸收,不会影响测定外,其他一些在紫外区有吸收或在C18柱上有保留的杂质都会影响测定,所以在测定前对其进行净化处理。
本文利用C18、OASISHLB以及OASISMAX固相萃取柱对其进行净化处理。
结果表明:
利用MAX固相萃取柱对其富集净化后,减小了杂质峰的干扰,并且缩短了保留时间,所以本实验优先选择MAX固相萃取小柱对其净化处理。
2.2
色谱条件的选择
在色谱柱选择过程中,发现文献[14-16]报道的反相色谱柱对有机酸的分离效果要明显优于其他方法,所以本实验优先选用AichromBondAQC18反
相色谱柱,建立了对果汁中11种有机酸的检测方
法。
在流动相选择时,发现流动相中盐浓度、流动相pH、流动相比例、流速以及柱温对其分离效果都有显著的影响。
实验结果表明,NH4H2PO4缓冲液的浓度对有机酸的出峰时间影响不明显,但是当盐浓度太低,酒石酸和奎宁酸的峰重叠在一起,不能够有效地分离;盐浓度过高,使柱压升高,从而缩短色谱柱寿命;当NH4H2PO4缓冲液的浓度为0.02mol/L时,11种有机酸的出峰时间基本不变,同时样品中杂质的出峰时间前移,分离情况得到很大的改善,所以确定NH4H2PO4缓冲液的浓度为0.02mol/L。
NH4H2PO4缓冲液的pH对有机酸的分离效果有显著影响,流动相的酸度低于
2.7时,酒石酸和奎宁酸以及富马酸和柠檬酸分别重叠在一起,不能有效的分离;当流动相的酸度低于2.9时,乳酸和琥珀酸的峰重叠在一起,不能有效地分离,所以本实验确定缓冲液的pH为2.8。
当缓冲液浓度为0.02mol/L,pH为2.8,调节流动相中缓冲盐与甲醇的比例为99∶1,流速为0.8mL/min,柱温35℃时,样品中的有机酸以及与杂质的分离效果均良好(如图1所示。
2.3
线性关系、检出限及加标回收率
精确移取所配置的11种有机酸对照品一定体积于10mL容量瓶中,用水稀释,配置一系列混
ab
c
3.3753.813
.182
.695
d
A
78fe6.488g
7.097
i
9.976
h
8.564
g
1.004k12.674
注:
a.酒石酸;b.奎宁酸;c.D-苹果酸;d.莽草酸;e.Vc;f.乙酸;g.马来酸;h.乳酸;i.琥珀酸;j.富马酸;k.柠檬酸。
4.2003.889
5.476
D
8.138
9.604
5.916
510
图1对照品和浓缩果汁样品色谱图
3.832
E
8.055
5
10
注:
A.有机酸的混合标准溶液;B.苹果汁;C.梨汁;D.石榴汁;E.
草莓汁。
C
5
10
8.119
4.927
5.497
6.759
9.521
8.659
5
10
4.953
5.511
6.894
8.157
9.563B
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期
合对照品溶液。
取该对照品溶液,根据1.4项所述色谱条件,平行测定3次,每次进样10μL,以对照品溶液的质量浓度(X为横坐标、平均色谱峰面积(Y为纵坐标,进行线性回归,11种有机酸的回归方程、相关系数、线性范围以及检出限见表1。
加标回收率实验:
在每个样品中分别添加1倍、2倍以及3倍3个不同水平的有机酸对照品,每个添加水平重复6次,按1.3规定的方法进行样品制备,按1.4规定的检测方法检测,计算加标回收率,结果如表1所示。
表111种有机酸的回归方程、相关系数、线性范围及检出限(n=3
分析物
线性方程
相关系数
检出限/(μg/g
加入量/(μg/
g
回收率/%RSD/%酒石酸Y=0.047X+11.6330.99611.50
1.5090.101.323.0095.501.024.5092.321.11奎宁酸Y=0.0208X+14.5260.99621.501.50
87.121.983.0087.502.214.5082.251.78苹果酸Y=0.0272X+11.7470.99341.501.50
80.121.893.0088.903.214.5089.212.21莽草酸Y=1.5601X+70.0450.99170.050.05
90.251.890.1090.102.230.1589.501.97VcY=0.3963X+33.1050.99371.501.50
87.153.213.0085.133.414.5088.912.25乙酸Y=0.0168X+30.40.99281.501.50
85.673.113.0085.733.674.5083.212.98马来酸Y=0.7094X+26.2720.99230.050.05
89.152.140.1090.572.560.1591.192.89乳酸Y=0.1702X+158.310.99241.501.50
85.153.523.0088.923.424.5089.702.79琥珀酸Y=0.0189X+17.5040.99401.501.50
87.123.023.0091.23.714.5090.233.09富马酸Y=3.2596X+104.460.99090.050.05
86.341.790.1090.141.950.1589.782.45柠檬酸Y=0.0393X+15.5220.99051.501.50
83.253.013.0086.272.964.50
89.15
2.78
2.4精密度及重现性精确移取1.2项下所配置的有机酸对照品一定体积于10mL容量瓶中,用水稀释成浓度一定的对照品溶液(莽草酸、马来酸及富马酸为4.00μg/mL,其他的均为100.00μg/mL。
精密称取浓缩果汁样品5.00g(精确至0.01g,加入适量的有机酸对照品溶液,按照1.3项下的方法制备供试品溶
液,在本实验所选用的色谱条件下连续进样6次,每次进样10μL,进行测定,结果见表2。
对照品中有机酸峰面积的RSD均小于3.00%,
供试品中有机酸峰面积的RSD均小于4.00%,说明方法的精密度良好,满足测定要求。
精密称取浓缩果汁样品5.00g(精确至0.01g,加入适量的有机酸对照品溶液,按照1.3项下的方
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期表2精密度实验(n=6
RSD/%酒石酸奎宁酸苹果酸莽草酸Vc乙酸马来酸乳酸琥珀酸富马酸柠檬酸对照品0.480.632.940.380.960.230.290.140.510.120.25供试品
2.53
2.72
3.21
1.78
3.56
3.13
2.98
3.57
3.83
2.27
2.96
法制备供试品溶液,在本实验所选用的色谱条件下连续进样6次,每次进样10μL,进行测定,计算有机酸峰面积的RSD均小于6.00%,表明方法的重现性良好。
2.5
稳定性实验
实验中考察了浓缩果汁供试品溶液在8h之内
的稳定性,根据本实验中所选用的色谱条件,每隔1h进样1μL,测得11种有机酸峰面积的RSD均小于6.00%。
3
方法的应用
利用本文建立的方法,共检测苹果汁、梨汁、草莓汁以及石榴汁样品4份,每份检测5批。
具体结果如表3所示。
4结论
本文所建立的方法简便、快速、灵敏、准确,适用性良好,对苹果汁、梨汁、草莓汁以及石榴汁中的有机酸能有效地进行测定,并且有机酸的分离均良好,11种有机酸的回收率及重现性均符合测定要求,此方法可作为快速测定苹果汁、梨汁、草莓汁以及石榴汁中有机酸含量的方法,同时可为其他果汁中及食品中有机酸含量的测定方法提供参考。
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YurenaHernández,MGloriaLobo,MónicaGonzál
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