流式细胞分析技术.docx
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流式细胞分析技术
流式细胞仪分析技术及应用
第一节概述
一、工作原理
二、散射光的测定
三、荧光测量
四、细胞分选原理
第二节数据的显示与分析
一、参数
二、数据显示方式
三、设门分析技术
第三节流式细胞仪技术要求
一、检测样品制备
二、常用的荧光染料与标记染色
三、胶乳颗粒的应用
四、流式细胞技术的质量控制
第四节流式细胞仪技术的要求
第五节、流式细胞仪的科研应用
第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用
一、细胞周期和DNA倍体分析
二、染色体分析
三、细胞表面标志的检测
1、淋巴细胞及其亚群的分析
2、淋巴细胞功能分析
3、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型
四、肿瘤耐药相关蛋白分析
五、AIDS病检测中的应用
六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析
七、移植免疫中的应用
流式细胞术(flowcytometry,FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activatedcellsorting,FACS):
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。
是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。
广泛应用于基础研究和临床实践各个方面,包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。
流式细胞术主要包括:
1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术
流式细胞术发展史:
•1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究
•1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化,用光电仪记录流过一根毛细管的细胞
•1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白
•1949年WallaceCoulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利
•1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞
•1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功设计红细胞光学自动计数器
•1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM发明第一台荧光检测细胞计
•1972年Herzenberg研制出细胞分选器
•1975年Kohler等提出单克隆抗体技术,为细胞研究提供大量的特异免疫试剂
•大量厂家不断生产流式细胞仪
•目前国内主要流式细胞仪厂家:
BecktonDickinson(BD)公司、BACKMANCOULTER公司
流式细胞术的特点:
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下,通过荧光探针的协助,从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选
细胞不被破坏,测量快速、大量、准确、灵敏、定量
主要特点:
单个细胞水平分析;多参数分析(同时多种荧光素标记)水平分析;高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度;可分析大量细胞;速度快:
5000-10000个细胞/秒;统计学意义:
提供细胞群体的均值和分布情况;分选感兴趣的细胞:
血细胞、骨髓、组织培养细胞等。
第一节概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。
流式细胞仪分为三大类:
一类为台式机(临床型):
BDFACSCalibur流式细胞仪特点:
1、仪器的光路调节系统固定,自动化程度高,操作简便,易学易掌握。
2、两激光配置:
488nm633nm3、检测参数:
四荧光参数两个散射光参数
4、分析型流式细胞仪5、应用:
细胞分析检测
第二类为大型机(科研型)
特点:
分辨率高,可快速将所感兴趣的细胞分选出来,并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上,同时可选配多种波长和类型的激光器,适用于更广泛更灵活的科学研究应用。
第三类为新型流式细胞仪:
随着激光技术的不断发展,仪器选用2-4根激光管,最多检测十三个荧光参数,加上散射光信号可达到15个参数的同时分析。
并且可以实现高速分选,速度达到50,000个/秒,并可进行遥控分选,能够满足多种科学研究的要求。
BDFACSAria流式细胞仪:
高速分析分选流式细胞仪;高速分析;高速分选;3根激光:
488nm、633nm、375nm结合特制高性能石英杯流动室;应用:
细胞分析分选、sp细胞检测
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原
粒度
细胞活性
DNA,RNA含量
胞内细胞因子
蛋白质含量
激素结合位点
钙离子,PH值,膜电位
酶活性
一、流式细胞仪的基本结构:
一般分为5部分:
①流动室及液流驱动系统;②激光光源及光束成形系统;③光学系统;④信号检测、存贮、显示、分析系统;⑤细胞分选系统。
概括为三个系统结构:
(1)液流系统
(2)光学系统(3)数据处理系统
光学测量台→电子控制台→数据采集、储存和计算机处理。
光学测量台:
完成光学信号测量和转换
电子控制台:
将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成数据信号→数字信号→最后送入电子计算机里储存处理→输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。
1、液流系统
由样本和鞘液组成
待测细胞→单个细胞的悬液→荧光染料标记的单抗对其染色→受清洁气体压力→从样品管进入流动室形成样本流
鞘液(PBS或生理盐水):
主要作用是包裹样本流的周围,样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦,包裹的细胞排列成单行,以每秒5000个-10000个细胞,每秒10米速度流动室喷出,保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而得到准确的细胞荧光信息。
细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法,流速和压力的关系服从Bernoulli方程:
P=(1/2)PV(勿略高度的变化)
真空泵产生压缩空气,通过鞘液压力调节器加在鞘液上,一个恒定的压力(压力的大小由工厂设定),这样鞘液以均速运动流过流动室,在整个系统运行中流速是不变的。
改变样本的进样速率开关,可提高采样分析的速度。
2、激光源和光学系统
激光光源:
采用气冷式氩离子激光器
分色反光镜:
反射长/短波长,通过短/长波长
光束成形器:
两十字交叉放置的透镜
透镜组:
形成平行光,除去室内光
滤片:
长通、短通、带通
光电倍增管(PMT):
FSC,SSC(散射光),
FL1,FL2,FL3,FL4(荧光)
激光光源与光束成形系统
大多采用氩离子气体激光器:
激光(Laser)是一种相干光源,提供单波长、高强度及稳定性高的光照,是细胞微弱荧光快速分析的理想光源,由于细胞快速流动,每个细胞经过光照区的时间仅为1微秒左右,每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱,与被照射的时间和激发光的强度有关,因此细胞必须达到足够的光照强度。
激光光束在达到流动室前,先经过透镜,将其聚焦,形成几何尺寸约为22×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑(见图1-2-6)。
这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布,为保证样品中细胞受到的光照强度一致。
激光光束与细胞液流呈90°角方向照射,细胞产生散射光和荧光。
光学系统
由若干组透镜、滤光片、小孔组成,它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器
主要光学原件是滤光片(Filter),主要分成3类:
1、长通滤片:
(long-passfilter,LP):
LP500滤片允许500μm以上光通过,而500μm以下光吸收或返回。
2、短通滤片(short-passfiltr,SP):
与长通滤片相反,如SP500滤片允许500μm以下光通过,500μm以上光吸收或返回。
3、带通滤片(band-passfilter,BP):
带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过,一般滤片上有两个数,一个为允许通过波长的中心值,另一为允许通过光的波段范围。
如BP500表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。
3、数据处理系统:
主要由计算机及其软件分析系统组成
二、流式细胞术的工作原理
Ø采用激光作为激发光源,保证其具有更好的单色性与激发效率;利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术,保证检测的灵敏度和特异性;用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析,保证了检测速度与统计分析精确性。
Ø细胞分选:
高精度分选,纯度达90%-99%(细胞活性不受影响)
基本过程图A
流式细胞仪与显微镜的区别
区别
流式细胞仪
显微镜
光源
激光
自然光、灯光
对象
细胞、生物粒子
细胞、组织等
承载工具
鞘液及流动室
载玻片
检测信号
光学信号
形态及染色
放大方式
PMT、放大电路
目镜×物镜、光学放大
统计
计算机,>5000
人工,200
结果
多参数,综合分析
简单,单参数
1、参数测量原理
(1)、散射光的测量
•散射光信号不依赖任何样品的制备技术(如染色),因此称为细胞的物理参数。
•细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号,它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关,主要分为:
•前向散射光(forwardscatter,FSC)(0°散射)
•侧向散射光(sidescatter,SSC)(90°散射)。
•散射光信号波长与激光相同。
前向散射光(forwardscatter,FSC):
激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。
侧向散射光(sidescatter,SSC):
激光束照射细胞时,光以90°角散射的讯号,用于检测细胞内精细结构和颗粒属性,即细胞膜、胞质、核膜结构性质。
目前采用FSC(表示细胞大小)SSC(表示细胞内颗粒的复杂程度)这两个参数组合,检测FSC与SSC信号通过计算机处理,可得到FSC-SSC图,可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体,或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。
光散射测量最有效用途:
从非均一群体中鉴别出某些亚群
(2)、荧光信号(FL)测量
•当激光光束与细胞正交时,一般产生两种荧光信号:
•一种是细胞自发荧光:
细胞自身在激光照射下,发出微弱荧光信号;
•另一种是经过特异荧光素标记细胞后,受激发照射得到的荧光信号,由于90o方向的散射光信号较弱,容易分离出荧光信号,因此此方向上放置必要的光学元件(滤光片、双色分光镜等),可以获取荧光信号。
•通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析,了解所研究细胞参数的存在与定量,反映生物颗粒表面和内部的各种情况。
•荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同,可以显示不同的荧光颜色如红色、绿色、蓝色等。
•每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送入不同的光电倍增管(PMT)。
•一般有两类放大器:
线性放大器和对数放大器
荧光染料的特性:
激发波长(EXCITING)、发射波长(EMISSION)
常用荧光染料:
•常配置的激光器波长为488nm
•通常采用染料:
•碘化丙锭(propidiumiodide,PI)、PI630nm
•藻红蛋白(phycoerythrin,PE)、PE575nm
•异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,
FITC)FITC525nm
•PE-CY5等。
•633nm激光器常用染料有
•APC
•APC-Cy
•①荧光信号的线性测量与对数测量:
•主要由电子线路来完成
•当携带荧光素的细胞与激光正交时,受激发发出荧光,经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT),PMT将光信号转换成电信号。
•电信号输入到放大器放大,放大器分两类:
•线性放大和对数放大
•线性放大器:
即放大器的输出与输入是线性关系,细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。
•②荧光信号的面积和宽度
•所谓荧光信号的面积:
采用对荧光光通量进行积分测量,一般对DNA含量测量时,采用面积(FL2-A),这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量,当形状差异较大,而DNA含量相等的两个细胞,得到的荧光脉冲高度是不等的。
经过对荧光信号积分后,所得到的信号值就相等。
•荧光信号的宽度(如FL2-W)常用来区分双联体细胞,由于DNA样本极易聚集,当两个G1期细胞粘连在一起时,其测量到的DNA荧光信号(FL2-A)与G2M期细胞相等,这样得到的测量数据G2M期细胞比率会增高,影响测量准确性。
通过设”门”(gate)方法,将双联体细胞排除。
其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号(FL2-W)要比单个G2M细胞大,因此设”门”后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。
不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。
•③光谱重叠的校正
•当细胞携带两种荧光素(如PE和FITC)受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时,理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到,而不会检测到另一种荧光。
•要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路,利用标准已知样品或荧光小球,可合理设置荧光信号的补偿值。
•各荧光素的激发及发射波长的峰值,但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线,即有很宽的范围。
如下图,为FTIC,PE的发射波长,可以看到两者的发射波长均为偏态分布,FITC受激后多数将光源转变为525nm左右的光;PE多数将其转变为575nm左右的光。
•同时使用两种荧光染料,就会出现发射光谱相互叠加的现象。
(3)、细胞样品分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。
快速精度分选纯度90%-99%,且细胞活性不受影响。
1、细胞分选时,液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。
在喷嘴下几毫米处,液滴从液流断开。
2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。
3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到,包含该颗粒的液滴断开时,液滴被充电。
断开后的液滴仍然带电,带电的液滴通过被充电的偏转板。
受到静电吸引或排斥,带电液滴将向左或右偏转。
未带电的液滴不偏转而流入废液槽。
(一)分选基本原理图B
•分选收集装置:
微管12×75mm15ml管
•微孔板分选:
可以用24/96/384/1500微孔板进行微孔分选。
•检测指标:
阳性百分率;绝对计数;平均荧光强度
(二)FCM分选指标
•分选速度:
单位时间内分选的细胞数量。
与悬液中细胞的含量成正比。
一般要求分选速度至少达5000个/秒左右,以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。
•分选纯度:
被分选出的细胞所占的百分比,分选纯度与仪器的精密度直接相关,与实验设计的选择密切相关,可达到99%。
•分选收获率:
实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。
与纯度成反比。
•分选得率:
从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量,再经分选后得到目的细胞的实际得率。
与分选速度成反比
(4)、数据处理分析原理
•参数:
FSC,SSC,FL
•数据文件为二进制文件,缺乏直观性,数据的显示常用以下几种数据显示方式:
•单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图
•设门分析技术
•目前FCM数据存贮的方式:
采用列表排队(listmode)方式
•目前FCM所采用的都是多参数指标,荧光参数标记物如是4个,采用listmode方式可大量地节约内存和磁盘容量。
当一个细胞被测4个参数,那么获取10000个细胞,所占容量为4×10000个(字或双字)。
同时当只检测1个参数时(如DNA),可灵活的关闭其它3个参数,节省3/4的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。
(一)、参数:
FSC:
反映颗粒的大小;SSC:
反映颗粒的内部结构复杂程度
FL:
反映颗粒被染上的荧光数量多少
(二)、数据显示方式
直分析方图:
单参数直方图;双参数直方图:
点图、二维等高图、假三维等高图;
三参数直方图;多参数分析
设门分析:
REGION和GATE设置
a单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成,反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度(FSC、SSC、FL1、FL2)四个参数的任何一个值。
其单位是信道,横坐标可以是线性的,也可以是对数的,纵坐标一般是细胞数。
•如图表示细胞DNA单参数直方图,横坐标表示荧光信号强度,纵坐标代表所检测的细胞数。
b双参数直方图
•双参数直方图:
纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数,根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。
•双参数信号通常采用对数信号,最常用的是点密图,在图中,每个点代表一个细胞,点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少
•在二维图中,任选FSC、SSC、FL1、FL2中二个参数作为X轴、Y轴,在二维图上每个点代表一个细胞,可以区分细胞性质不同的群体;
•X坐标为该细胞一参数的相对含量
•Y坐标为该细胞另一参数的含量。
•在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开,同时可获得细胞相关的重要信息。
第三节流式细胞仪技术的要求
•样本制备
•标记染色
•液相芯片技术
•质量控制
一、样品制备
细胞样品制备要求:
1、单细胞悬液;
2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml;
3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料,减少荧光本底;
4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素,产生易区别的两种荧光颜色;
5、如果细胞分选后继续培养,细胞样品制备和上机应该无菌操作。
FCM的检测范围
细胞结构
细胞大小
细胞粒度
细胞表面面积
核浆比例
DNA含量与细胞周期
RNA含量
蛋白质含量
细胞功能
细胞表面/胞浆/核的特异性抗原
细胞活性
细胞内细胞因子
酶活性
激素结合位点
细胞受体
一、检测样品制备
Ø外周血淋巴细胞样品的制备
分离单个核细胞
Ø培养细胞的样品制备
蛋白酶消化→机械吹打→使贴壁细胞脱落→洗涤→尼龙网过滤
Ø新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备:
机械法(金属网引起细胞破碎);酶处理法(选择最适宜消化酶);化学试剂处理法(导致细胞成活率降低);表面活性剂处理法
Ø单细胞悬液的保存:
深低温保存法(一年);乙醇或甲醇保存法(2周);甲醛或多聚甲醛保存法(2月
注意事项:
•1、新鲜组织标本应及时进行处理保存;
•2、根据实验目的选择最隹的固定方法;
•3、酶学法要注意条件的选择和影响因素,要注意酶的溶剂,消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。
•4、需注意不同组织,选择相应的方法;如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等,不一定采用酶学法或化学法;往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞;
•5、在使用酶学方法时,要重视酶的选用,如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等,选用胶原酶较好。
二、常用的荧光染料与标记染色
适用条件:
•有较高的量子产额和消光系数
•荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示:
•F=Q(I-eεCL)
•F表示荧光强度,Q表示光量子产额,I表示激发光强度,£表示消化系数,C表示染液浓度,L表示溶液厚度。
•对488nm的激发光波长有较强的吸收
•发射光波长与激发光波长间有较大的波长差
•易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
荧光素发射荧光的基本原理:
荧光素受到一定波度(激发波长)的激光激发后,其原子核外的电子由于吸收了激光的能量,由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动,然后当电子由激发态重新回到基础态时,释放出能量并发射出一定波长(发射波长)的荧光。
1、要选择正确的激光器:
•不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发:
•FITC和PE等的激发波长均为488nm,用产生可见光的氩离子激光器;APC和PC5等的激发波长在红光范围,需使用发射630nm波长红光的氦-氖激光器。
2、各种荧光素的发射波长也十分重要,据此可以确定其检测所需光电倍增管性质;
如FITC,被激光激发后发射绿光,检测时要使用第一光电倍增管(即PMT1);PE则发射橙色光,需用第二光电倍增管(即PMT2);PC5和PerCP等,发射的是深红色光,这时需选择第三甚至第四光电倍增管(即PMT3或PMT4),等等
定量荧光染色的评价标准
•⑴特异性,荧光染料和所研究的细胞成是否特异性结合;
•⑵荧光强度与检测的细胞成分呈严格的正相关关系;
•⑶使用荧光显微镜检查,荧光的分布是否具有一个核形态结构,荧光分布是否一致,并可看到一个粗大的荧光颗粒;
•⑷用FCM分析评价,以DNA含量分析为例,在组方图上第一个峰(G0/1细胞峰)与第二个峰(G2M期细胞)是否成倍数关系。
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起,在488nm激发光照射下,通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号,从而检测到该特定荧光信号。
(二)免疫荧光标记
Ø荧光染料与细胞成分的四种结合方式
结构亲和式
嵌入结合
共价键结合
荧光标记抗体特异性结合
Ø免疫荧光标记方法
直标:
干扰少,但需购买多种单抗
间标:
步骤多,干扰多,不需标记多种抗体
组合标记
三、免疫胶乳颗粒技术的应用
免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色,把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本,在悬液中与微粒进行特异性地结合,经激光照射后不同待测特产生不同颜色,并可进行定量分析。
因检测速度极快,所以又有“液相芯片”之称。
四、流式细胞技术的质量控制
(一)单细胞悬液制备的质控
•适当的制备方式(不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等)
•试剂选择
•样品处理(蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等)
•实体组织来源标本用机械法
•温度25~37℃,pH7.0~7.2
(二)免疫荧光染色的质控
•温度
•pH
•染料浓度
•固定剂
三)仪器操作的质控
•光路与流路校正:
确保激光光路与样品流处于正交状态,减少变异(CV)。
•PMT(光电倍增管)校准:
保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。
•绝对计
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