MicroRNA21激活NLRP3炎症小体导致非酒精性脂肪肝的作用及.docx
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MicroRNA21激活NLRP3炎症小体导致非酒精性脂肪肝的作用及.docx
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MicroRNA21激活NLRP3炎症小体导致非酒精性脂肪肝的作用及
前言
我国改革开放近40年来,社会主义经济有了蓬勃的发展,国民的物质生活质量水平也在飞跃提升。
与此同时,各种疾病的患病率也在日益升高。
其中脂肪肝,包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝的患病率也在逐年上升。
随之而来的是从脂肪性肝病到肝纤维化进而发展为肝硬化对国家经济和人民健康所带来的威胁。
因此,为了保护宝贵的医疗资源以及社会发展,我们必须积极探寻脂肪性肝病发生、发展的分子机制,同时,也是我们研究的重要课题。
非酒精与脂肪引起的肝脏疾病是以肝细胞内脂质大量沉积为主要病理特征特点的疾病,不包括酒精性因素和其他一些明确因素,主要包括单纯性(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关性[1]。
成人中非酒精性脂肪性肝患病率已经达到10%~30%,而NASH占其中的10%~20%,NASH有25%的可能性在10年内发展为肝硬化[2,3]。
此外,NAFLD不仅仅可以导致肝纤维化、肝硬化、肝癌的发生,还可介导其他慢性肝病、高血压、糖尿病以及动脉粥样硬化等的发生[4]。
在我国国内,非酒精性脂肪性肝病患病率也逐年提升,大约为20%[5],尤其是在我国的富裕城市地区已逐渐流行。
新近的研究显示:
NAFLD是心血管疾病(cardiovasculardisease,CVD)发生发展的一个独立的危险因子[6]。
NALFD能够诱导血管壁增厚、内皮功能紊乱,加速冠脉硬化、狭窄、钙化,加重心脏心肌细胞重构和心室舒张功能障碍等亚临床CVD的发生发展,最后能够增加非酒精性脂肪性肝患者心血管疾病的死亡率[7,8,9]。
肝细胞癌(HCC)是全球五大常见恶性肿瘤之一,如果不及时干预,NAFLD可经肝硬化发展为肝细胞癌。
非酒精性脂肪性肝导致肝细胞癌的主要方式大概可以包括如下:
(1)肝细胞内脂滴沉积可加快癌细胞的转移[10]。
(2)相关蛋白(固醇调节元件结合蛋白(sterolregulatoryelementbindingprotein,SREBP),三重基序蛋白(tripartitemotif,TRIM)24,骨桥蛋白(osteopontin,OPN))能够促使肝细胞恶性转化。
SREBP是介导非酒精性脂肪肝发生的重要物质,敲低SREBPl可使得细胞停止生长和促进细胞凋亡,而升高SREBPl表达则可使得细胞加快增殖[11]。
TRIM24是抑制脂质沉积和肝脏损伤的表观遗传共调节因子[12]。
OPN是一种可以促进肝脏脂质沉积和诱发炎症反应的多功能蛋白[13]。
大家都知道,“二次打击学说”是NAFLD/NASH产生以及后续发展的重要机制,主要表现为以“胰岛素抵制”为主的“首次打击”和以“氧化引起的应激反应”为主的“二次打击”。
胰岛素抵抗(IR)诱导的“第一次打击”可以促使脂质在肝细胞中过量沉积,导致单纯性脂肪肝的发生。
“第二次打击”主要是因为发生氧化应激,促使活性氧(ROS)的大量生成,导致炎症小体的释放以及脂肪的沉淀、产生非细菌引起的病症,进而导致细胞受损甚至死亡,表现为NASH。
所以可以认定,炎症小体介导了非酒精性脂肪肝的发生发展过程。
炎症小体是由多种蛋白质组成的一类复合体。
其中,NLRP3炎症小体是至今科学研究中,结构和功能研究得最为明确的炎症小体之一。
NLRP3炎症小体主要由NOD样受体NLRP3、起连接作用的ASC和没有活性的Caspase1前体组成。
当收到病原相关分子模式(PAMPS)或者是内源性损伤相关的分子模式(DAMPS)的刺激后,炎症小体可以生成能剪切IL-1β和IL-18的前体的具有活性的Caspase1,生成具有活性的IL-1β和IL-18,使得炎症反应得到扩大效应或放大效应。
MicroRNA(miRNA)是一簇内生的、大小约20-24个核酸序列的非编码小RNA,是由pre-RNA前体在经过Dicer酶作用后生产成熟的miRNA。
miRNA可以与其靶基因的3’-UTR段相结合,使靶基因发生转录后抑制,甚至直接沉默。
有大量的miRNAs在肿瘤及其他疾病、病理研究方面被发现,但是在非酒精性脂肪肝方面的研究仍有不足。
miR-21是miRNA系列中的一个重要成员,是到目前为止被研究的比较清楚的miRNA之一。
通过对miR-21表达谱的研究,在消化道、呼吸道泌尿系、淋巴血液等多系统肿瘤中与正常组织具有显著的表达差异[14,15]。
大量有研究表明:
miR-21能够通过作用于靶基因Spry1激活NLRP3炎症小体[16],同时miR-21也能促进脂肪和糖类代谢紊乱所导致的非酒精性脂肪肝的发生[17]。
然而,NLRP3炎症小体是否介导了miR-21诱导的非酒精性脂肪肝的发生?
机制又如何?
基于之前的一些报道,我们假设miR-21通过活化NLRP3炎症小体诱导NAFLD的发生,探讨其中的机制,为非酒精性脂肪肝的的防治给以了新的研究方向。
材料与方法
1主要试剂、材料与设备
1.1主要试剂
高含糖量RPMI1640培养瓶
乳牛血清
青霉素溶液
胰腺霉
SDS凝胶缓冲液
BCA蛋白质含量检测盒
蛋白质电泳分子量标准
聚丙烯胺
氯胺酸
蛋白印迹抗稀释溶液
蛋白印迹二次抗稀释溶液
免疫荧光二抗—蓝
免疫荧光二抗-红
深红O染色实验盒
紫结晶体
VX-765
Sigma-Aldrich,USA
微小RNA-21试剂检验盒
RNA提纯试剂Trizol
一般PCR实验盒
日本塔卡拉公司
Mir-21过表达病毒
上海吉凯基因
Mir-21下调病毒
上海吉凯基因
Spry1antibody
Abcam,USA
p-ERKantibody
Abcam,USA
NF-κBantibody
CellSignalingTechnology,USA
脂质体(Lipo2000)
Invitrogen,China
裂解液(Trizol)
Invitrogen,China
Spry13’UTR质粒
上海吉凯基因
1.2主要耗材
细胞培养基
聚偏二乙烯膜
细胞培养板
细胞培养瓶
细胞冷存低温盒
1.3主要仪器
电子显微镜
激光聚合显微镜
一般光学显微镜
耐低温离心机
分色光度计
超低温冷藏设备
高速冷存离心机
干转电泳仪
荧光扫描机
平行电泳仪
1.4原代细胞
为C57小鼠原代肝细胞;取自健康雄性C57小鼠,4周龄、体重20g-25g;由中南大学湘雅医学院动物实验中心购得。
1.5实验动物
同上
1.6Westernblot主要实验试剂配置
1、氯胺酸电泳缓冲液
SPS
氯胺酸
高纯度蒸馏水
2、1倍转移安置培养液
氯胺酸
高纯度蒸馏水500ml,内含300ml乙醇
3.OBS
高纯度蒸馏水1L,调整其PH到7.4
4.0.004%的OBS溶液
上述制备的200mlOBS溶液加入100ml高纯度蒸馏水。
5.贮藏液
6%的乳牛血清作为贮存液。
6.27%聚丙烯胺
丙烯氨
加入定量蒸馏水至
交叉双丙烯酰胺
6摄氏度贮藏
7.12%过硫酸氨
0.3g过硫酸铵溶解于10ml三蒸馏水中。
8.TEMED :
9、12%交叉胶的制备(12)ml
三蒸馏水
25%聚丙烯胺
12%过硫酸氨
10、7.9%交叉胶的制备(12)ml
三蒸馏水
25%聚丙烯胺
12%或硫酸氨
11、6%压缩胶制备(6)ml
三蒸馏水
25%聚丙烯胺
12%过硫酸氨
2实验方法
2.1临床肝组织和血液的收集
首先,通过多次详细的谈话沟通取得患者信任并得到患者的同意并自愿签署知情同意书。
对照组的肝组织是从由于肝血管瘤需要切除的血管瘤体边缘的正常肝组织中取材,并收取患者的血液标本,本实验中收集12例。
另外,模型组收集12例非酒精性脂肪肝患者的肝组织标本和血液标本,肝组织标本由进行了肝穿刺活检的患者提供。
2.2动物模型制作
2.1:
健康雄性C57小鼠48只,体重为20g-25g之间。
小鼠分为对照组(Control)、高脂饮食组(HFD)、高脂饮食+lenti-NC组(HFD+lenti-NC)、高脂饮食+lenti-mir-21-down组(HFD+lenti-mir-21-down),每组12只。
HDF组喂食高脂肪饲料。
HFD+lenti-NC组动物给予高脂肪含量饲料饮食,同时沿鼠尾静脉注入lenti-NC病毒。
HFD+lenti-mir-21-down组动物给予高脂肪含量饲料饮食以及沿鼠尾静脉注入lenti-mir-21-down病毒。
3组织石蜡块的制备
3.1动物组织获取
在经过一个月的培养期之后,麻醉实验用小白鼠,麻醉使用的是5%的巴戊比酡麻醉剂。
在充分麻醉之后,割下小白鼠的肝脏组织,放到6%甲醇溶液当中保存起来。
其余的肝脏组织放在零下90摄氏度的环境中冷藏起来。
3.2组织脱水、切片以及包埋
.组织脱水:
梯次脱水:
65%酒精(25min)→65%酒精(25min)→75%酒精(25min)→75%酒精(25min)→80%酒精(25min)→80%酒精(25min)→90%酒精(15min)→100%酒精(15min)。
.可视:
二甲苯→二甲苯,每个处理步骤半个小时。
.渗透:
石蜡I(30min)→石蜡II(30min),62℃。
.包埋:
.切片:
-20℃冷冻半小时后,切成5µm左右薄片。
4HE染色
4.1脱蜡、水化
烤片两个小时,浸泡入二甲苯10分钟,再放于浓度梯度的乙醇中:
90%酒精I(6min)→95%酒精(12min)→90%酒精(6min)→100%酒精(6min)→75%酒精(6min)→65%酒精(6min)→双氧水(6min).
4.2HE染色
.赤木精洗5min,然后用含氯清水冲洗。
.分离处理5-10s,氨水反蓝5-10min。
.染红色1min之后,用自来水冲洗。
.用高纯度乙醇脱水,然后用树胶封存。
5油红O染色
(1)先小心轻缓倒去培养夜。
(2)用pbs轻缓漂洗(不洗没问题)。
(3)加95%酒精或10%中性甲醛固定30min。
(4)稀释油红储存液,油红:
去离子水=3:
2。
(5)10分钟左右。
(6)脱色:
异丙醇或酒精漂洗。
(7)复染:
淡苏木染色1分钟
(8)甘油明胶封片(封片后可长期保存)。
6细胞总RNA的提取
(1)在提纯RNA的时候,每20-50mg肝脏组织用1mlTrizdl试剂进行裂解反应;
在提纯肝脏组织的RNA的时候,每6-10*107个细胞加1mlTrizdl后;
(2)把已备好的裂解液移到EP管中;按l:
5体积加入氯仿
(3)取上层水相放入另一EP管中,按1:
2加入异丙醇,放置10分钟,12000g离心10分钟;
(5)弃上清,每2mlTrizol加3ml85%酒精进行脱水操作,9600g(4℃~9℃)离心处理6分钟;
(6)让提纯沉淀下来的RNA在自然环境下风干;
(7)等到RNA比较干燥之后,再加入30μlDEPC水进行二
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