HiScan操作手册.docx
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HiScan操作手册.docx
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HiScan操作手册
Contents
制备MSA12
需要2
准备2
实验2
片段化MSA13
需要3
准备3
实验3
沉淀MSA14
需要4
准备4
实验4
重悬MSA16
需要6
准备6
实验6
芯片杂交7
需要7
准备7
实验7
为下一步准备XC4溶液9
清洗芯片10
需要10
准备10
实验10
荧光反应14
需要14
准备14
实验14
上机扫描荧光信号17
需要17
准备17
实验17
制备MSA1
需要
MA1(-20℃,illumina)
MA2(-20℃,illumina)
MSM(-20℃,illumina)
0.1MNaOH(4℃)
96孔深孔板
DNA样品(50ng/ul)
准备
将置于扩增后区的HybridizationOven温度调至37℃;
给一个新的MIDIplate贴上条形码标签;
在室温下融化MA1,MA2,MSM,颠倒混匀后短暂离心;
将DNA样品融化至室温;
实验
1.每个MSA1平板的样品孔中加入20μlMA1溶液;
2.每个样品孔加入4μlDNA样品;
3.每个样品孔加入4μl0.1NNaOH;
4.用capmat封闭MSA1平板;
5.用vortexer1600rpm振荡MSA1平板1min;
6.280g离心1min;
7.室温下静置10min;
8.每个样品孔加入68μlMA2;
9.每个样品孔加入75μlMSM;
10.用capmat封闭MSA1平板;
11.用vortexer1600rpm振荡MSA1平板1min;
12.280g离心1min;
13.转入扩增后区域操作,将MSA1平板放在37℃的HybridizationOven里20~24hr;
片段化MSA1
需要
FMS(-20℃,illumina)
Heatblock
准备
将Heatblock调至37℃预热;
室温下融化FMS,轻微颠倒混匀,短暂离心;
从HybridizationOven里取出MSA1平板;
实验
1.50g离心MSA1平板1min;
2.每个样品孔加入50μlFMS溶液;
3.用capmat封闭MSA1平板;
4.用vortexer1600rpm振荡MSA1平板1min;
5.22℃下50g离心MSA1平板1min;
6.将MSA1平板置于37℃Heatblock1hr;
沉淀MSA1
需要
PM1(4℃保存,illumina)
100%异丙醇(2-propanol)
Heatblock
准备
将Heatblock调至37℃预热;
室温下融化PM1
去掉MSA1平板的capmat
实验
1.每个样品孔加入100μlPM1;
2.用capmat封闭MSA1平板;
3.用vortexer1600rpm振荡MSA1平板1min;
4.将MSA1平板置于37℃Heatblock5min;
5.22℃下50g离心MSA1平板1min;
6.将离心机温度设为4℃;
7.每个样品孔加入300μl异丙醇;
8.用capmat封闭MSA1平板,上下轻微颠倒平板十次;
9.将MSA1平板放置在4℃下30min;
10.如果即将进入重悬MSA1步骤,现在可以取出RA1放在室温下解冻(RA1不易解冻,解冻后含有少量沉淀,需要摇匀溶解);
11.4℃下3000g离心MSA1平板20min(离心机只能达到2200g,将离心时间延长至30min),迅速取出MSA1平板,可见样品孔中有蓝色沉淀;迅速进入下一步骤,避免沉淀重悬;
12.弃掉capmat
13.迅速弃掉样品孔中溶液,可以用手瞬间甩出样品孔里的溶液,再将MSA1平板连续多次倒扣于吸水纸上,直至样品孔中没有溶液流出为止;
14.将没有封口的MSA1平板保持倒置,放于试管架上,在室温下干燥1hr;可见样品孔底部蓝色沉淀;
15.进入下一步实验,或者用capmat封闭平板,保存在-20℃;
重悬MSA1
需要
RA1(-20℃保存,illumina)
Heatsealer
准备
将HybridizationOven温度调至48℃预热;
打开heatsealer预热,大约需要20min;
室温下融解RA1,颠倒使沉淀溶解;
实验
1.每个样品孔加入46μlRA1;
2.用foilheatseal封闭MSA1平板,将foilheatseal压在MSA1平板上,置于heatsealer中,用sealingblock紧紧压在foilheatseal上持续5sec,再将MSA1平板水平旋转180°,再次用sealingblock紧紧压住持续5sec,迅速进入下一步骤;
3.取出MSA1平板,快速用工具压过整个MSA1平板表面,使每一个样品孔表面都有少许凹陷,确定样品孔完全密封;若平板表面温度在密封好之前已经下降,可以用sealingblock再一次加热;
4.将密封好的MSA1平板放在HybridizationOven里48℃反应1hr;
5.用vortexer1800rpm振荡MSA1平板1min;
6.280g短暂离心;如果MSA1平板之前保存在-20℃,可以重复振荡和离心步骤直至沉淀完全悬浮;
7.进入下一步实验(可在室温下短暂保存)或者在-20℃保存(超过24hr保存需放置在-80℃);
芯片杂交
需要
PB2(室温,illumina)
BeadChips
HybChambers
HybChamberlid
HybChambergaskets
HybChamberinserts
准备
将Heatblock调至95℃预热;
将HybridizationOven温度调至48℃预热速度调至5;
实验
1.将HybChambergaskets放入HybChamber;
2.在HybChamber中,给每一个需要用的保湿槽加入400μlPB2;
3.用HybChamberlid盖住HybChamber防止PB2蒸发;
4.将重悬后的MSA1平板放在95℃的heatblock上20min变性;
5.从4℃中取出BeadChips但暂时不用拆封;
6.从heatblock取下MSA1平板,放置在室温下30min;
7.280g短暂离心MSA1平板;
8.小心去除BeadChips外包装;小心:
避免触碰芯片中心条纹区域和边沿上样孔;
9.将BeadChips放入HybChamberinsert,使芯片的条形码与HybChamberinsert上的条形码区域方向一致;
10.从MSA1平板中取42μlDNA样品,沿芯片上样孔缓慢加入芯片,此过程保持移液器垂直于芯片,并在上样孔保留一个小液滴;可以额外增加上样的样品以保证在上样孔形成液滴;
11.按照图示顺序完成所有样品上样;上样完成后等待样品溶液扩散并浸没所有芯片表面;
12.确定HybridizationOven温度升至48℃;
13.将HybChamberinsert放入HybChamber,使芯片条形码方向与HybChamber中条形码区域方向一致;
14.盖上HybChamberlid,用夹锁固定;
15.将HybChamber平稳的移至48℃的HybridizationOven中,全程避免振荡和摇晃,并且保证HybChamber在HybridizationOven中为横向放置;
16.开启HybridizationOven的晃动开关,在48℃中温育至少16hr,但不超过24hr;可以丢弃MSA1平板;
为下一步准备XC4溶液
1.XC4试剂瓶中加入330ml100%乙醇;
2.剧烈振荡15sec(可手动);
3.室温下放置过夜;若没有放置过夜,加完乙醇后可放置在振荡器上剧烈振荡,等待使用;
4.使用前再次剧烈振荡,确保没有可见图层出现;
清洗芯片
需要
PB1(illumina)
Multi-sampleBeadChipAlignmentFixtureandAlignmentbar
Te-FlowFlow-ThroughChambers(blackframes,spacers,glassbackplates,clamps)
WashDish(glass)
WashRack
准备
从HybridizationOven中取出HybChamber,室温下冷却25min;
给两个WashDish中分别加入200mlPB1,并标记为PB1;
给BeadChipAlignmentFixture中加入150mlPB1;
去掉spacers的白色贴纸;
清洗glassbackplates;
实验
1.安装好Washrack的把手,并把Washrack浸泡入第一个Washdish中的PB1溶液里;
2.取出HybChamberinsert,并取出BeadChips;
3.揭开粘在BeadChips表面的IntelliHybSeal;注意:
IntelliHybSeal粘性较强,一手捏紧BeadChips,另一手从条形码一边揭起膜,一次性、缓慢、连续揭开IntelliHybSeal,一定避免停顿和动作的反复,会给芯片表面留下印迹;seal的胶会在BeadChip边沿留下残余,可以用无粉纸巾吸少许乙醇小心擦拭,一定避免接触BeadChip中心区域;
4.快速将BeadChips放入浸泡在PB1中的Washrack里,确保整张BeadChips都浸没PB1;
5.上下缓慢提放Washrack1min,每次都使BeadChips完全离开PB1液面或者完全浸没液面;
6.将Washrack移入另一个Washdish中,确保BeadChips完全浸没PB1;
7.重复步骤5;
安装Flow-throughChamber
1.对于每一个BeadChip,都需要一个blackframe放入事先乘好150mlPB1溶液的BeadChipAlignmentFixture;
2.将BeadChip从Washrack中取出,放入blackframe,条形码一头与BeadChipAlignmentFixture中有条纹一侧一致;每一个BeadChip都确保完全浸没PB1;
3.仔细检查确保BeadChip表面没有杂物污染;
4.取一个干净的spacer(透明)放置于BeadChip之上;
5.将Alignmentbar装在AlignmentFixture远离BeadChip的条形码一侧;
6.取一个干净的glassbackplate(避免与BeadChip接触面有任何尘埃污染),放置于BeadChip和spacer之上,使glassbackplate的缺口在条形码一侧,面朝BeadChip形成一个漏斗型上样槽,并使glassbackplate的另一端紧贴Alignmentbar;
7.用两个clamps固定每一个Flow-ThroughChamber;
8.取出Flow-ThroughChamber,用剪刀剪去spacer的边沿,需要保留条形码区域;
9.在可以进入下一步实验之前用蒸馏水清洗Flow-ThroughChamber的点样槽以确保不再有PB2溶液残留;注意:
需要去除PB2溶液对后续反应的影响;
荧光反应
需要
RA1(-20℃,illumina)1~8张BeadChips需10ml
XC1(-20℃,illumina)
XC2(-20℃,illumina)
TEM(-20℃,illumina)
XC3(Roomtemperature,illumina)1~8张BeadChips需50ml
STM(-20℃,illumina)
PB1(Roomtemperature,illumina)1~8张BeadChips需300ml
XC4(Roomtemperature,illumina)1~8张BeadChips需300ml
EtOH(Roomtemperature)
95%formamide/1mMEDTA(14.25mlformamide+0.75H2O+30μl0.5MEDTA)
准备
尽早取出RA1融解;
室温下融解所有试剂;
尽早设置watercirculator温度为44℃;注意:
水浴精确温度很难稳定,需尽早开启等待其平衡;
使用前摇晃ChamberRack使里面的气泡排出,能够帮助水浴温度准确稳定;
使BeadChip的Flow-ThroughChamber与检测温度的temperatureprobe相邻放置在ChamberRack里并靠近ChamberRack的进水口,可以使测量的温度更准确稳定;
实验
注意:
下面的步骤不允许中断
单碱基延伸
1.当ChamberRack温度达到44℃,将Flow-ThroughChamber装入ChamberRack,使上样槽向上;
2.剧烈摇晃XC4使溶液完全溶解;
3.在每一个Flow-ThroughChamber中,沿上样槽加入:
a)150μlRA1,静置30sec,再重复5次;
b)450μlXC1,静置10min;
c)450μlXC2,静置10min;
d)200μlTEM,静置15min;
e)450μl95%formamide/1mMEDTA,静置1min,再重复一次;
f)静置5min;
g)将ChamberRack的温度调节至STM管子所写温度,若没有写明则调节至37℃;
h)450μlXC3,静置1min,再重复一次;
4.等待ChamberRack的温度达到正确温度;
荧光标记
1.如果计划实验后立即上机扫描BeadChips,现在需要打开HiScan;
2.在每一个Flow-ThroughChamber中,加入:
a)250μlSTM,静置10min;
b)450μlXC3,静置1min;再重复一次,静置5min;
c)250μlATM,静置10min;注意:
ATM和STM都比较粘稠,如果溶液流过Flow-ThroughChamber的速度比较慢可以多等待几分钟时间;
d)450μlXC3,静置1min;再重复一次,静置5min;
e)250μlSTM,静置10min;
f)450μlXC3,静置1min;再重复一次,静置5min;
g)250μlATM,静置10min;
h)450μlXC3,静置1min;再重复一次,静置5min;
i)250μlSTM,静置10min;
j)450μlXC3,静置1min;再重复一次,静置5min;
3.取出Flow-ThroughChamber,静置于试验台;
清洗和包埋
1.给Washdish加入310mlPB1(300ml即可);
2.将stainingrack放入PB1溶液中,使lockingarm面对自己;
3.用dismantlingtool打开Flow-ThroughChamber上的clamps,去掉glassbackplate和spacer,取出BeadChip,并将BeadChip放入PB1里的stainingrack上;使BeadChip的条形码面对远离自己的方向;
4.上下缓慢提放stainingrack10次,每次都使BeadChips完全离开液面或者完全浸没液面;
5.浸没5min;注意:
不要让BeadChips在PB1中浸泡超过30min;
6.剧烈摇晃XC4使完全溶解;
7.给另一个Washdish中加入300mlXC4;注意:
不要让XC4静置超过10min;
8.将stainingrack放入XC4中;
9.上下缓慢提放stainingrack10次,每次都使BeadChips完全离开液面或者完全浸没液面;
10.浸没5min;
11.取出stainingrack,放置于试管架或者试验台;注意:
确保stainingrack的lockingarm连接稳固;
12.用镊子小心夹住每一片BeadChips的条形码区域取出,放置于一个与真空干燥器大小匹配的试管架上,使条形码朝上且指向自己;
13.将所有BeadChips放在vacuumdesiccator里抽真空干燥1hr,气压为508mmHg(0.68bar);
14.用酒精和无尘吸水纸清理BeadChips背面;注意:
BeadChips背面的污染物会使BeadChips放入HiScan时无法保持水平,从而使HiScan无法扫描到BeadChips荧光信号;
15.清洗所有实验用具;
上机扫描荧光信号
需要
DMAPfile
Manifestfile
Clustalfile
准备
用DMAPDownloadClientUtility下载DMAPfile
实验
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