子宫内膜容受性阵列对子宫内膜种植窗精准判断的研究进展完整版.docx

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子宫内膜容受性阵列对子宫内膜种植窗精准判断的研究进展完整版

子宫内膜容受性阵列对子宫内膜种植窗精准判断的研究进展

（2020完整版）

摘要

当前辅助生殖技术已取得了很大的发展，但是胚胎反复植入失败仍是有待解决的难题，提高植入率的关键在于子宫内膜与胚胎发育的同步以及对胚胎具有最大容受性。

由于种植窗时间存在个体性差异，故精准地判断胚胎植入的最佳时机是目前辅助生殖领域的难点及热点。

以往的硏究多通过经阴道超声、血清雌孕激素水平、子宫内膜活检等方法来判断子宫内膜种植窗的时间，但均存在一定的误差。

近年来,现代分子基因诊断及微阵列技术取得了重大进展，有学者也将其应用于子宫内膜容受性及种植窗的判断，并发现其具有较好的临床指导价值。

现就子宫内膜容受性阵列（ERA）的基本情况、临床应用、应用前景等方面作一综述，为不孕症患者的个体化胚胎移植（pET）提供参考。

【关键词】子宫内膜容受性阵列；种植窗；子宫内膜容受性；个体化胚胎移植

随着体外受精（IVF）和胚胎实验室技术的改善以及植入前非整倍体基因检测技术的出现，目前辅助生殖技术在选择优质胚胎方面已取得很大进展，但是仍有一部分患者的优质胚胎无法成功植入。

胚胎能否成功植入取决于胚胎质量、子宫内膜容受性及胚胎与子宫内膜之间的同步性［1-3］。

其中，最为困难的是使子宫内膜对胚胎具有最大的容受性，而子宫内膜只有短暂一段时期处于容受状态，这一特定时期即为"种植窗"期，故在胚胎移植前精准判断子宫内膜种植窗时间显得尤为重要。

临床上判断种植窗时间常用方法主要有经阴道超声、血清雌孕激素水平、子宫内膜活检等［2,4-5］。

但是这些方法均是对子宫内膜容受性及种植窗时间进行间接评价，存在一定误差［5-7］。

Craciunas等［5］的Meta分析显示，临床上常用的这些检查对精准判断种植窗时间均存在一定局限性，且重复性差,故提高临床医生对子宫内膜容受期及种植窗的总体认知十分必要。

随着以高通量测序技术为基础的基因转录组分析、全基因组关联硏究等现代分子基因诊断技术及微阵列技术的不断发展，结合计算机程序所得的子宫内膜容受性阵列（endometrialreceptivityarray,ERA）检测技术随之诞生。

有硏究表明ERA检测技术对子宫内膜容受性及种植窗时间的判断具有很好的指导价值［3,8-10］。

因此，为给不孕症患者定制更精准的个体化胚胎移植（personalizedembryotransfer,pET）方案提供参考，本文将对ERA的基本情况、临床应用、应用前景等方面作一综述。

1.ERA的基本倩况

1.ERA的机制：

人子宫内膜是一种动态组织，为响应卵巢激素的变化，其基因表达在月经周期中经历多个水平的变化［门］。

增殖期由于雌激素的调控，使得基质细胞和腺体增殖、螺旋动脉伸长，排卵后孕酮上升引起子宫内膜产生分泌性改变，从而获得允许胚泡植入的接受表型。

在允许胚泡植入的这个时期即种植窗，宫内膜经历形态学、细胞骨架、生物化学和遗传学的变化，而这些改变受到严格的基因调控［7,12］。

此外，子宫内膜的基因转录情况在月经周期的所有阶段都已经确定，通过基因聚类分析将子宫内膜基因分成四组，分别对应于其变化的不同阶段：

増殖期、分泌早期、分泌中期及分泌晩期［13］o与非容受性子宫内膜相比，处于容受期时，子宫内膜相关基因的mRNA表达水平也存在差异，在此期间，除了高水平的代谢和分泌活动外，还有参与激活免疫反应的基因上调，随着种植窗关闭，这些基因的表达也逐渐下调或沉默，恢复原来的水平［12,14］。

因此，利用现代分子及高通量技术检测基因的转录和表达水平能够从源头上窥探子宫内膜动态变化情况［12-14］。

随着科学技术发展，现代分子基因诊断技术及微阵列技术取得了极大进步，已被广泛应用到很多领域。

现代分子基因诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学方法对相关基因进行诊断检测。

而微阵列技术是在核酸杂交基础上发展起来的一项新技术，是生物芯片的一种。

该技术的原理是在固体表面上集成已知序列的基因探针，将被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测相应位置杂交探针,可以实现基因信息的快速检测。

在生殖医学领域中，硏究人员利用微阵列技术来硏究子宫内膜容受性相关分子机制及相关治疗的可行性。

2007年，Horcajadas等［15］将这两种技术应用于子宫内膜容受性判断，报道了自然周期黄体期内膜两个差异性的基因表达谱:

"容受前"与"容受期"。

2011年Diaz-Gimeno等［16］的基因组学研究进一步表明内膜由〃容受前〃状态向〃容受〃状态转变过程中有238个基因存在差异性表达，并通过筛选在3种容受性内膜模型［自然周期、控制性超促排卵周期、激素替代周期（hormonalreplacementtherapy,HRT）］中一致表达的基因，确定了内膜容受期的特定基因表达。

ERA即是由此238个差异性表达基因定制的微阵列和一个计算机预测程序联合组成，通过对子宫内膜样品进行计算分析及标记特定的转录组，进一步判断子宫内膜容受性及种植窗的一种分子诊断工具。

无论内膜样本的组织学外观如何，此预测程序均可通过子宫内膜基因转录组学分析识别其容受状态，并判断患者的个体化种植窗，从而进一步定制pET策略［2,4,16］。

综上所述，子宫内膜基因表达是一个动态过程，这些相关基因表达水平的上调或下调反映了子宫内膜形态学及容受状态的变化，而ERA检测技术能够有效检测子宫内膜基因的表达情况,从而判断子宫内膜容受状态。

2・ERA检测技术的方法：

ERA检测技术通过检测子宫内膜组织的238个基因，预测子宫内膜容受状态及种植窗时间。

其检测流程主要为子宫内膜取样、处理及根据ERA检测技术的结果进行相关分析，进而获得所推荐的个体化种植窗。

（1）子宫内膜取样及处理：

ERA检测技术是在自然周期检测到黄体生成素（LH）峰（LH+Od）或通过人绒毛膜促性腺激素（hCG）人工诱导排卵（hCG+Od）后，于LH+7d或hCG+7d进行子宫内膜活检。

在HRT中，应于月经第2日起给雌激素（经皮或口服，必要时两者同时）预处理约2周，月经第14日起阴道超声观察内膜形态及厚度，当出现"三线"型内膜且厚度达至少6mm时，给予黄体酮（P）,该日定为"P+0d",持续5d,并在P+5d进行子宫内膜活组织检查［2,8,17］。

活检后，首先对子宫内膜组织进行ERA转录组学分析［8-9］。

然后,在生物芯片分析仪中评估RNA质量［9］。

接舂，按照操作流程进行基因组的消化、连接、扩增、纯化、片段化、标记信号、芯片杂交与洗涤、扫描以及数据分析,将碎片化的cRNA样品杂交到特定的ERA上，随即在扫描仪中扫描相关的微阵列，使用特定软件提取数据。

最后，对ERA基因表达值进行预处理和标准化，并通过计算机预测程序判断子宫内膜容受状态，从而使得我们获得对特定患者的个体化种植窗推荐［9,16］。

（2）ERA检测结果分析：

通过ERA检测技术对受检内膜容受状态给出"容受期（receptivity,R）"或"非容受期（non-receptivity,NR）"的报告，"NR"状态的结果又分为"容受前”和"容受后"，并提供了调整移植时间或重新活检的建议［9,16-17］oERA检测结果为"R"内膜的患者，pET通常在下一周期的同一时间进行胚胎移植［17］o对于判断为"NR”内膜的患者,可以在随后的周期中再次活检，若拒绝再次行ERA检测,则按初次检测结果调整胚胎植入的时间，从而实现pET［4,8］。

再次活检者，若第一次活检为"容受前"结果，第二次活检建议在自然周期的LH+9d或激素替代周期的P+6d、P+7d［9］o若第一次活检为"容受后”结果，第二次活检建议在P+4d或P+3d［9］。

通过此法，种植窗移位的患者可根据ERA检测技术识别出个体化种植窗，从而在其后的周期中调整胚胎移植时间，以达到pET。

ERA检测技术相关临床应用

现代分子基因诊断技术及微阵列技术的引入在改善疾病诊断及后续治疗方面取得了快速进展。

自2007年Horcajadas等［15］将ERA检测技术应用到子宫内膜容受性及种植窗时间判断之后，已经有许多学者对其进行了不断地验证、探索和临床应用［3,8-10,15-18］。

ERA检测技术对不孕症患者寻找个体化种植窗及进行pET具有临床指导价值，能够使这些患者达到更有利的生殖结局。

2014年Ruiz-Alonso等［3］报道了1例经历4次IVF和接受3次赠卵失败的病例，进行ERA检测后显示其种植窗移位至P+7d,根据ERA检测结果应用pET,成功获得了双胎妊娠及成功分娩，显示了这一治疗的有效性。

但该硏究仅为个案报道，随后Simon等［19］选取了356名即将行第一次体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的不孕症患者，进行了—项前瞻性随机研究,结果证明，与新鲜胚胎移植及冻融胚胎移植相比,ERA检测确定个体化种植窗后再行pET的患者其临床妊娠率显著増高（61.7%比60.8%比85.7%）z其植入率（35.3%比41.4%比47.8%）和持续妊娠率（43.3%比44.6%比55.1%）也呈增高趋势f该硏究进一步证实了ERA在不孕症患者中应用的临床价值，与常规的胚胎移植相比，进行ERA检测的患者拥有更佳的妊娠结局，但该文只进行了结果的简要报道，无详细全文报道。

2018年‘Mahajan等［20］对36例子宫腺肌症患者（研究组）和338例无子宫腺肌症患者（对照组）进行ERA检测发现，种植窗在子宫腺肌症患者中移位的概率显著增加（47.2%t匕21.6%）,且研究组经过pET后的妊娠率明显増高，该硏究表明，移位种植窗是导致子宫腺肌症患者植入失败的主要原因之一，患有子宫腺肌症的不孕患者进行胚胎移植前利用ERA检测技术评估子宫内膜容受性是十分有必要的。

此外，Diaz-Gimeno等［10］分析了771名经ERA检测技术诊断的不孕症女性，将内膜容受性基因表达进行聚类，提炼出了更多亚型，确定了其转录组学特征，分别为容受前早期、容受前晚期、最佳容受期和容受晚期。

这些种植窗转录组学亚型间在生殖结局上的差别主要集中在持续妊娠率和生化妊娠率上，容受前晚期组和最佳容受期组的持续妊娠率介于76.9%至80%之间，而容受晚期组为33.3%O容受前晚期组及最佳容受期组的生化妊娠率分别为7.7%和6.6%,但在容受性晚期组达到了50%。

该硏究提供了种植窗中转录组学分层的新见解，使得有可能检测出与获得成功妊娠相关的最佳转录组，并且进一步证实了内膜细微的状态变化与胚胎植入过程具有密切相关性。

故ERA检测技术的出现,对确定不孕症患者的pWOI，促进pET,提高患者的植入率及临床妊娠率有重大意义，具有广泛应用前景［2,10］。

虽然上述硏究肯定了ERA在临床工作中的应用价值，提示ERA有可能成为精准识别种植窗的检测手段。

但仍有些硏究得出了阴性结果，因此，对于ERA检测技术的临床应用尚存在一定争议。

2018年Tan等［17］通过纳入88名既往超过1次冻融胚胎移植（frozen-thawedembryotransferzFET）失败的受试者，进行ERA检测，发现其中22.5%的患者种植窗发生移位，对其中部分患者行pET,结果显示其植入率和持续妊娠率与未行pET组相比差异没有统计学意义。

随后，Bassil等［18］进行了一项单中心回顾性队列硏究，选取了41例将进行IVF-ET的患者为研究组，在进行ERA检测后行FET,选取未行子宫内膜活检及ERA检测的503例患者作为对照组，结果显示硏究组妊娠率与对照组相当（33.3%比35.2%）。

该研究提示在FET之前的模拟周期中进行ERA检测似乎不能改善不孕症患者的妊娠率。

2019年,Neves等［21］单中心回顾性分析了ERA检测后"次整倍体胚胎移植失败或次卵母细胞捐献胚胎移植失败的患者，对照组为同期>1次整倍体胚胎移植失败或二2次卵母细胞捐献胚胎移植失败，但未行ERA检测的患者，研究显示对于整倍体胚胎移植失败的患者,ERA组与对照组移植率分别为55.6%和65.0%,妊娠率分别为58.3%和70.6%,两者差异无统计学意义；对于卵母细胞捐献胚胎移植失败的患者，ERA组与对照组移植率分别为26.8%和57.2%,妊娠率分别为34.4%和65.2%,ERA组妊娠率和移植率均显著降低，差异有统计学意义。

故进行ERA检测并没有改善妊娠结局，然而，在这项研究中，没有考虑到胚胎的倍性状态。

但以上阴性结果的硏究样本量均较少，且为回顾性硏究，故仍需进一步的大型前瞻性研究来阐明ERA检测技术在整体不孕症患者中的作用。

但近年来，许多硏究报道，ERA检测技术对反复种植失败（recurrentimplantationfailure,RIF）的患者具有更好的指导价值,在RIF患者中应用ERA检测技术进行pET能显著提高植入率及临床妊娠率。

研究表明，约25%的RIF患者种植窗发生置换，对RIF患者行ERA检测并且在ERA指定的当天行pET,能提高RIF患者的妊娠率和植入率,改善其妊娠结局［3,8-9］。

2013年Ruiz-Alonso等［9］在一项前瞻性多中心试验中首次进行了该技术的临床应用，该试验选取了85例RIF患者和25例正常对照者，通过ERA检测技术指导子宫内膜取样及pET,结果表明，与对照组相比，RIF患者中种植窗移位的比例增加。

对种植窗移位的RIF患者进行pET,发现处于"NR”子宫内膜状态的患者出现与对照组及处于"R"子宫内膜状态的RIF患者相似的妊娠率和植入率。

该研究提示对种植窗移位的RIF患者进行pET能得到更高的妊娠率和植入率。

随后,Ruiz-Alonso等［3］选取了17例接受卵母细胞捐赠或多次常规移植失败的患者，在判断其个体化种植窗后使用pET治疗，植入率从12.9%増加到34.5%,妊娠率从23.5%增加到52.9%,得到成功的生殖结局。

2017年，日本—项针对50例RIF患者的回顾性研究显示，ERA检测结果和病理学分期结果之间的差异在"NR”状态的患者中比在"R"状态的患者中更明显。

对其中进行pET的44例患者随访显示，子宫内膜处于“R"状态的患者妊娠率为58.8%（每人）及35.3%（每pET周期），而子宫内膜处于"NR"状态的患者能达到50.0%（每人）及50.0%（每pET周期）［8］。

此外，"NR"组中所有妊娠病例均为首次pET后得到妊娠，因此与"R"组相比,"NR”组中的患者从进行第一次ERA检测到获得成功妊娠之间的间隔时间更短。

2019年，Patel等［7］的研究纳入了248例接受ERA检测的不明原因RIF患者，比较处于"R”状态子宫内膜的患者及处于"NR”状态子宫内膜且接受pET的患者的临床效果，结果显示，患有RIF并且有种植窗移位的患者经过由ERA指导pET后其植入率及持续妊娠率得到明显提高。

故对于原因不明的RIF患者，使用ERA检测技术寻找个体化种植窗具有重要意义。

综上所述，虽然关于ERA检测技术的应用仍然存在一定争议，但pWOI指导下的pET能够使不孕症及RIF患者达到更有利的生殖结局,这一事实进一步强调了利用客观的分子诊断工具寻找个体化种植窗的重要意义。

此外，多个研究的临床结果也证实了在不孕症及RIF患者中进行ERA检测的诊断和治疗功效，它使pET成为可能［2-3,8-10］o

三总结

ERA检测技术是子宫内膜容受性硏究的一种新的分子硏究工具，因为它包含有限数量的子宫内膜容受性基因，避免使用全基因组芯片，从而一定程度上降低了成本并简化了数据［16］。

此外，ERA检测技术还引入个体化种植窗及pET概念，破除了种植窗是恒定的想法，识别出不孕症患者的种植窗移位现象，并使辅助生殖技术向个体化医疗更进一步［2,9,22］。

同时提示精准医疗对于生殖医学领域的重要性,表明其存在广阔应用前景。

更重要的是，无论内膜样本的组织学外观如何，此预测程序均可通过子宫内膜基因转录组学分析识别其容受性状态,并识别患者的个体化种植窗，从而进一步指导pET［23］o其准确性已被证明优于组织病理学，主要原因在于进行组织病理学诊断时主观判断和偏见是不可避免的，病理学家也很难区分子宫内膜处于容受前状态至容受性状态、容受性状态至容受后状态之间的过渡阶段［4,8］。

实际上，一些ERA检测结果判定种植窗为P+5.5d或P+4.5d,但是很难通过经典组织病理学检查来评估如此精确定时的种植窗［8］。

另外，Ruiz-Alonso等［9］的硏究表明，即使基因之间可能存在一些差异，但对于同一患者，ERA检测的样本的转录组学特征在整体上没有显著差异。

此外，有硏究表明，在相同患者首次进行ERA检测后的29-40个月内，其结果仍具有可重复性［4,8-9,16,24］o

虽然ERA检测是获得个体化种植窗的有效手段，但是其仍然存在—定局限性,目前的工具和方案无法使接受辅助生殖治疗的女性快速获得子宫内膜种植窗时间，患者仍然需要经历侵入性检查以获得ERA检测所需的组织样本。

患者在检测内膜的当月也无法进行胚胎移植，故此技术仅应用于冻融胚胎移植。

此外，该技术的高昂费用也可能限制其广泛使用，因此在此基础上开发低廉的快速诊断试剂盒显得尤为重要。

尽管如此，ERA检测技术是目前可获得的唯一的、经临床验证可用于诊断移位种植窗并确立更好的pET时机，以获得成功植入最佳机会的工具，对提高患者的植入率及临床妊娠率有重要意义。

总之，ERA检测技术是个体化种植窗/pET治疗的核心，其作为一种新兴的分子生物学技术，对评估种植窗和预测辅助生殖妊娠结局起到了重要作用。

除此之外,pET也是改善不孕症患者妊娠结局的重要手段，具有广泛的应用前景。

目前，国际上也正在进行着多中心、前瞻性、随机对照硏究，进一步探索ERA检测技术对接受辅助生殖技术的患者子宫内膜容受性判断的价值。

未来，ERA检测技术有望成为诊断不孕症及RIF患者种植窗移位和子宫内膜容受性的全标准，为临床提供更大的价值。