分子生物学实验讲义.docx
- 文档编号:6995905
- 上传时间:2023-01-15
- 格式:DOCX
- 页数:17
- 大小:140.22KB
分子生物学实验讲义.docx
《分子生物学实验讲义.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子生物学实验讲义.docx(17页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
分子生物学实验讲义
实验讲义
课程名称:
分子生物学实验
课程性质:
专业课
课程类型:
必修课
专业:
生物工程、生物技术、生物科学
学时:
80、32
生物科学与工程学院分子生物学实验室
目录
上部分
实验一实验室安全和分子生物学常用仪器使用
实验二碱裂解法小量提取质粒DNA
实验三感受态细胞的制备及转化准备
实验四特异性片段PCR的扩增
实验五外源基因在大肠杆菌的诱导表达
下部分
实验六基因组DNA的提取
实验七利用ITS序列鉴定真菌
实验八外源基因在大肠杆菌中的优化表达
分子生物学实验课的要求
1.1实验前
(1)了解本次实验的目的、要求,充分理解本次实验的原理、熟悉实验项目、操作步骤和程序,了解实验的注意事项。
(2)结合实验阅读相关理论知识,必要时还需要查阅一定的资料,做到充分理解实验原理与方法,力求提高实验课的效果。
(3)预测本次实验结果,对预测的结果尽可能地做出合理的解释。
(4)估计本次实验可能发生的问题,并思考解决问题的应急措施。
1.2实验时
(1)遵守实验室规则。
(2)爱惜实验器械和样本;节约药品、水、电,确保实验完成。
(3)按程序正确操作仪器和器械,按实验步骤进行实验。
(4)认真观察和纪录实验结果,并加上必要的标记、文字说明;实验过程中还要思考出现了什么样的结果?
为什么会有这些结果?
这些结果有何意义?
若出现非预期结果,还应分析其原因,尽可能地及时解决。
(5)实验中要有耐心,必须等前一项实验基本恢复正常后,才能进行下一项实验,注意观察实验的全过程。
1.3实验后
(1)实验完成后要及时关闭仪器和设备的电源;按规定整理实验器具和处理废弃物。
(2)及时整理实验纪录,分析实验结果,做出实验结论。
(3)认真撰写实验报告,按时交给教师批阅。
实验一、实验室安全和分子生物学常用仪器使用
一、【实验目的】
(1)了解分子生物学实验室要求及各种规章制度
(2)了解实验的常规仪器、设备、耗材
(3)掌握本实验所用仪器的功能和使用方法
二、【实验内容】
1.温度控制系统:
1.1.冰箱:
根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要,必须具备不同控温级别的冰箱,最常使用的有:
4℃、-20℃、-80℃冰箱。
4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等;-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等;-80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存;0-10℃的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。
1.2液氮罐:
有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等,要求速冻和长期保存在超低温环境下,就需要一个液氮罐(-196℃)具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。
1.3培养箱:
37℃恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养;CO2培养箱适用于培养各种细胞,可恒定地提供一定量的CO2(通常5%),用来维持培养液的酸度(pH值);37℃恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。
1.4水浴锅:
用于保温。
25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验,各种生物化学酶反应等试验的保温。
25-100℃水浴箱用于常规试验。
1.5烘箱:
主用于烘干实验器皿,有些需要温度高些,有些需要温度低些。
用于RNA方面的实验用具,需要在250℃烤箱中烘干,有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干。
2水的净化装置:
随着分子生物学的飞速发展,许多实验对水纯度的要求越来越高。
2.1蒸馏水皿:
单蒸水常难以满足实验要求。
双蒸水、三蒸水配液,许多实验要去离子水。
多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质,不能完全除去水中溶解的气体杂质(Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mo(Ⅵ))。
2.2离子交换器:
去离子水—用离子交换法制取的水,称去离子水。
去离子效果好,但不能除去水中的非离子型杂质,其中常含有微量的有机物(树脂等)。
2.3超纯水:
用蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水,磁铁耦合齿轮泵作用使水循环。
用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。
3菌消毒设备:
分子生物学所用大部分试剂,而且实验用具都应严格消毒灭菌。
3.1蒸汽消毒锅:
用于小批量物品的随时消毒。
大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消毒且定时进行消毒
3.2紫外线:
75%乙醇、0.1%SDS(消毒剂)
一些耐高压、高温消毒且可用紫外线照射或乙醇和SDS浸泡。
紫外线照射使用方便,且很方便,但灭菌效果与距离有关,且产生臭氧污染安全,用于无菌室,超净台和塑料用具的消毒。
3.3滤器滤膜:
不耐高温、高压的试剂用其处菌。
3.4煮沸消毒:
主用于金属器械和针急需时采用。
4计量系统:
4.1称量系统:
(各种天平)台秤、托盘天平、钮力摆动天平、光电分子天平、精密电子分析天平
4.2液体体积的度量:
精:
量筒、移液管、微量取液器粗:
刻度试管、烧杯、锥形瓶
4.3pH值测量:
pH计:
测定溶液中H+的直接电位的仪器,主要通过一对电极,在不同的pH溶液中产生不同的电动势用pH值表示出来。
pH试纸:
只适用于培养液、酚饱和液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的粗略估计。
而大部分试剂的配制要求严格的pH值,需精确度高(小数点后两位)的pH计。
4.4OD值测量:
光密度、分光光度计是利用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来鉴定该物质的性质及其含量的一种仪器。
它是由光源、单色器、吸收池、接收器、测量仪表或显示屏幕所组成。
OD值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一,通过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值,利用它可进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。
5离心机:
离心技术是研究生物的结构和功能中不可缺少的一种物理技术手段。
因为各种物质在沉淀系数、浮力、和质量等方面有差异,可利用强大的离心力场,使其分离、纯化和浓缩。
目前有各种各样的离心机。
可供少于0.05ml到几升的样品离心之用。
离心技术应用广泛,包括收集和分离细胞、细胞器和生物大分子等。
据其转速的不同,可分为以下几种类型:
5.1普通离心机:
最大转速6000r/m,最大离心力6000g
①医用或台式离心机:
是离心机中最简单而廉价的,最常用于收集快速沉降系数的物质,如红细胞、粗大的沉淀物、酵母菌和细菌等。
②低速冷冻离心机:
主要用于细胞、细胞核、细胞膜和细菌的沉淀和收集等。
5.2高速离心机:
最大转速25000r/m,最大离心力89000g,有冷冻和常温两种,多用于制备和手收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等。
5.3超速离心机:
最大转速9000r/m,最大离心力694000g。
5.4台式超速离心机:
最大转速12000r/m,最大离心力625000g。
6超净工作台:
内有紫外灯、照明灯、还应有酒精灯火焰、75%乙醇等灭菌的设备,是一种提供局部洁净度的设备。
其原理是鼓风机驱动空气,经过低、中效的过滤器后,通过工作台面,使实验操作区域成为无菌的环境。
超净台按气流方向的不同大致有几种类型:
①侧流式:
净化后气流,从左侧或右侧通过工作台面,流向对侧,或者从上往下或从下往上流向对侧,他们都能形成气流屏障而保障台面无菌。
缺点:
在净化气流和外边气体交界处,可因气体的流向而出现负压,使少量的未净化气体混入,而造成污染。
②外流式:
气流是面向操作人员的方向流动,从而保证外面气体不能混入。
缺点:
在进行有害物质实验时,对操作人员不利,但可采用有机玻璃把上半部分遮挡起来,使气流往下方流出。
7电泳系统:
电泳技术是检测、鉴定各种生物大分子的纯度、含量及描述它们的特征,甚至还是分离、纯化、回收和浓缩样品的工具之一。
核酸和蛋白质等都带有电荷,当它们被置于电场中时,能够移动。
电泳装置由两部分组成:
电源装置和电泳槽装置。
①电泳装置:
电源需经稳流通过稳压器,既能提供稳定的直流电,又能输出稳定的电压。
可用于三种:
常度稳压电泳仪:
输出电压0-500v0-15mA;中度稳压电泳仪:
输出电压400-1000v;高度稳压电泳仪:
输出电压1000以上的电源装置。
②电泳槽装置:
分两种即水平式电泳槽:
一般分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽;垂直式电泳槽:
分垂直平板电泳槽和圆柱形电泳槽装置。
8PCR仪:
PolymeraseChainReaction仪,也称DNA热循环仪,基因扩增,它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧,从而酶促合成拷贝数百万倍的靶序列DNA片段,它的每一循环包括在三种不同温度进行的DNA变性,引物复性,DNA聚合酶催化的延伸反应三个过程。
9凝胶成像分析系统:
对电泳后含溴乙锭(EB)核酸样品的观察分析。
10干燥设备:
10.1真空加热干燥箱:
核酸在硝酸纤维素膜和尼龙膜上固定,用于杂交实验。
10.2电泳凝胶干燥箱:
电泳后的凝胶进行脱水干燥的仪器,一般可将凝胶干燥到一些玻璃纸上,干燥后的凝胶易于保存。
10.3液氮冷冻干燥:
适用于活性蛋白质样品的干燥与结晶。
10.4真空泵:
许多实验都需要抽真空。
如:
乙醇沉淀后核酸样品的干燥,电泳凝胶的干燥等。
11其他
11.1微波炉:
便于一些溶液的快速加热和定温加热,电泳琼脂糖凝胶配制、溶化等。
11.2制冰机:
用于制造大多数核酸、蛋白质的实验操作所需的低温环境,以减少核酸酶或蛋白质酶的水解。
11.3层析装置:
(色谱分离)是一种分离多组分混合物的有效物理方法。
真空印记系统,DNA合成/测序仪:
这些都是对核酸进行深入研究的必备仪器。
11.4磁力搅拌器:
多角度旋转混匀器、快速振荡混合器:
用于混合仪器。
11.5组织匀浆器:
超声组织及细胞破碎器,用其进行样品的分离提纯实验。
11.6通风橱:
很多溶剂能逸出毒气,必备柜,放射性试验还要有有机玻璃屏蔽。
11.7玻璃蒸馏器、电热加帽、变压器:
用于酚等有机溶剂的蒸馏。
11.8Tip头、Eppendorf管:
微管移液器tip头(吸液尖)、Eppendorf管(微量离心管)可洗涤,硅化消毒后反复使用。
对一些要求严格的实验,如RNA的提取、保存等操作,应使用新的消毒tip头与Eppendorf管。
另外还应备有常用规格的离心管(1000ml、500ml、250ml、50ml、7ml等)及96孔、24孔、12孔、6孔的细胞培养塑料平板等。
11.9小型设备、用具:
定时器、滤膜、保鲜膜、防护眼镜鸭嘴镊、常规的玻璃或塑料器皿(包括平皿、试管、烧杯、量瓶、试剂分液漏斗、避光保存的试剂应使用棕色试剂瓶,如饱和酚、巯基乙醇等)、记号笔、各种手套PE、乳胶、家用、防酸的等)
【小测验】
1.可调式微量取液器的使用方法?
使用该取液器的注意事项?
2.分子生物学实验室的常规仪器设备有哪几大类?
简单说明。
3.蒸馏水与去离子水的区别?
PCR技术需要哪种纯度的水?
实验二碱裂解法小量提取质粒DNA
一、【实验目的】
1、掌握碱裂解法提取质粒原理及方法
2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法
二、【实验原理】
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们,E.Coli染色体约4700Kb,SDS是一种阴离子表面活性剂,它和NaOH共同作用既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性,SDS处理细菌细胞后,会导致细菌细胞壁的破裂,从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来,基因组DNA断裂为线性双链片段,而质粒DNA仍为超螺旋,释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境,就会变性,基因组DNA全部完全变性,而质粒DNA只有部分变性,然后,用酸性乙酸钾来中和溶液,使溶液处于中性,质粒DNA为小分子,两条互补链复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等通过离心一起沉淀下来而被除去。
然后通过苯酚、氯仿等抽提蛋白,2倍体积无水乙醇或0.6倍体积异丙醇沉淀DNA,70%酒精洗后,干燥,用无菌的双蒸水或TE溶解,-20℃保存。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此他们能以相同的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
如上次实验提取的pUC19质粒,有3种构型:
超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称CCCDNA),开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂,(opencircularDNA,简称OCDNA),线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂,(linearDNA,简称LDNA)。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。
因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,开环质粒DNA。
但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。
三、【实验仪器、材料和试剂】
1、仪器、用具:
恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅琼脂糖凝胶电泳系统:
电泳仪、电泳槽凝胶成像系统1.5mL离心管移液器枪头一次性手套
2、材料:
含pUC19质粒的大肠杆菌
3、试剂:
①溶液I:
成分:
葡萄糖50mmo1/L(增加粘度,减少机械剪力破坏)
EDTA(pH8.0)10mmol/L(螯合金属离子,抑制Dnase)
Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L(调pH)
可在使用前加入Rnase至终浓度0.8mg/mL
200mL溶液I配法:
葡萄糖.H2O1.98g1MEDTA(pH8.0)20mL1MTris·HCl(pH8.0)50mL
水定容至200mL,在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。
500mL1MTris(pH8.0)配法:
Tris60.5g先用400mL水溶解,再加入浓HCl约21mL,定容,待冷却后再调PH值
500ml1MEDTA(pH8.0)配法:
Na2EDTA·2H2O186.1g用用400mL水溶解,再加入NaOH约5g,定容,再调PH,注意:
PH至8.0时,EDTA才能完全溶解
②溶液II:
(现配)
成分:
0.2mo1/LNaOH(DNA变性,裂解细胞)
1%SDS(破坏细胞膜、核膜,蛋白质变性形成复合物沉淀)
100ml0.4MNaOH配法:
1.6gNaOH小心缓慢加入90ml水中,溶解,定容
100ml2%SDS配法:
2gSDS水溶解、定容100ml
③溶液III:
(3MK+,5MAc-,pH4.8的高盐溶液)
KAc3M(K+与SDS形成难溶性盐,与蛋白质形成沉淀).冰醋酸5M(调pH)
200ml溶液III配法:
KAc58.8g冰醋酸23mLH2O定容至200mL
④50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)pH8.5:
2MTris-醋酸,100mMEDTA配1000mL5xTAE:
Tris242g
冰醋酸57.1mL
Na2EDTA·2H2O37.2g
⑤凝胶加样缓冲液(6x):
溴酚蓝0.25%
蔗糖40(W/V)
⑥溴化乙锭溶液(EB)10mg/mL避光保存,工作浓度0.5mg/L
⑦20μg/ml胰RNA酶:
将RNA酶溶于10mmol/LTris•HCl(pH8.0)、15mmol/LNaCl中,配成的相应浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。
⑧琼脂糖、无水乙醇、Tris饱和酚、70%乙醇、双蒸水
⑨DNA分子量标准物
四、【实验方法与步骤】试剂盒法
1、将2ml含氨苄青霉素素(3微升100ug/ml)的LB液体培养基加入试管中,接入含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落,37℃振荡培养过夜,取10ul培养液加入100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养过夜
2、取1.0ml菌液,加入1.5ml离心管中,10000r/min离心1min,弃上清。
使沉淀尽可能干燥。
3、加入200ulBufferS1,悬浮沉淀,均匀,不留菌块。
4、加200ulBufferS2,盖紧盖,轻轻颠倒4-6次混匀,使菌充分裂解,可见鼻涕样粘稠物,不超过5min。
5、加300ul,BufferS3,盖紧盖,轻轻颠倒4-6次使混匀,1-2min(可见絮状沉淀)。
13000r/min,离心10min,将上清转至制备管中,注意制备管插入2ml离心管。
离心前要平衡.
6、将2ml离心管与制备管一起离心,13000r/min,离心1min,小心抽出制备管,弃2ml离心管管底滤液。
7、将制备管置回2ml离心管,加500ul,BufferW1,13000r/min,离心1min,弃滤液。
8、将制备管置回2ml离心管,加700ul,BufferW2,13000r/min,离心1min,弃滤液。
同样方法再进行一次。
9、将制备管置回2ml离心管,13000r/min,离心1min。
10、将制备管移到新2ml离心管,在制备管膜中央加50ul灭菌水,静置1min,13000r/min,离心1min,管底即为质粒提取液。
写上标签-20度保存
11、制备琼脂糖凝胶:
取10×TBE缓冲液稀释成0.5×TBE缓冲液,待用,称取适量琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入适量0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为1%琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
13、胶板的制备:
将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入生物素溶液1/万。
将琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
14、加样:
取5ul质粒与2μl6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。
若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要更换枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿,在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5ul的100bpDNAladder。
15、电泳:
接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动)120V电泳,DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V/cm。
当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。
16、成像:
染色后观察在琼脂糖凝胶中的带(戴手套操作)在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后电泳胶板。
DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛,用凝胶成像系统照相。
五、【实验结果】
六、【思考题】
1、实验中葡萄糖、EDTA、Tris-HCl、KCl、HAc、NaOH、SDS、Tris平衡酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇的作用是什么?
2、影响电泳结果的因素有哪些?
实验三感受态细胞的制备及转化准备
一、【实验目的】
1、掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法
2、掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法
二、【实验原理】
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物,将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在选择性培养基(如含有氨苄青霉素)上。
三、【实验仪器、材料和试剂】
1、仪器、用具:
高速离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、培养皿、涂棒、吸头、枪试管、培养皿、酒精灯、镊子、灭菌牙签、1.5mL离心管等。
2、材料:
质粒PUC19、大肠杆菌DH5a
3、试剂:
①LB液体培养基:
配制每升LB液体培养基,应在950mL去离子水中加入:
胰蛋白胨(bacto-tryptone)10g酵母提取物(bacto—yeastextract)5gNaCl10g
摇动容器直至溶质完全溶解,用Na0H调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,LB固体培养基加入0.5%琼脂,121℃高压灭菌20min。
(现用商品LB液体培养基)
②氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成100mg/mL溶液,置-20℃冰箱保存。
③0.1MCaCl2:
100ml0.1MCaCl2配法:
CaCl2.2H2O1.47g,水定容100ml,高压灭菌。
四、【实验方法与步骤】注意无菌操作,低温
1、挑取LB固体培养基上生长的DH5a单菌落,接种于5mlLB液体培养基中,37℃摇过夜;
2、取5ul培养液加入50mlLB液体培养基,37℃振荡培养过夜,按1%接种量转接到100mlLB液体培养基中,于37℃,150rpm摇约3小时,OD600值(0.4-0.6之间)较为合适;
3、无菌条件下,向无菌、冰预冷的1.5ml离心管中加入1ml菌液,冰上放10-30min;(2管/人)
4、4℃,5000rpm,离心5-10min,超静工作台上弃上清液于废物瓶,留沉淀;
5、无菌下,一管加500μL冰预冷的0.1MCaCl2液,悬沉淀,移入另一管合并,冰上15-30min;
6、4℃,5000r/min,离心5-10min,超静工作台上弃上清液于废物瓶,留沉淀;
7、每管加冰预冷0.1MCaCl2溶液100ul,悬沉淀.此液为感受态细胞.(可保存于-80℃备用)
8、2人一组,一管中加入5ul质粒,另一管加5μL无菌水,冰上放置10-30min;
对照:
100μL感受态细胞+5μL无菌水
处理:
100μL感受态细胞+5μL质粒DNA溶液
9、42℃热激60-90sec,快速转移离心管到冰浴上,冷却5-10min;
10、每管加500μL无抗性的LB液体培养基,于37℃温育30-45min,使细菌复苏;
11、超净台上取对照,处理菌液各100μL,转移到含Amp100μg/mL的LB固体平板培养基上,涂均,待液体
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学 实验 讲义