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微生物培养知识清单
微生物的培养与应用知识清单
班级 姓名
课题一、微生物的实验室培养
(一)培养基
1、为微生物的生长繁殖提供营养的基质叫做 。
从物理性质上划分,主要可分为 与 ,其中的 培养基(成分均匀,微生物能充分接触和利用培养基中的养料)主要用于工业生产与扩大培养,而扩大培养的目的是 ,要让培养基呈固态,一般需向其中加入 这一凝固剂。
(该凝固剂为从海藻中提取的多糖,44℃以下凝固,98℃以上溶化。
不会被微生物利用,这也是所有凝固剂的特点。
)固体培养基可以用于菌株的 、鉴定、计数、菌种保存等。
从功能上划分,可分为 培养基与 培养基,其中的 培养基,是在培养基中加入某种化学物质,以 不需要的微生物的生长, 所需要的微生物的生长,如 的培养基来筛选纤维素分解菌;以 的培养基来筛选自身固氮微生物;在培养基中加入 筛选金黄色葡萄球菌;培养基中加入青霉素等抗生素抑制 ,从而筛选 ;以 的培养基来筛选尿素分解菌。
而鉴别培养基是根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种 ,来鉴别相应微生物,如在培养基中加入 ,可鉴别大肠杆菌,使其菌落呈 色。
选择培养基 (是/不)都是固体培养基。
2、不管哪种培养基,一般都含有 、 、 、 等营养物质,另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(如:
细菌生长必需,而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。
如在培养乳酸杆菌时需在培养基中添加 ;培养霉菌时需将PH调节至 ;培养细菌时需将PH调节至 ;培养厌氧微生物时则需提供 条件。
牛肉膏蛋白胨培养基中的牛肉膏能够为微生物提供 ,主要提供 ;蛋白胨能够为微生物提供 ,主要提供 。
培养基中含量最多的化合物是 ,如果营养物质的浓度过高,会导致微生物脱水死亡
(二)无菌技术
1、获得纯净培养物的关键是 ,主要包括消毒与 。
对实验操作空间、操作者的衣服、双手应该进行清洁与 ;培养皿、培养基、接种用具应该 ;实验操作应该在 进行。
已经 处理的材料用具不与周围的物品接触。
2、消毒:
用较 的方法杀死物体表面的 微生物,不能杀死 、 。
芽孢:
细菌(芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、少数球菌)形成的逆性强的休眠体;
孢子:
某些低等植物、真菌(如蘑菇、酵母菌)、放线菌产生的脱离母体的繁殖体
消毒方法:
(1)煮沸消毒法100℃煮沸5~6min
(2)巴氏消毒法高温短时处理,常用来消毒奶制品,①70-75℃,30min;②80℃,15min;可以杀死牛奶中的微生物,并且牛奶中的 不被破坏。
(3)化学药剂消毒操作者的双手一般用 进行消毒;饮水水源用 进行消毒;(4)紫外线消毒接种室、超净工作台、接种箱在使用前可以用 照射30min,进行消毒处理。
为了加强消毒效果,在照射前,适量喷洒 或 等消毒液。
3、灭菌:
用 的理化因素杀死物体内外的所有微生物,包括 和 。
方法:
(1)灼烧灭菌将需要灭菌的物体通过酒精灯火焰的 ( )灼烧。
接种环、涂布器、接种针、试管口等应该用 灭菌;
(2)干热灭菌:
将灭菌物品放入干热灭菌箱,在160~170℃加热1~2h灭菌的方法。
玻璃器皿(吸管、培养皿、玻棒、烧瓶、试管、滴管)、金属用具等器材一般用 法进行灭菌,所用器械是 ;(3)高压蒸汽灭菌将物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后,要首先打开排气阀,煮沸并排除锅内的 ,目的是有利于锅内温度升高;随后关闭排气阀继续加热,气压升至 ,温度为 ,并维持15~30min;切断热源使温度自然降温,气压务必降至零时打开锅盖,其目的是防止容器中的液体暴沸。
培养基、无菌水等一般用 法进行灭菌,所用器械是 。
不论是消毒还是灭菌,其主要的原理都是在理化因素的作用下使微生物 变性或者 破坏损伤,以杀灭微生物。
(三)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
1、固体培养基的制备一般包括计算、称量、 、 、 、 。
(1)计算:
根据配方比例,计算配制一定量的培养基所需各种成分的用量。
(2)称量:
准确称取各成分。
称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速,目的是。
牛肉膏通常放在称量纸上称量,溶化后再将称量纸取出。
(3)溶化:
①加水加热熔化牛肉膏;②加入蛋白胨和氯化钠继续加热;③加入琼脂;④用定容到100mL。
整个过程不断用玻棒搅拌,目的是防止 。
(4)调pH:
用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。
(5)灭菌:
将配制好的培养基转移到锥形瓶中,加塞包扎后用 灭菌;所用培养皿用报纸包扎后用 灭菌。
(6)倒平板:
待培养基冷却至 左右时在 附近操作进行。
其过程是:
①在火焰旁右手拿锥形瓶,左手拔出棉塞;
②右手拿锥形瓶,使锥形瓶的瓶口迅速通过;
③左手将培养皿打开 ,右手将培养基倒入培养皿,立刻盖上皿盖。
④待平板冷却凝固后,将平板 放置。
注意:
①.锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是 。
②.倒平板的目的是 。
③.若皿盖和皿底之间粘有培养基,则该平板能否培养微生物?
为什么?
。
④.配制斜面培养基中,试管要加塞棉塞的目的是 。
.试管培养基形成斜面的作用是 。
(四)纯化大肠杆菌
1、接种方法:
微生物的接种最常用的方法是 、 ,其中 除了可以用于微生物的分离、纯化外,还可以用于菌落的计数。
除此之外还包括 、 等方法。
虽然方法各不相同,核心都是要 ,保证培养物的 。
2、平板划线法:
平板划线法是通过 在琼脂固体培养基表面 的操作,将 的菌种逐步 到培养基表面,在数次划线后 ,可以分离得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的 。
在划线操作中,第一次划线前要灼烧接种环的目的是 ;除第一次划线外,其余划线前都要灼烧接种环的目的是 ;划线结束后还需灼烧接种环的原因是 ;灼烧接种环后必须待其 ,才能进行划线操作,原因是 ;划线时,将皿盖打开一条缝隙,把接种环伸入平板内划3-5条平行线,盖上皿盖,不要划破 ,否则会影响菌落的形态、生长。
注意不要将最后一区划线与第一区划线 ,在做第二次以及以后的划线操作时,必须从 开始,原因是 。
在打开试管棉塞后以及塞上棉塞前都必须使试管口 。
3、稀释涂布平板法:
稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的 ,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面,在 的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成 ,从而在培养基表面形成单个 。
该方法主要包括两个步骤,即 操作与 操作。
在稀释时,应该将分别盛有9ml水的各支试管进行 ,并编号。
在将菌液用 加入相应稀释倍数的试管时,应该用手指轻压移液管上的橡皮头,吹吸3次,使 充分混匀。
移液管事先应该 处理,操作中试管口和移液管应在离火焰 处。
整个操作过程中使用了 支移液管。
涂布平板操作,用到的涂布工具是 ,应该事先将其放入盛有 的烧杯中,然后在涂布前将其取出在火焰上引燃,并 ,方可进行涂布。
(是/不是)用涂布器从试管中取菌液,而是用 ,取的菌液一般不超过 ml。
4、若用平板划线法接种后培养基上的某条线上的菌落分布呈沟槽状,其原因是 ;若第二划线区域的第一条线上没有菌落长出,其原因可能是 。
若用稀释涂布平板法接种后的培养基的右下方没有菌落长出,而其他地方有较多的菌落长出,其原因最可能是 。
(是/不是)每次划线的菌种都来源于上次划线的末端;如果在平板上有5个划线区域,则接种环应该被灼烧 次。
培养结束后,发现培养基上菌落连成一片,可能的原因是什么?
(列举两项)5、在接种后,应该将一个 与接种的培养基都放入 进行同步培养,其目的是 。
在微生物培养时,有时候需要进行振荡培养,其主要目的是 。
接种后的培养基在12h与24h时,菌落的颜色、位置、形状,大小有无明显差异?
。
原因是时间越长,菌落中细菌繁殖越多,菌落体积越大;菌落的位置不动,但 增多。
6、对于频繁使用的菌种,可以采用 的方法,首先将菌种接种在 培养基上,在合适的温度下 ,待 后,将试管放入 的冰箱中保藏。
但该方法的缺点是 。
对于需要长期保存的菌种,可采用 的方法,在 的冷冻箱中保存。
微生物的培养与应用知识清单
课题二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(一)课题背景
尿素是一种农业氮肥, (能/不能)被农作物直接吸收,必须被土壤中的细菌分解成 后,才能被植物吸收利用,土壤中的细菌之所以能分解尿素,直接是因为它们能合成 ,根本原因是 ,尿素被细菌分解的反应式是 。
(二)研究思路 。
1.筛选菌株
(1)在寻找目的菌株时,思路是 。
(2)实验室中微生物筛选的原理:
人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时 或 其他微生物生长。
(3)选择培养基:
在微生物学中,将允许 种类的微生物生长,同时
或 其他种类微生物生长的培养基,称作选择培养基。
(4)配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如,培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物;培养基中不加入氮元素,可以选择培养 的微生物;加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
2.统计菌落数目
(1)测定微生物数量的常用方法有 (或称 )和 (或称 )。
其中的稀释涂布平板法能够统计是 的数目,因此统计结果一般不用活菌数。
在统计时一般选择菌落数在 的平板进行计数,其目的是 。
选择30---300的原因主要包括以下几点:
①稀释度过高,容易计数不准确,造成实验误差②稀释度过低,可能导致两个或者两个以上的菌体连在一起形成一个菌落,造成实验误差③稀释度过低,会造成培养基中的微生物的种内斗争、种间竞争激烈,使得一些个体无法形成菌落,而造成实验误差④稀释度过高,形成的菌落数过少,不具有代表性。
该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ,原因是 。
在用该方法进行菌落计数时,每个稀释度下至少涂布 个平板,当几个平板上的菌落数都在30---300时,且数据相差不是很大的情况下,应该用几个数据的 作为该稀释度下的菌落值做计算。
计算公式为:
每克土壤(ml)样品菌株数= (其中,C代表某一稀释度下的平均菌落数,V代表涂布时用的稀释液体积,M代表稀释倍数)。
显微镜直接计数的计算公式可描述为:
1ml原液中的菌体数=每中格平均菌落数×25(或16)× × =每小格平均菌体数×400× × 。
该方法得到的数据比实际的活菌数目 。
(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的 足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个 。
通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确,一般选择菌落数在
的平板进行计数。
此外,测定微生物数量的常用方法还有 直接计数。
3.设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响,提高实验结果的 。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了,需以培养
的培养基作为空白对照。
(三)实验设计
关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下:
1. 取样:
从肥沃、湿润的土壤中取样。
(能/不能)直接选择表层土。
用于取样的小铁铲和盛土样的信封在使用前必须 ,称取和稀释土样都应该在 完成。
土壤取样时,应先 3 cm左右,再取样,将样品装入事先准备好的 中。
2.制备培养基 :
制备______________培养基作为对照组,尿素为唯一氮源的培养基作为________,用来判断选择培养基是否具有____________。
3.样品的稀释
测定土壤中细菌数量时,一般选用 倍的稀释液进行涂布平板并培养,温度一般控制 ,培养时间一般 天;测定土壤中放线菌数量时,一般选用 倍的稀释液进行涂布平板并培养,温度一般控制在 ,培养时间一般 天;测定土壤中真菌数量时,一般选用 倍的稀释液进行涂布平板并培养,温度一般控制在 ,培养时间一般 天。
若要初步判断培养基上的两个细菌是否为同种,可以根据 的特征,这些特征主要包括其 、 、 、 。
第一次做这个实验时可以放宽稀释范围,如稀释倍数为103~107范围内的要分别涂布,而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基,因此需要_______个选择培养基和_______个牛肉膏蛋白胨培养基。
两种培养基应各有一个作为________对照,此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。
样品的稀释与涂布平板:
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250mL),充分摇匀,吸取上清液 mL,转移至盛有_______mL无菌水的大试管,将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度,并按照由107~103稀释度的顺序分别吸取_______ 进行平板涂布操作。
按照浓度从低到高的顺序涂布平板,不必更换移液管。
将菌液稀释相同的倍数,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目,因此,牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 ,用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3.微生物的 与观察
测定土壤中细菌数量时,一般选用 倍的稀释液进行涂布平板并培养,温度一般控制 ,培养时间一般 天;测定土壤中放线菌数量时,一般选用 倍的稀释液进行涂布平板并培养,温度一般控制在 ,培养时间一般 天;测定土壤中真菌数量时,一般选用 倍的稀释液进行涂布平板并培养,温度一般控制在 ,培养时间一般 天。
若要初步判断培养基上的两个细菌是否为同种,可以根据 的特征,这些特征主要包括其 、 、 、 。
将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养,及时观察和记录。
每隔24h统计一次菌落数目,选取 时的记录作为结果, 这样可以防止因 不足而导致 。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 培养基的斜面中,观察能否产生如教材中图2-l0的颜色反应。
注意:
(1)操作中试管口和移液管应在离火焰1~2cm处。
整个操作过程中使用了1支移液管。
(2)培养未接种培养基的作用是对照,若有菌落形成,说明。
(3)在肉汤培养基上,大肠杆菌菌落呈白色,为圆形,光滑有光泽,边缘整齐。
(4)培养12h和24h后的菌落大小(相同、不同);菌落分布位置(相同、不同)。
原因是时间越长,菌落中细菌繁殖越多,菌落体积越大;菌落的位置不动,但菌落数增多。
(5)在某培养基上出现了3种特征不同的菌落,原因有等
4.细菌的计数
当 时,选取菌落数在 的平板进行计数。
在同一稀释度下,至少对3个平板进行重复计数,然后求出 ,并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
(四)课题延伸
以尿素为唯一氮源的培养基具有选择作用的原因是 。
若要判断该培养基是否起到选择作用,可以用 培养基做对照进行同步培养,如果对照培养基上长出的菌落数明显 (多于/少于)该选择培养基,则说明该培养基起到选择作用。
在选择培养基上生长的菌, (一定/不一定)就是我们的目的菌株。
本课题能对分解尿素的细菌进行了初步的筛选。
这只是分离纯化菌种的第一步。
对分离的菌种作进一步的鉴定,还需要借助 的方法。
在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的 酶将尿素分解成 ,会使培养基的碱性 ,PH ,因此我们可以通过检测 来判断该化学反应是否发生。
在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入 指示剂,培养某种细菌后,如果PH ,指示剂变 ,这样便可初步鉴定该中细菌能够分解尿素。
细菌的数目还可以通过 法来测定,如:
测定饮用水中大肠杆菌的方法,将已知 的饮用水过滤后,将滤膜放在 培养基上培养。
在该培养基上大肠杆菌呈现 色,根据培养基上该菌落的数目,可以计算出水样中大肠杆菌的数量。
三:
思考与讨论
(1)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数?
(2)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度?
测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围相同吗?
微生物的培养与应用知识清单
课题三、分解纤维素的微生物的分离
一、纤维素与纤维素酶
1.纤维素的化学组成:
三种元素,是一种糖。
纤维素是一种由首尾相连而成的高分子化合物,是含量最丰富的多糖类物质。
纤维素能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生
2.纤维素的分布:
是自然界中纤维素含量最高的天然产物,此外,木材、作物秸秆等也富含纤维素。
许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的,如:
水溶性的(CNC-Na)、不溶于水的纤维素(Avicel)。
3.纤维素酶的作用:
纤维素酶是一种,一般认为它至少包括三种组分,即酶、酶酶,前两种酶使纤维素分解成,第三种酶将纤维二糖分解成。
二、纤维素分解菌的筛选
1.筛选方法:
染色法。
2.筛选原理:
刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应,当纤维素被纤维素酶分解后,红色复合物无法形成,出现以为中心的透明圈,我们可以通过来筛选纤维素分解菌。
三、试验设计
土壤中纤维素分解菌的分离的实验方案:
分解纤维素的微生物的分离的试验流程、、、、
1.土壤取样:
采集土样时,应选择富含的环境。
2.选择培养:
阅读资料二“选择培养基”,回答以下三个问题:
1个酶活力单位(1U)是指在温度为,其它反应条件情况下,在min内转化的底物所需要的酶量。
〖思考1〗纤维素分解菌选择培养基属于培养基,原因是。
〖思考2〗培养基选择作用机制是什么?
〖思考3〗若设置一个对照实验说明选择培养的作用,应控制的变量是什么?
(1)目的:
增加纤维素分解菌的,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
(2)制备选择培养基:
参照课本旁栏中的比例配制。
(3)选择培养:
称取土样20g,在无菌条件下加入装有30mL培养基的锥形瓶中,将锥形瓶固定在上,在一定温度下振荡培养1~2d,直至培养液变。
也可重复选择培养。
(4)梯度稀释:
依次将培养液稀释101~107倍。
思考是如何操作的?
(5).将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
<1>制备培养基:
参照课本旁栏中的比例。
<2>倒平板操作。
<3>涂布平板:
将稀释度为104~106的菌悬液各取0.1mL涂布在平板培养基上,30℃倒置培养。
(6).刚果红染色法:
挑选产生的菌落,一般即为分解纤维素的菌落。
〖思考4〗本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同?
3刚果红染色法:
常用的刚果红染色法有两种即。
阅读资料三“刚果红染色法”,填表比较两种染色法的各自的优缺点
染色法
优点
缺点
方法一
方法二
是、。
阅读资料三“刚果红染色法”,填表比较两种染色法的各自的优缺点:
〖思考5〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物?
四:
结果分析与评价
1为了确定分离得到的是纤维素分解菌,还需要进行实验,纤维素酶的发酵方法有发酵和发酵。
2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的含量进行定量测定。
3.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维分解菌?
4、将滤纸埋在土壤中有什么作用?
滤纸应该埋进土壤多深?
5、为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物?
6.请分析下面的培养基配方,回答下面的问题:
纤维素分解菌的选择培养基
纤维素粉5g
NaN031g
Na2HP04·7H201.2g
KH2P040.9g
MgS04·7H200.5g
KCl0.5g
酵母膏0.5g
水解酪素0.5g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000mL
(1)上述配方是液体培养基还是固体培养基?
为什么?
(2)这个培养基对微生物是否具有选择作用?
如果具有,又是如何选择的?
(3)如果要证明该培养基的选择培养作用可用 培养基做 实验。
25.请你设计实验来证明纤维素酶的作用。
实验步骤:
(1)取2支20mL的试管,分别放入1cm×6cm的 。
(2)再分别加入pH为4.8,物质的量浓度为0.1mol·L-1的 缓冲液10mL、11mL。
(3)在加入lOmL缓冲液的试管中加入1mL 。
(4)将2支试管固定在摇床上,振荡反应1h。
结果:
加纤维素酶的滤纸条被分解,另一支中的未分解。
则证明:
。
答案
(一)、培养基
1.培养基液体培养基固体培养基液体培养基大量繁殖,增加菌种数目琼脂分离鉴别培养基选择培养基选择培养基阻止或抑制促进以纤维素作唯一碳源无氮高浓度的NaCl不抗青霉素的微生物抗青霉素的微生物尿素为唯一氮源指示剂伊红美蓝黑不
2.水无机盐碳源氮源维生素酸性中性或微碱性无氧碳源、氮源、磷酸盐和维生素氮源碳源、氮源和维生素氮源水
(二)、无菌技术
1、防止外来杂菌的入侵灭菌消毒灭菌酒精灯火焰附近灭菌
2、温和大部分芽孢孢子营养成分酒精氯气紫外线石炭酸煤酚皂溶液
3、强烈芽孢孢子充分燃烧层(外焰)灼烧干热灭菌干热灭菌箱冷空气100kPa121℃高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅蛋白质核酸
(三)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
熔化调
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