大鼠膝关节不稳固性OA模型的软骨及软骨下骨改变.docx
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大鼠膝关节不稳固性OA模型的软骨及软骨下骨改变
大鼠膝关节不稳固性OA模型的软骨及软骨下骨改变
杨勇,吴世栋,张小钰,金群华
【摘要】:
目的通过成立大鼠膝关节前交叉韧带切断骨性关节炎(OA)动物模型,探讨该模型中软骨及软骨下骨病理转变。
方式取SD大鼠30只随机分成3组(术后二、6周和10周组)。
每只大鼠右膝行前交叉韧带切断,造成膝关节不稳固动物模型,对侧为假手术侧。
别离将每组动物于术后二、6和10周处死,取胫骨近段,比较各组骨关节大体形态及病理转变。
光镜下观看指标有改良的Mankin评分、骨组织形态计量学参数。
免疫组化法观看MMP-13在软骨细胞中的表达。
结果在造模后二、6周和10周软骨退变呈进行性进展。
Mankin评分增高、MMP-13表达慢慢增强,与假手术侧相较有统计学意义(P<)。
软骨下骨形态计量学分析显示,造模后初期软骨下骨骨量轻度减低(P<),以后骨量慢慢增加(P<)。
结论大鼠的前交叉韧带切断能够造成动物膝关节OA样改变,表现出软骨下骨吸收、骨重建的转变特点。
【关键词】骨性关节炎;动物模型;软骨下骨;基质金属蛋白酶13
Abstract:
ObjectiveToestablishanosteoarthritismodelinratkneesbytransactinganteriorcruciateligament,andcharacterizingsubchondralboneremodeling,cartilagedamageduringthediseaseprogressioninthemodelsofsurgicallyinducedOA.Methods30ratsweredividedintothreegroup(2weeks、6weeksand10weekspost-surgerygroup).Rats'rightkneejointsweresubjectedtoanteriorcruciateligamenttransection(ACLT),whiletheleftkneeservedascontrol.Ratsweresacrificedandthetibilplateswereharvestedwhichwerestudiedinbothgross-morphologicalandpathohistological,atthesametimeCoimmunostainingformatrixmetalloproteinase13(MMP-13)wasperformedtoinvestigatetheprogressionofcartilagedegradetion.ResultsThedegenerationofarticularcartilageofthesurgerykneesgotworsebytime.surgerykneesMankin'sscoresandMMP-13expressionsweresignificantlyhigherthanthoseintheshamknees(P<.Histomorphometricanalysisrevealedsubchondralbonelosswithin2weekspostsurgery(P<followedbysignificantincreasesinsubchondralbonevolumerelativetoshamupto10weekspost-surgery(P<.ConclusionWACLTonratscaninduceOsteoarthriticchangeswhichinvolvecartilageandsubcondralbone.Thismodelhavethemeritsofeconomical,convenientandshort-terming.
Keywords:
osteoarthritisOA;animalmodel;subcondralbone;matrixmetalloproteinase13
动物模型是研究骨性关节炎(osteoarthritis,OA)病理机制、医治及预防的重要手腕之一。
目前OA的动物造模方式有多种,目的是最大程度地仿照人类OA的病理生理进程。
本实验通过成立大鼠膝关节不稳固OA动物模型,并观看其软骨及软骨下骨的病变特点,以期进一步了解OA的病理进程及发病机制。
1材料与方式
要紧试剂及材料
兔抗鼠基质金属蛋白酶13(matrixmetalloproteinase13,MMP-13)单克隆抗体购自美国Santacruz公司,羊抗兔二抗EnVision购自上海基因科技。
过碘酸雪夫氏(PeriodicAcidSchiff)及阿辛兰(AlcianBlue,AB-PAS)染色试剂盒购自福州迈新公司。
SD大鼠由宁夏医科大学实验动物中心提供。
模型制做
取20周龄健康SD大鼠30只,雌雄不限,体重400~450g,无关节病变。
将所有大鼠随机分为3组:
术后2、六、10周组,每组10只。
%水合氯醛按100mg/kg大鼠腹腔注射麻醉,备皮。
模型侧:
取右膝关节内侧长约切口,沿髌韧带内侧缘进入关节腔,找到前交叉韧带,用眼科剪剪断,生理盐水冲洗,依层缝合,术中不损伤软骨面。
假手术侧:
同时取对侧膝关节,入路同前,打开关节腔暴露前交叉韧带,冲洗,关闭切口。
大鼠术后不做任何处置,分开饲养,自由活动及进食,每日强迫大鼠活动1h。
取材及标本处置
别离于术后二、六、10周将动物断颈处死,取膝关节上下各2cm区域的组织,去除皮肤,置于4%多聚甲醛液中,4℃下固定24h,固定后标本剔除周围软组织及韧带,PBS充分浸洗,流水冲洗2h,15%的EDTA液加微波脱钙2周,流水冲洗24h,只留胫骨部份,将其沿冠状面分为3等份。
修整组织块后石蜡包埋,作冠状面不持续切片,每一个标本切9张,距离100μm。
各取3张别离行HE、AB-PAS、MMP-13免疫组化染色。
大体观看
取材时对新鲜标本的外观在肉眼及解剖显微镜下进行大体观看。
组织学评分
所有组织切片经HE及AB-PAS染色后,采纳盲法由两名病理医师对组织结构进行详细的观看。
每张切片选择5个不同的视野,要紧观看大鼠术后不同时刻膝关节软骨及软骨下骨的病理改变;并参照Mankin改良的关节软骨病理评分标准[1]进行积分统计,总分值14分。
软骨下骨形态计量学指标
HE切片在Olympus显微镜下(40×)用Olympus图像搜集系统在软骨下松质骨内随机取5个视野,用imageproplus图像分析系统,MediaCybernetics,SilverSpring,MD)行骨组织形态计量分析。
测量参数为骨体积(BV/TV),即测量范围内骨小梁体积占全数骨组织体积的百分比,为骨小梁面积/(髓腔+骨小梁面积)×100%,反映骨小梁散布密度。
每样本各视野相加取平均值。
MMP-13免疫组化染色
切片常规脱蜡入水,过氧化氢封锁,枸橼酸盐缓冲液(pH)微波法修复抗原,加1∶200兔抗鼠MMP-13单克隆抗体(美国Santacruz公司),4℃孵育留宿,PBS洗,加EnVision二抗,室温孵育30min,PBS洗,DAB显色,蒸馏水冲洗,苏木素复染,二甲苯透明,封片。
阴性对照用PBS代替一抗。
结果判定:
每张切片由2名病理科医师独立观看具有代表性的5个高倍视野。
每一个高倍视野计数100个细胞,取观看结果的平均值进行计算,计数阳性细胞的百分率,阳性指数=(阳性细胞数/所计数细胞总数)×100%。
阳性指数0~10%为(-),10%~25%为(±),≥25%为(+),≥50%为(++),≥75%为(+++)。
统计学方式
实验数据采纳均数±标准差表示,用SPSS统计软件,计量资料行方差分析,品级资料采纳非参数秩和查验,P<为不同有统计学意义。
2结果
大体观看结果
假手术侧:
膝关节软骨、滑膜外观大体正常,软骨呈蓝白色,色泽敞亮,微透明,表面无充血,无裂纹及软化。
模型侧:
2周组中有4只膝关节胫骨内髁软骨失去原有光泽,透亮度减低,灰白,无溃疡,无裂纹。
6周组,滑膜增生明显,软骨失去原有的光泽,灰白暗淡,不透亮,表面粗糙,内侧胫骨平台更明显,个别有裂隙及小溃疡,未见明显骨赘。
10周组,内侧胫骨平台关节面粗糙不平,内侧胫骨平台较外侧低,表面可见溃疡糜烂,关节周缘结缔组织增生,并可见骨样增生(图1,见封3)。
光镜下观看组织学转变
模型侧的关节软骨病损在术后随时刻呈进行性进展,且内侧胫骨平台病变较外侧显著。
各时刻点Mankin评分见表1。
二、六、10周时假手术侧与模型侧评分不同均有统计学意义(P<或)。
表1不同时刻点的模型侧与假手术侧的
软骨Mankin评分比较(略)
假手术侧大部份为正常关节软骨。
HE染色见表层滑腻、平整,软骨细胞散布均匀,序列整齐,层次清楚,无簇集软骨细胞,潮线完整;AB-PAS染色均匀,无失染。
模型侧术后2周:
细胞排列规律性尚在,偶见少量细胞簇集现象。
模型侧术后6周:
中度软骨损伤为主,软骨表面粗糙、表层裂隙,部份显现少量钙化层裂隙;但软骨基质内无明显纤维化;所有标本均显现细胞数量的转变,细胞散在增生和巢状增生,簇聚细胞显现频率增加;部份显现潮线不清楚和中断;AB-PAS染色不均匀。
模型侧术后10周:
以重度软骨损伤为主,软骨表层显现较大缺损区,细胞排列紊乱,软骨细胞层次不清,细胞数减少,潮线消失,部份显现软骨全层缺损,钙化层难以分辨,AB-PAS染色大部份层次失染,伴软骨下骨硬化(图2,见封3)。
骨形态计量学分析
大鼠胫骨内侧髁软骨下骨组织计量学分析数据见表2,各组大鼠软骨下骨体积分数不同有统计学意义(P<;2、六、10周时模型侧与假手术侧相较不同均有统计学意义(P<或;模型侧六、10周时别离与2周时比较不同有统计学意义(P<);模型侧10周与6周比较不同有统计学意义(P<),图2,见封3。
表2假手术侧与模型侧不同时段软骨下骨体积(略)
MMP-13在软骨细胞中的表达
(表3)表3假手术侧与模型侧不同时段MMP-13在软骨细胞中的表达结果(略)
假手术侧:
大部份样本未见软骨细胞表达,少量偶见单个细胞弱表达。
模型侧:
2周时在软骨中有极少量软骨细胞弱表达,与假手术侧相较阳性指数不同无统计学意义(P>;6周时表达量增高,别离与2周时和假手术侧相较阳性指数不同有统计学意义(P<);10周时表达量最高,别离与假手术侧及2、6周模型侧相较阳性指数不同有统计学意义(P<,图5、见封3。
3讨论
目前OA动物模型诱导方式以关节内手术途径较为流行[2]。
通过膝关节内侧半月板切除、前后交叉韧带切断等,使关节各结构的动态平稳失调,内在的生物力学性能改变,从而显现OA的病理表现。
咱们的研究采纳大鼠膝关节前交叉韧带切断(ACLT)且动物体重较大(400~450g),这是因为体重与OA的发生进展相关[3],大体重能够增加关节的负荷,尤其在关节不稳时使关节经受的异样负荷增加,从而提高造模的成功率。
本实验发觉术后初期(2周)关节软骨即开始显现少量簇聚的软骨细胞和单个肥大的软骨细胞;至中期时(6周)软骨中、深层细胞排列紊乱,有大量簇聚软骨细胞,潮线断裂,深层肥大软骨细胞增多,软骨蛋白聚糖丢失;术后10周时,软骨表层显现较大缺损区,细胞排列紊乱,软骨细胞层次不清,潮线消失,部份显现软骨全层缺损,蛋白聚糖进一步丢失。
DaubsBM等[4]在狗的膝关节OA模型中也观看到类似的病理转变进程。
在OA的病理进程中,关节软骨细胞及滑膜细胞分泌过量的基质金属蛋白酶(MMPs),打破了MMPs-TIMP(组织金属蛋白酶抑制剂)的平稳,造成对关节软骨细胞外基质的过度降解,是软骨慢慢显现溃疡、缺失等一系列退变表现的重要缘故[5]。
其中MMP-13能够在胶原纤维的三螺旋区裂解胶原纤维,对Ⅱ型胶原的活性最强。
关节软骨基质中的胶原90%~95%是Ⅱ型胶原,因此观测MMP-13在OA软骨破坏进程中的表达尤其重要[6]。
在此模型中观看到MMP-13在术后2周时表达不明显,到6、10周时表达明显增强,且软骨下骨破骨细胞中也见表达。
说明MMP-13与OA的病情进展紧密相关,能够反映出OA软骨的退变程度。
软骨下骨的结构、生物力学性能及生物学方面的转变与OA紧密相关[7]。
软骨下骨转换的增加及以后软骨下骨的硬化被以为与OA的进展相关。
因此评判软骨下骨改变骨体积有利于全面了解OA的病理转变进程。
BotterSM等[8]在大鼠骨关节动物模型顶用micro-CT三维成像技术纵向观看造模处骨组织的转变4周,发此刻模型初期软骨下骨小梁变薄,小梁间的连接变少,体积亦减小。
在HayamiT等[9]的研究中也发觉OA初期软骨下骨量减少,骨转换速度加速,骨吸收大于骨形成。
随着病程的进展,骨重建骨量增加,软骨下骨硬化,骨赘形成。
咱们在此OA模型中发觉,2周时在软骨尚未显现明显组织学转变之前,软骨下骨小梁体积减小,骨小梁变薄,呈现出轻度的骨吸收。
说明在OA初期,软骨下骨转换活跃,骨吸收大于骨形成。
6周时,软骨下骨量明显增加,10周骨量进一步增加,即有继发性的骨增生骨质硬化。
软骨下骨改变与OA的发生进展紧密相关,在OA的发生进展中起重要作用,抑制软骨下骨的异样骨转换可能减缓OA进展[10]。
总之,该模型能模拟出OA随时刻进展的大体病理进程,复制出骨性关节炎软骨退变进程,和软骨下骨吸收、骨重建的转变特点,且具有造模周期相对短、经济、操作简便等优势,为下一步以软骨下骨为目标进行干与实验打下了基础。
【参考文献】
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