人腺样囊性癌多药耐药细胞系的成立.docx
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人腺样囊性癌多药耐药细胞系的成立
人腺样囊性癌多药耐药细胞系的成立
周晓冬 宋国祥 隋志方 畅继武
【摘要】 目的:
成立人腺样囊性癌耐药细胞系,为说明腺样囊性癌的多药耐药机制及逆转耐药提供模型及研究依据。
方式:
以长春新碱(VCR)为诱导剂,通过浓度递增中断刺激法对人腺样囊性癌细胞系(ACC)进行体外诱导耐药,成立耐VCR的腺样囊性癌细胞系ACC/VCR。
细胞计数法绘制细胞生长曲线,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞对化疗药物灵敏性。
结果:
ACC经体外诱导后,ACC/VCR细胞对长春新碱(VCR)、阿霉素(ADM)和平阳霉素(PYM)的耐药性明显增强,具有交叉耐药,对环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)耐药性无明显转变。
耐药前后ACC细胞的生长曲线、群体倍增时刻和光镜下的形态无明显改变。
结论:
VCR可诱导腺样囊性癌细胞产生多药耐药。
【关键词】腺样囊性癌 多药耐药 长春新碱
Establishmentofmultidrugcelllineofhumanadenoidcysticcarcinoma
AbstractAIM:
Toestablishaninvitroresistancemodelofadenoidcysticcarcinomawhichcanprovidetheoreticalinformationforelucidatingthemechanismsofmultidrugresistance(MDR),improvingthechemotherapyscheme,evaluatingtheprognosisandreservingtheMDRinadenoidcystic:
Theresistancecellline,ACC/VCR,wasinducedintheACCcelllineinvitrobyprogressiveconcentrationsofvincristine(VCR),adrugofchoiceinthetreatmentofadenoidcysticcarcinoma.Thegrowthcurve,drugsensitivityintheparentalandresistantcelllineswereinvestigatedbycellcountingandMTTassay.RESULTS:
ACC/VCRcelllinewascross-resistanttovincristine(VCR),adriamycine(ADM)andpingyangmycin(PYM),butnotresistanttoCyclophosphamide(CTX),fluorouracil(5-FU)andcisplatin(DDP).TherewasnosignificantdifferenceinthedoublingtimeandmorphologicalchangesbetweenACCcelllineandACC/VCRcellline.CONCLUSION:
ExposingtoVCRcaninduceMDRinadenoidcysticcarcinoma.
·KEYWORDS:
adenoidcysticcarcinoma;multidrugresistance;vincristine
ZhouXD,SongGX,SuiZF,ChangJW.Establishmentofmultidrugcelllineofhumanadenoidcysticcarcinoma.IntJOphthalmol(GuojiYankeZazhi),2007;7
(2):
417-419
0引言
腺样囊性癌(adenoidcysticcarcinoma,ACC)是一种高度恶性的上皮性肿瘤,可发生于全身各部位,如涎腺、颌下腺、气管、肺、乳腺、皮肤等,于眼眶那么好发于泪腺[1]。
目前对腺样囊性癌的医治以综合医治为主,其中化疗要紧作为新辅助化疗(术前或放疗前化疗)、辅助化疗(手术后或放疗后化疗)、放疗增敏剂和姑息性化疗应用[2]。
有的肿瘤细胞在对一种化疗药物耐药的同时,对其他结构和机制不同的化疗药物也产生耐药性,称为肿瘤细胞的多药耐药性(multidrugresistance,MDR)[3]。
多药耐药的产生是致使肿瘤产生耐药和化疗失败的重要缘故之一。
咱们通太长春新碱诱导成立腺样囊性癌耐药细胞系,旨在为说明腺样囊性癌的多药耐药机制,指导多药耐药逆转剂的研究提供模型和研究依据。
1材料和方式
材料人腺样囊性癌(ACC)细胞系购自上海申能博彩公司。
RPMI1640干粉培育基(Gibco公司),胎牛血清(天津灏阳生物,56℃40min灭活补体),青、链霉素(石家庄制药厂),谷氨酰胺(L-glutamina)(Gibco公司),胰蛋白酶(Sigma公司),依地酸二钠(EDTA)(广州化学试剂厂),二甲基亚砜(DMSO)(北京鼎国生物),噻唑蓝(MTT)(北京鼎国生物),长春新碱(vincristine,VCR)(上海华联制药),环磷酰胺(CTX)(上海华联制药),阿霉素(adriamycin,ADM)(深圳万乐药业),氟尿嘧啶(5-FU)(天津市氨基酸公司人民制药厂),平阳霉素(PYM)(天津太河制药),顺铂(DDP)(山东齐鲁制药厂)。
CO2培育箱(Heraeus,德国),倒置显微镜(Olympus-1M,日本),生物显微镜(OlympusBH-2,日本),紫外分光光度计(UV754,上海分析仪器厂),台式高速离心机(Allegra64R,美国Beckman),磁力搅拌器(江苏省金坛市通济仪器厂),酶联仪(DG-3022A,南京电子管厂)。
方式ACC细胞系培育在含100ml/L灭活胎牛血清、100kU/L青、链霉素的RPMI1640培育液中。
培育条件:
37℃,50ml/LCO2,每3d换液1次,L胰酶、LEDTA消化传代,约5d传代1次。
采纳VCR浓度递增中断刺激法选择耐药细胞,具体步骤如下:
VCR15μg/L×7d,去药7d,VCR30μg/L×7d,去药7d,VCR60μg/L×7d,去药7d,VCR60μg/L×7d,去药7d,VCR120μg/L×7d,去药7d,VCR120μg/L×7d,去药7d,VCR250μg/L×7d,去药7d,VCR250μg/L×7d,去药7d,无药培育7d后进行实验。
取生长状态良好的细胞,L胰酶、LEDTA消化制成细胞悬液,计数,将细胞悬液接种于24孔板,每孔1mL,接种浓度1×107/L,37℃,50ml/LCO2培育。
每日取3孔板细胞进行计数,计算均值。
持续观看7d,其间培育3d后给未计数的细胞换液。
以培育时刻为横轴,细胞数为纵轴(对数),在半对数坐标纸上绘制生长曲线,依照公式计算细胞在对数生长期的倍增时刻。
TD(倍增时刻)=t(培育时刻h)×lg2/(lgNt-lgN0)。
N0,Nt:
接种后及培育th后的细胞数。
MTT比色实验[4]测定化疗药物灵敏性:
取对数生长期细胞,L胰酶、LEDTA消化,用含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培育液配成5×106~1×107/L的单个细胞悬液;取96孔培育板,每孔加入200μL细胞悬液,37℃,50ml/LCO2培育留宿;改换培育液,并按一系列浓度(终浓度别离为,,1,10,100、1000mg/L)加入抗肿瘤药物,每浓度重复3孔,以不加细胞只加培育液的孔作为空白对照,37℃,50ml/LCO2培育72h;每孔加5g/LMTT溶液20μL,37℃,50ml/LCO2继续孵育4h,终止培育,警惕吸弃孔内上清液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,振荡10min,使其充分溶解;选择490nm波长,在酶联仪上测定各孔吸光度(A);按公式计算细胞存活率,以细胞存活率对药物浓度对数作图,求出药物半数抑制浓度(IC50),计算耐药系数(resistancefactor,RF)。
细胞存活率(%)=实验组吸光值A/对照组吸光值A×100%,RF=耐药细胞IC50/亲代细胞IC50。
2结果
细胞系的成立ACC细胞系经VCR体外诱导挑选,持续培育4mo,取得了在250μg/LVCR作用下生长良好的耐药细胞系。
命名为ACC/VCR。
无药培育2mo,对VCR的耐药指数无明显下降,说明已有稳固的耐药性。
VCR在体外诱导耐药的培育进程中,加药后细胞显现肿胀,胞浆内颗粒较粗,细胞生长受抑,增殖速度很慢乃至不增殖,随之大量脱壁、数量减少。
换用不含VCR的培育液培育,并适当延长传代周期,存活下来的耐药细胞生长割裂加速,形成多个细胞克隆,再慢慢融合成片,但细胞大小不一,排列紊乱,异型性较为明显。
然后继续用含VCR的培育液挑选。
通过几回挑选后,不耐药或耐药性低的的细胞被排除,余下的是有较高抗药性的细胞。
细胞形态学观看ACC和ACC/VCR细胞在体外均为贴壁生长,在倒置显微镜下为多角形上皮样细胞,大小较为一致,胞质内可见透亮度深浅不等的颗粒,核大,类圆形或不规那么形,核/质比例高,核仁2~3个,清楚可见的,并可见庞大融合细胞。
细胞割裂相多见,并有多级核割裂,排列紧密时细胞相互镶嵌成铺路石样,密度再增高时可重叠生长,表现为接触抑制消失(图1A,B)。
ACC和ACC/VCR细胞在体外增殖速度相似(生长曲线见图2)。
群体倍增时刻别离为±和±,两组间比较无显著性不同(t=,P=)。
耐药谱ACC/VCR不仅对原诱导药物VCR具有耐药性,而且对ADM,PYM有交叉耐药性(表1)。
各类化疗药物临床经常使用量所达血药浓度别离为:
VCRL;CTX140mg/L;ADM6mg/L;5-FU50mg/L;PYM20mg/L;DDP5mg/L。
3讨论
最近几年的研究发觉,肿瘤细胞一样多对天然植物碱及其人工半合成衍生物类(如长春新碱、长春花碱、秋水仙碱等、鬼臼乙叉甙等)和抗生素类(如阿霉素、放线菌素D、柔红霉素、光神霉素等)药物易产生耐药和交叉耐药,而且不同组织来源的肿瘤其发生多药耐药的机制亦各不相同[5]。
对MDR的研究关于改善肿瘤患者预后,制定合理的医治方案以避免MDR显现或逆转MDR有重要意义。
体外成立耐药细胞系国内外均见报导,经常使用的方式是浓度递增中断刺激法[6,7],即通过在体外培育的亲代细胞中慢慢增加某一种化疗药物的浓度,通过药物选择作用取得耐药细胞系,为体外研究多药耐药提供模型。
固然,药物在体内的代谢和作用进程远比体外复杂,不该单纯进行体外实验而轻忽对临床标本的研究。
有关人ACC细胞体外实验的研究目前国内外多有报导,现已成立有SACC83,ACC-M等细胞系,并进行了一系列有关药物灵敏性测试、放射医治、生物医治等方面的实验研究[8,9]。
可是,体外环境远不如体内复杂,而且在体外培育进程中,肿瘤细胞的某些生物学特性可能会发生转变,与实际的进程可能有必然出入,因此体外实验得出的结论有时并非能完全说明肿瘤在机体内的生物学行为和病理进程。
作为肿瘤细胞,ACC为无穷细胞系,在体外可无穷传代生长,但培育进程中失去了原有的腺管样排列结构,铺成片状,接近于实性型的细胞排列结构。
咱们以长春新碱为诱导剂,通过浓度递增中断刺激法在体外对ACC细胞系进行挑选和诱导耐药,成立了耐VCR的腺样囊性癌细胞系ACC/VCR。
VCR是目前ACC化疗中最常利用的药物之一,也是化疗药物中最易产生耐药的一种。
目前国内外多有成立肿瘤耐药模型的报导,VCR是最常利用的药物之一,浓度递增中断刺激法是最多见的诱导方式,它与临床上化疗药物的利用具有必然相似的地方[6]。
通过在体外成立耐药模型,可对肿瘤多药耐药机制进行研究,用于说明肿瘤在体内发生耐药的机制,还能够为耐药逆转剂的研究提供基础。
ACC和ACC/VCR细胞在生长曲线及群体倍增时刻上无明显转变,在倒置显微镜下,细胞形态学亦无明显转变。
但有研究说明,在电镜下亲代细胞和耐药细胞存在形态学转变。
Prados等[10]在研究以放线菌素D(DAC)为诱导剂成立的横纹肌肉瘤耐药细胞系时发觉,电镜下耐药细胞显现胞质内肌丝成份聚集、细胞器增多、双叶核等改变,细胞形态学的转变要紧体此刻超微结构上。
恶性肿瘤的药物灵敏性研究一直是肿瘤医治学研究中的热点问题,准确快速的肿瘤化疗药敏检测对指导临床选择化疗药,提高疗效具有重要意义[11,12]。
但目前要紧集中在实验室研究,真正进入临床前瞻性研究,指导临床医治的还很少,尤其是在国内,尚未见进行临床实验的报导。
目前关于ACC化疗成效的临床研究观点不一,关于化疗方案的选择不同专门大。
这可能与肿瘤的生物学特性(组织学分型、分化程度和细胞动力学等)、患者的个体不同(对化疗药物的灵敏度和耐受程度)、药物本身的毒性反映等有关。
在临床上常常利用同一种化疗方案医治同一种肿瘤的不同患者乃至是患有不同肿瘤的患者,这显然是不科学的,针对不同患者进行肿瘤药物灵敏实验以选择有效的化疗药物,制定个体化的化疗方案,才是尔后化疗的进展趋势。
咱们选取的6种化疗药物,作用机制各不相同,且均是目前临床上比较经常使用的用于医治ACC的化疗药物[13]。
自1983年Mosmann第一利用MTT研究瘤细胞生存状况以来,MTT法药敏实验迅速成立并取得进展[4]。
其染色剂是一种能同意氢原子的染料,化学名3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazo-diumbromide,MTT),商品名噻唑蓝,简称为MTT。
MTT法的特点是灵敏度高、快速、简便、经济,不需放射性同位素,结果重复性好,并可同时对多种药物进行挑选和观看,可适用于所有肿瘤类型,目前美国国立癌症研究所已将其作为挑选化疗药物的常规手腕。
咱们采纳MTT法进行体外药物灵敏性实验,结果显示,由亲代细胞诱导得来的耐药细胞ACC/VCR不仅对VCR耐药,而且对ADM,PYM发生了交叉耐药。
这与目前研究以为多药耐药多见于天然来源的化疗药物的观点相符。
通过MTT实验咱们发觉,化疗药物常规临床用量所达到的血药浓度多数对肿瘤细胞增殖达不到有效的抑制作用,但是通过无穷制增加药物用量以达到杀灭肿瘤细胞目的的做法只可用于体外实验,在临床上盲目增大化疗药用量会大大增加对人体的毒副作用,乃至可能带来致命的后果。
解决的方法有两个,一是通过逆转耐药剂的研制,增加肿瘤细胞对化疗药物的灵敏性,以减少用药量,减轻毒副作用;二是研发全新的药物剂型,使药物具有靶向性缓和释性的特点,肿瘤组织局部能够达到有效血药浓度而外周血药物浓度很低。
例如,研制全新的多药耐药逆转剂,针对已知多药耐药相关基因进行基因医治逆转耐药[14],和用具有缓释作用的纳米粒子包裹化疗药物进行主动靶向医治的研究[15],都会是尔后化疗研究的新热点。
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