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分子生物学第三章基因和基因组
第三章基因和基因组
第一节基因组的大小与C值矛盾
一、相关概念
☆基因(gene)
是合成一种功能蛋白或RNA分子所必需的全数DNA序列.
一个典型的真核基因包括
①编码序列—外显子(exon)
②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)
③5‘-端和3’-端非翻译区(UTR)
④调控序列(可位于上述三种序列中)
基因平均由1000个碱基对组成,一个DNA分子可能包含几个或几千个基因。
☆基因组(genome):
一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和,即生物体维持配子或配子体正常功能的全套染色体所含的全数基因(DNA)。
基因组的大小用全数DNA的碱基对总数表示。
比如人基因组的全长为大约3×109对碱基,编码3-4万个蛋白分子。
细菌或噬菌体、病毒---单个染色体中所含的全数基因(DNA)。
人类基因组打算(humangenomeproject HGP)
基因组学(genomics)
结构基因组学(structuralgenomics)
功能基因组学(functionalgenomics)
☆C值(C-value):
在真核生物中,每种生物的单倍体基因组的DNA总量老是恒定的,称为C-值
低等真核生物中与形态学复杂程度相关,但高等真核生物中转变专门大
所谓C值(Cvalue)即单倍体基因组的DNA总量。
它是每一种活生物的一个性质。
C值大小有着庞大不同。
小到象支原体那样的不足106bp,大到一些植物及两栖类的1011bp。
进化中不同门的C值范围。
随着复杂度的增加,基因组大小的最小值是增加的。
可是随着高等真核生物DNA绝对量的增加,有些门的基因组大小显现了专门大的转变。
每门的一种生物DNA的最小量要使原核生物比低等真核生物更复杂,增加基因组大小是必要的。
盐沼核菌(pyrenomassalina)是现已证明的含有最小基因组的真核生物,它有×105bp,(但是这些生物可能并非是真正的真核生物,但可能是进化的中间时期,代表了细胞核与叶绿体的原始存在形式。
)支原体是最小的原核生物,它的基因组大小只是一个大噬菌体的3倍(T4基因组为×105bp)。
细菌基因组大小至少为2×106bp。
单细胞真核生物(其生命周期可能包括原核时期)的基因组大小也是这么小,尽管它比细菌基因组稍大些。
作为真核细胞perse并非意味着需要基因组大小有专门大的增加。
酵母的基因组大小能够只有约×107bp,仅仅是最大的细菌基因组大小的两倍。
黏菌D.Discoideum的基因组比酵母大了两倍,它能够以单细胞或多细胞的形式存在。
为了第一个完全的多细胞生物,复杂度增加是十分必要的。
线虫(c.elegans)的DNA容量为8×107bp。
沿着进化树上行,咱们能够看出,尽管基因组大小的增加关于昆虫、鸟类或是两栖动物与哺乳动物这些物种的产生是超级重要的,但复杂度与DNA的关系变得模糊了。
二、C值矛盾与表现
C值矛盾(C-valueparadoxC-悖理):
形态学的复杂程度与C-值的不一致称为C-矛盾。
要紧有以下几方面的表现
之一:
物种之间--形态学的复杂性和C-值的复杂性不成正相关
a、生物进化程度与C-值的矛盾。
两栖类与哺乳类之间
b、亲缘关系相近的生物C-值相差较大
例1:
两栖类的C-值范围
例2:
一种一般果蝇的基因组为X108,而一种一般家蝇的为X108
之二:
与预期的编码蛋白质的基因的数量相较,基因组的DNA含量过量。
例:
人类与编码基因数量的比较研究。
.4X106bpDNA约编码3000种基因。
人类29X108bp的DNA是大肠杆菌的700多倍。
有上百万个基因?
?
?
另外:
依照不同细胞中的mRNA数量来估算表达基因的方式。
◘持家基因(housekeepinggene):
有些基因是在所有的细胞类型中都表达的,即这些基因的功能为所有细胞所必需(或称组成型基因constitutivegene)。
◘奢侈基因(luxurygene):
仅在某种特定类型的细胞中表达的基因。
哺乳动物的每种表型的细胞表达的基因约为1X104个,如此整个哺乳动物的基因数量要多于每种细胞的表达数,估量应该有1X105个(不同书上有必然误差),约为大肠杆菌的30倍,那么90%以上的DNA功能安在?
?
第二节细菌和病毒基因组
一、大肠杆菌(Escherichiacoli)
一、大肠杆菌在实际工作中的重要性
常常被看成是所有生物的原型(archetype):
a、在实验室中容易操作
b、生长迅速,要求营养物质简单,能进行很多生理生化进程
c、其有性生殖的存在使得遗传学的研究成为可能(遗传杂交、遗传性状、存在性状)
d、能够供给细菌病毒的生长,使病毒的本性即病毒扩增的深切研究成为可能。
二、大肠杆菌的遗传物质
(1)染色体DNA
需要基因组DNA的一些相关操作一样选择对数生长期的(2~4个类核)以取得丰硕的基因组DNA
◙类核中,染色体DNA成份占80%,其余为RNA和蛋白质
◙x106bp的基因组DNA与多种DNA结合蛋白质组装成的染色体
◙基因组DNA为双链环状,总长度为1100~1400μm,1400个基因都已定位
警惕地将大肠杆菌的DNA与它的大多数结合蛋白分离开,在电子显微镜下就可观看到拟核的组构,其DNA由50~100个环或结构域组成,这些环或结构域的结尾被与细胞膜的一部份相连的蛋白固定。
环的大小为50~100kb。
☻的基因组的特点
a、功能相关的几个结构基因以操纵元(operon)的形式存在
其中包括一起的调剂基因、启动子(promoter)、操作子(operator),在基因转录时协同动作。
b.结构基因中没有内含子,也无重叠现象。
c.细菌DNA大部分为编码序列。
d、RNA基因往往多拷贝,蛋白质为单拷贝。
(2)质粒DNA(plasmidDNA)
细菌中另一类遗传物质,环状DNA,存在于染色体之外,能自我复制,质粒也携带许多基因,如:
抗生素抗性基因
3、大肠杆菌的酶类
细胞中含有核酸代谢所需的酶类,除DNA聚合酶(DNApolymerase)、RNA聚合酶(RNApolymerase),还有多种限制性内切酶(restrictionendonuclease)
限制性内切酶是分子生物学实验操作中最大体的工具酶,在DNA测序、片段分离、克隆DNA的环节都要用到
二、病毒基因组的特点
1.每种病毒只有一种核酸,或DNA,或RNA;
2.病毒核酸大小差别很大,3X103一3X106bp;
3.除逆病毒外,所有病毒基因都是单拷贝的。
4.大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA),仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成.
5.真核病毒基因有内含子,而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子.
6.有重叠基因
二、λ噬菌体
*双链DNA,长度48Kb,其DNA分子有三种存在形式
a、两个粘性结尾分离的线性分子COS位点(cohesive-endsite)
b、带有切刻的环状分子(开环的粘性结尾互补后未连接的
c、闭合环状分子(粘性结尾互补,DNA连接酶连接)
*其基因均是按功能相近的聚集成簇的(两个正调剂基因N和Q除外)
其基因的组织形式,除两个正调剂基因N和Q之外,均是按功能相近的聚集成簇的。
λ噬菌体的7个头部基因A~F占有彼此邻接的位置,调控基因N、CI、CII、CIII、Cro也集中在一个区域。
另外,结构基因与它们所编码的蛋白质所作用的部位也在邻接的部位,例如整合基因int和切离基因xis处在附着点att的隔壁;复制基因O和P处在复制起始点隔壁。
*存在形式
在寄主体内有溶源生长周期(原噬菌体)和溶菌生长周期两种生活途径
第四节真核生物的染色体与基因
一、真核生物染色体结构回忆
二、真核生物DNA的复性动力学(从头结合动力学Reassociationkinetics)
●真核生物复性动力学研究
真核生物基因组大小的范围产生了一个重要问题:
是不是较大的基因组含有较多的基因,或只是含有与较小基因组相同的基因但更多的拷贝呢。
若是基因种类随基因组大小增加而增加,咱们应该能够期望基因组中独特DNA序列将增加。
而若是只是简单拥有更多拷贝,这种情形将可不能发生。
真核基因组的普遍性质能够通过变性DNA重组动力学去取得。
互补序列的重组是依托碱基配对的原则发生的,是使双链分开的变性进程的反进程。
这种技术能够被拓展到利用它们与特殊探针杂交的能力分离单个DNA或RNA。
重组反映动力学反映出了各类不同序列的存在。
因此那个反映能够被用来将基因和它们的RNA产物定量化。
●复性动力学的研究方式
一样咱们能够通过以下两种方式检测在复性反映中单链已经合成双链:
(1)减色效应(hyp0ochromiceffect)
和增色效应相反,由于双链慢慢增多,对260nm的紫外线吸收会相应减弱。
因此测定光密度,即OD值(opticaldensity)即可。
DNA从单链变成双链,OD减少30%。
(2)羟基磷灰石层析
羟基磷灰石的特点是对双链DNA吸附较牢,不宜吸附单链,咱们将样品过柱,然后用不同浓度的缓冲夜洗脱,就能够够搜集单链和双链DNA,计算相的浓度。
●C0t曲线
DNA复性依托于互补链的自由碰撞,而且符合二级动力学方程。
单链消失的速度可用下面公式表示:
-dC/dt=kC2
其中C为单链DNA的浓度,单位是每开的核苷酸摩尔数;t是时刻,单位为秒;k是二级反映常数,单位是升/mol秒,k值取决于阳离子浓度、温度,片断大小和DNA分子序列的复杂性(sequencecomplexityoftheDNApopulation)。
上面公式能够重排为 -dC/C2=kdt。
当t=0时,C=C0,将上式积分:
-〔1/C0-1/C=kt,即1/C-1/C0=kt,可重排成C/C0=1/(1+kCot)。
在上式中,当t=0时,C=C0,表明所有的DNA都是单链。
C0为DNA的总浓度。
复性的分数C/C0是起始浓度和通过时刻的乘积Cot的函数,如此的函数能够绘成下面的左图,称为Cot曲线。
当C/C0=1/2时的Cot值概念为Cot1/2,因此Cot1/2=1/k。
任何DNA的反映能够用其半复性条件表示。
即C0×t1/2之乘积,称为Cot1/2。
Cot1/2等于浓度与达到最大数度一半所需时刻之积,与速度成反比,Cot1/2增大意味着反映速度变慢的。
Cot1/2代表了基因组的大小和DNA顺序的复杂程度。
在一个指定的实验里,C0是已知的,C能够测定,如以C/C0对C0t作图,可得如图所示的曲线。
在曲线的中点,即C/C0=1/2时,C0t=1/K。
各个不同的DNA的cot值是不同的,不仅与k值相关,而且DNA分子序列的复杂性阻碍k值。
DNA分子的序列的复杂性X值概念为:
最长的没有重复序列的核苷酸对的数值,例如(ATATAT…),其X值为2,(ATGC)的X值为4,没有重复序列的含有10核苷酸对的DNA分子的X值为105。
在DNA总浓度(以核苷酸为单位)相同的情形下,片断越短,片断浓度就越高,复性所需的时刻也越短t1/2也越小,因此,x值与的关系是X=KCot1/2。
其中,比例常数K将取决于反映条件(阳离子浓度,片断大小等),在通常利用的标准状况下当量的阳离子,片断大小400个核苷).K=5×105(升×核苷酸对/核苷酸mole×秒),即在此条件下,X=5×105Cot1/2(核苷酸对)。
DNA复性通常符合Cot曲线(Cotcurve)。
Cot曲线标出了DNA复性的部份(1-C/C0)和横轴上的Cot值。
图中给出了几个简单基因组的Cot曲线。
每一曲线的形状都相同,在点10%和90%反映之间Cot值相差100倍。
可是每一个曲线的Cot1/2值是不同的。
图中的基因组代表了不同的DNA,其序列不同且愈来愈长。
Cot1/2值直接与基因组中DNA含量相关。
这表明随着基因组复杂性增加,在给定的DNA中一个特定序列的拷贝数减少。
例如,若是DNA的C0值为12pg,那么一个大小为的细菌基因组中每一个序列有3000个拷贝,可是在3pg的真核基因组中每一个序列只有4个拷贝。
因此一样以摩尔核苷酸每升表示的DNA绝对浓度(即C0)表明每一个真核序列比细菌序列少3000/4=750倍。
由于复性的速度依托于互补链的浓度,假设真核序列和细菌序列有相同的浓度,那么真核序列应多达750倍的DNA(或将一样大的DNA反映750倍长的时刻)。
因此真核反映的Cot1/2是细菌的750倍。
一个反映的Cot1/2表明所包括不同序列的总长度,用复杂度(Complexity)表示,通常以碱基对为单位。
任何基因组(或基因组的一部份)复性的Cot1/2与其复杂度成正比。
任何DNA的复杂度能够通过与复杂度已知的DNACot1/2比较得出。
通常以大肠杆菌DNA作为标准。
假设×106bp大肠杆菌基因组由不同序列组成:
基因组复杂度=Cot1/2(基因组DNA)××106bp/6(大肠杆菌DNA)
●真核生物复性动力学研究
当用复性动力学方程确信真核基因组DNA时,通常Cot值跨越8个数量级。
这比之前图推测出的100倍范围大的多。
其缘故在于前图每一曲线都符合含有单一成份的复性动力学方程,而真核基因组事实上包括几种如此的成份,每种成份都以其特定动力学复性。
Cot曲线分析表明,真核和细菌基因组之间存在重要区别:
细菌基因组仅由单一成份组成,而真核基因组要复杂得多。
真核生物基因组包括的几种序列成份
图中给出了某种(假想)真核生物基因组,起始于c0t值为10-4,终止于c0t值为104。
那个反映分为三个明显的相区,用阴影框住。
在前两相区区间有一个平台区,而后两个相区则有重叠。
每一个相区都代表了基因组不同的动力学成份:
1. 快速组分是重组的第一部份。
在那个地址点总DNA的25%,在cot值10-4至约2×10-2间复性,cot½值为。
2. 紧接着是中间组分。
占DNA的30%,在cot值到100间复性,cot½值为.
3. 慢组分是最后复性的部份。
占总DNA的45%,在cot范围100-10000间复性,cot½为630。
为了计算这些组分的复杂度,每一个组分都必需视为独立的动力学组分进行对待并与标准DNA比较。
慢组分占总DNA45%,在复性反映中它的浓度测定Co的倍(Co为存在DNA的总量)。
如此慢组分cot½为×630=283
因此,若是慢组分被纯化出进单独复性,其复性将以cot½为283进行。
假定这些条件下,大肠杆菌DNA以cot½为40复性。
比较这两个值,咱们能够发觉那个组分复杂性为×108bp.用一样方式处置其他组分表明,中间成份复杂度为6×1015bp,快速组分为340bp.这为咱们提供了一个进行量化的依据:
组分重组越快复杂性越低。
反过来,若是咱们把三种DNA每种含有的独特序列均为恰好长度(340bp,6×105bp与3×108bp),而且以质量比25:
30混合,每一种组分就会犹如仍是单一组分一样进行重组。
而且总起来讲混合物将显示出与图中全基因组相同的动力学图。
最慢成份的复杂度符合其物理大小。
假设图中复性的基因组为×108bp的单倍体DNA(由化学分析而知)。
那么其45%确实是×108bp,只比由复性动力学计算取得的×108bp稍高一点。
考虑到技术上的小误差,能够以为用化学和动力学测得最慢成份的复杂度大体相同。
最慢成份由基因组中独特的序列组成:
变性后,每一个单链序列只能与其相应的互补链复性。
最慢成份是原核基因组中唯一组成成份,通常也是真核生物中的要紧成份,称为非重复(Nonrepetitive)DNA。
比非重复序列复性快很多的成份的本质是什么呢?
在图所示的例子中,中间成份占基因组的35%,其化学复杂度为×7×108=×108bp。
可是其动力学复杂度只有6×105bp。
与复性Cot1/2相对应的DNA独特长度比基因组中该成份的DNA化学长度要短得多。
换言之,中间成份由基因组中长度为6×105(因350×6×105=×108)的350个拷贝组成。
变性以后,任何一个拷贝产生的单链能够与来自350个拷贝的互补链复性。
这有效地提高了复性反映中反映序列的浓度,能够说明什么缘故该成份以很低的Cot1/2值复性。
在每一个基因组中不止一次显现的序列称为重复(Repetitive)DNA,其在每一个基因组中显现的拷贝数称为重复频率(Repetitionfrequency,f)。
依照其重复频率,重复DNA通常分为两大类型,与图所示中间成份和快成份相对应。
图所示中间成份包括总长度为6×105bp的DNA,在每一个基因组中重复了350次。
可是这并非指单个,能确信持续长度的DNA。
相反,它由一系列序列组成,每一个都短于6×105bp,其总长度等于那个数值。
这些序列分散在基因组中,其平均重复次数为350次,但有些会以更多的重复频率显现,有些则显现很少。
把每一个组分单独提取作复性实验,有一个C0t(1/2)值矫正,因混合组分复性时,该组份C值为C0X百分数
C0t(1/2)值矫正:
25%×=30%×=45%×630=283
若是一样条件下:
C0t(1/2)ofDNA=6
KineticComplexityof=×106
则各类复性组分的复杂性能够计算出:
KineticComplexityof慢复性组分=×106X283/6=X108
往往假定慢复性组分为单一序列
即重复频率(Repetitivefrequency)f=1
即反推
GenomeDNA总长度=(f×.)/该组份所占比例
(近似值)=(1××108)/45%
=×108
因此,快复性组分和中间复性组分的.和f值能够计算取得
340,×105,350
●真核生物复性动力学研究发觉了重复序列
三、DNA的序列类型
一、高度重复序列(Highlyrepetitivesequence)
重复DNA是依照它(相对)快速的复性速度确信的。
在真核生物基因组中复性速度最快的组分称为高度重复DNA,是由超级短的在庞大基因簇中串联重复多次的序列组成。
由于它的重复单位很短,有时称为简单序列DNA(SimplesequenceDNA)。
这种DNA几乎存在全数真核生物基因组内。
此类DNA中除含有大的基因簇之外,还散布着非重复DNA的小一些的基因簇。
这些小基因簇含有短的序列,这些短序列在基因组中相同或相关拷贝中重复。
双链DNA的浮力密度取决于它的G-C含量。
当真核生物DNA进行密度梯度离心时,能够分成两个部份。
大部份基因组形成由许多组分形成的持续区域,看起来像是一个按相当于该基因组平均G-C含量的浮力密度集中的颇宽的峰,那个峰称为主带。
有时看到另外一个(或一些)大小不同的小峰,这部份称为卫星(Satellite)DNA。
卫星DNA这种叫法实际是简单序列DNA的同义词。
与简单序列一样,卫星DNA不能转录和翻译。
卫星DNA(SatelliteDNA):
将DNA切成数百个碱基对的片段进行超速离心时,由于富含AT的简单高度重复序列区段浮力密度较小,因此很容易和整体DNA分开,即常会在要紧的DNA带的上面有一个次要的带相伴随.
卫星存在于很多真核基因组中。
它们可能比主带重也可能比主带轻。
但它们在总DNA中的比例很少大于5%。
小鼠DNA是一个专门好的例子(图),该图是小鼠DNA经CsCl密度梯度离心区带的定量扫描图谱。
主带含基因组的92%,并集中于1.701g-cm-3的浮力密度区(相当于它的平均G-C值为42%,这是典型的哺乳动物的G-C值)。
较小的峰相当于基因组的8%,浮力密度为1.690g-cm-3,含有小鼠卫星DNA,该DNA的G-C含量远低于基
因组的任何其他部份(可能为30%)。
基因组中大多数高度重复DNA能够以卫星的形式分离出来。
当某高度重复DNA成份不能作为一个卫星分离出来时,依照离心能够证明它与卫星DNA的性质类似。
也确实是说,它由多重串联重复组成,并有异样离心行为。
以这种方式被分离出来的DNA有时候叫隐蔽卫星(Crypticsatellite)。
隐蔽卫星和可见卫星通常组成全数高度重复DNA的串联重复区段。
高度重复区段存在何处?
核酸杂交技术的推行使卫星序列的位置可直接在整套染色体上取得测定。
卫星DNA常常存在于异染色质上。
节肢动物的卫星具有很短的相同的重复序列
在节肢动物中,以昆虫和蟹类为典型,每一个卫星DNA都有很高的相似性,通常卫星的90%以上都是由一个很短的重复单位组成,这使得测序变得相对容易。
果蝇(D.virils)有三条要紧的卫星,而且还有隐卫星,总共占基因组的40%以上,这些卫星的序列已归纳在表中。
这三条要紧的带有超级相近的序列,从卫星Ⅰ只要改变一个碱基就能够够取得卫星Ⅱ或卫星Ⅲ。
卫星Ⅰ的序列也存在于与果蝇相联系的其它种类的果蝇中,因此这极可能是在此物种形成以前就存在。
卫星Ⅱ和Ⅲ的序列仿佛是果蝇(D.virils)特有的,因此可能是在物种形成以后由卫星Ⅰ进化而来的。
这些卫星的要紧特点是短小的重复单元:
仅有7个碱基对,相似的卫星能够在其它的物种中找到,果蝇()具有一系列卫星,其中几条含有超级的重复单元五、7、10或12bp),在蟹类中也能够找到类似的卫星。
在果蝇()中存在的这种卫星间相近的序列关系关于其它基因组并非是必需的,其它的物种中能够存在序列不相关的卫星,每一个卫星都是由一段超级短小的序列向隔壁放大而来的,这些序列可能是由以前存在的卫星转变而来(像在果蝇中),或还存在着一些其它的起源。
卫星不断地从基因组中产生和丢失,这使得咱们很难弄清其进化关系,因为现存的卫星可能是由已经丢失的初期卫星进化而来的,这些卫星的一个重要特点是它是一个复杂性很低的长链DNA,而且链顺序的恒定性能够维持。
很多这种卫星DNA的一个特点是位于两条链上的碱基是很不对称的,如表所示卫星,每一个要紧卫星的双链中有一条链富含碱基,因此增加了其浮力密度,因此在变性的情形下这条重链(H)能够与其互补的轻链(L)分离,这一特点有利于卫星的测序。
☆小卫星MinisatelliteDNA
又称可变数串联重复(Variablenumbertamdemrepeat,VNTR)
存在人类和其他动物中,由短重复单位(6-40bp)串联重复(6-100次以上)而成,而且有一起的核心序列。
在染色体配对进程中,串联重复序列能够错排,因此串联基因簇的大小多态性很强,个体间的转变专门大,可利用其取得DNA指纹图DNAfingerprinting)
多位于基因的非编码区,普遍散布。
VNTR多态性—分子标记—DNA指纹图(fingerprint).
DNA指纹技术,又称DNA分型技术。
该技术是在1985年由英国遗传学家AlecJeffreys应用它成功的进行了第一路移民案涉及的亲子鉴定,开辟了法医物证DNA分析的先河.最初,Jeffreys进行DNA分型采纳多位点DNA指纹技术.将人类基因组中的数量可变的串联重复序列(variablenumberoftandemrepeat.VNTR)周围的DNA区域用限制性内切酶切割.经电泳分离,然后再与特异性探针杂交产生高度多态性图谱即DNA指纹图,又称限
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