黄瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的诱导表达和活性测定.docx
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黄瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的诱导表达和活性测定.docx
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黄瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的诱导表达和活性测定
黄瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的诱导表达和活性测定
摘要
瓜类枯萎病又称萎蔫病,是黄瓜、冬瓜、节瓜、苦瓜、甜瓜、西瓜等主要瓜类的常见病害,引起瓜类枯萎病的病菌主要为尖镰孢菌,属半知菌亚门,其在不同的瓜类作物上表现出不同的专化型。
病原真菌侵染植物遇到的第一道防线是植物的细胞壁,针对细胞壁中的每一种多糖成分,植物病原真菌都有相应的降解酶对其进行降解,如果胶酶,纤维素酶,半纤维素酶等。
果胶酶是复合酶,根据底物的不同可以分成许多类,其中多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)是一类参与果胶降解的酶。
它能够随机地在不同部位水解切开非甲基化的果胶或多聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键而导致细胞壁降解及植物组织软化,原生质体死亡,是重要的致病因子。
瓜类枯萎病菌尖孢镰刀菌分泌的PG酶能够裂解胞间层果胶,引起瓜类维管束又内向为腐烂坏死。
同时,为其他细胞壁降解酶等致病因子的作用提供了条件,从而加速枯萎病病程的扩展。
在植物与病原菌长期相互作用的过程中,植物相应地产生了一些能够抑制病原菌PG活性的因子,其中以多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-inhibitingprotein,简称PGIP)为主,多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在阻止病原物的侵入、发展,进而激活特定的防卫反应方面具有独特的作用。
植物在受到许多生物或非生物因素胁迫时,PGIP将被诱导表达。
本文通过对黄瓜健康的瓜苗进行诱导,用还原糖法检测经三种诱导处理不同时间的黄瓜组织中PGIP对黄瓜枯萎病菌粗PG的抑制活性。
通过实验观察研究黄瓜PGIP在哪种条件因素下的诱导表达的抑制活性最好,及其对6种枯萎病菌PG活性的抑制作用以及它在不同温度下的抑制活性,从而了解PGIP诱导抗枯萎病的作用机制。
实验结果表明黄瓜PGIP经孢子诱导的比活力明显高于SA诱导和黑暗诱导,且在48h时表达量最高。
它对6种枯萎病菌PG活性均有较好的抑制作用,且在15℃、30℃、45℃、60℃、75℃、90℃的不同温度下,黄瓜PGIP的抑制活性也不同,其中在30℃时,抑制活性最高。
关键词:
PGIPPG诱导抑制黄瓜
TheInhibitoryActivityDetectionofThePGIPofTheCucumbers
Abstract:
MelonsblightisalsocalledFusariumWilt,itisthemaincommondiseaseofthecucumbers、thewhitegourds、thezucchinis、thebittergourds、themuskmelonsandthewatermelons.TheFusariumoxsporumSchlechtismaingermstocausetheMelonsblight,itbelongstotheDeuteromycotina,anditexpressesthedifferentspecializedformindifferentmeloncrops.Plantpathogenicfungusinfectionmetthefirstlineofdefenseisplantcellwalls,ithascorrespondingtothedegradationoftheenzymedegradationforeachofthecellwallpolysaccharidecomposition,forexample,thepectinous,thecelluloseenzymeandsoon.Pectinousisthecompositeenzyme,itcanbedividedintomanyclassesaccordingtothedifferentsubstrate,andmorethanhalfofclusteringlactoseisakindofhyaluronicacidenzymesinthedegradationofpectinenzymes.Itcancutpectinoralphaacidhalflactose1,4-glycosidicbondrandomlyindifferentpartsofthehydrolysisofmethylation,whichwillleadtothecell-walldegradationandtheplanttissuesoften,thenitcasetheprotoplast'sdeath,itisanimportantpathogenicfactor.MelonsfusariumoxysporiumpointedbacteriasecretethePGsporessicklecelllayerbetweentheenzymetocrackingpectin,causemelonsvascularbundlesandintrovertedfordecaynecrosis.Inthemeanwhile,itprovidesaconditionforothercell-walldegradationofenzymesinthepathogenicfactorfunction,andthusspeedinguptheexpansionofthecourseofblight.
Duringthelong-termprocessofthepathogenicbacteriainteractwiththeplants,theplantsaccordinglyproducesomecaninhibittheactivityofpathogenicbacteriaPGfactor,mostofthemisthePGIP.Whentheplantsarestressedbymanybiologicalorthebiologicalfactors,thePGIPwillbeinductionexpression.PGIPhasanuniqueroleinpreventtingpathogenstoinspectanddevelopandactivatingtheSpecificdefensereactions.Thisexperimentistoinfectthehealthseedlingsofthecucumbers、thewhitegourds、thezucchinis、thebittergourds、themuskmelons、thewatermelonsandthebananastosicken,anduseReducingsugarreleasetodetectthereducingbythreedifferentprocessingtimeofinductioncucumberorganizationofcucumberPGIPfusariumoxysporiumthickPGinhibitoryactivity.AndthenstudytheinductionofPGIPfactorswillexpressthebestinhibitoryactivityinwhichconditions,anditsinhibitoryactioninsixkindsofthePGoftheFusariumWiltandtheirinhibitoryactivityindifferenttemperature.ThenwecanunderstandthemechanismofactionofthePGIPinducetheresistanceofFusariumwilt.TheexperimentmakesclearthatthecucumberPGIPinducedbythesporesisvigorsignificantlyhigherthanSAinductionanddarkinduction,andithasagoodinhibitoryactioninsixkindsofthePGoftheFusariumWilt,itexpressesthehighestin48h.Anditsinhibitoryactionisdifferentinthedifferenttemperaturesof15℃、30℃、45℃、60℃、75℃and90℃.Whenitisinthe30℃,itcanreachthehighestinhibitoryaction.
Keywords:
PGIPPGInductionInhibitoryCucumber
1前言
1.1瓜类枯萎病研究概况
1.1.1瓜类枯萎病的分布与危害
瓜类枯萎病(病原FusariumoxysporumSchl.f.sp.cucumerium)又称蔓割病、萎凋病,是一种世界性的瓜类土传病害[1]。
1894年Smith首次报道西瓜枯萎病。
1925年,Weber首次报道黄瓜枯萎病在美国佛罗里达州发生。
我国对瓜类枯萎病的研究稍晚,1966年戚佩坤报道吉林省发生黄瓜枯萎病。
近几年,瓜类枯萎病几乎在全国各地都有发生。
吉林、辽宁、山东、湖北、北京等18个省市许多地区发生严重[2,3]。
常年损失以病株率计算为10%~30%,严重的甚至绝产。
1.1.2病原菌的基础研究
目前,瓜类枯萎病菌报道有8个专化型,即黄瓜专化型、西瓜专化型、甜瓜专化型、丝瓜专化型、葫芦专化型、苦瓜专化型、冬瓜专化和瓜类专化型[4]。
各专化型的菌株存在着明显的生理小种分化现象,目前西瓜共有3个生理小种[5],即生理小种0、生理小种1和生理小种2,生理小种2更具侵染性。
1963年Crall首次报道罗里达州存在2个西瓜枯萎病生理小种[6]。
意大利的Cirulli(1972)把西瓜枯萎病菌划分为生理小种0和1。
Netzer(1976)描述了以色列的一个高度致病的小种,它能引起所有已知抗病品种严重萎蔫,被定为2号小种[7]。
在我国上海、陕西等地报道有1号、2号和3号小种存在[8,9]。
1978年Armstrong等提出甜瓜专化型有8个生理小种;黄瓜枯萎病生理小种至今已鉴定出个。
枯萎病菌——尖孢镰菌以菌丝、厚垣孢子在土壤或未腐熟的带菌肥料中越冬,一般分布在0-25cm土层内,是翌年发病的初侵染源;种子也可带菌,但带菌率很低。
在无寄主情况下,病菌仍可在土中存活6年以上,有时可在土壤中存活16年[10],厚垣孢子和菌核通过牲畜消化道后仍有生活力。
1.1.3瓜类枯萎病菌致病机理
对于枯萎病菌的致病机理,有机械堵塞和毒素作用两种观点[11~15]。
Dimond(1962)认为病菌只定殖于受侵植株的维管束系统,几乎全在木质部导管内直至病害晚期。
西村(1956)认为侵入导管内的病菌堵塞自身导管,从而机械地阻碍水分的流动;病菌扩展到导管周围的薄壁组织,果胶分解酶活跃,破坏细胞膜中间层,分散在导管内的侵填体、果胶以及橡胶状物质亦阻塞导管,妨碍水分上升。
王纯利(2000)测定了28个采自新疆的菌株,镰刀菌酸活性与致病力存在显著相关性,但产量极不稳定,且与致病力强弱无关[16]。
马国斌等(2000)研究认为,镰刀菌酸的致萎作用主要破坏了根系的膜系统,造成代谢紊乱,根系防卫机能丧失,活力下降,使地上部缺水萎蔫,而不是导管被堵塞造成的[17]。
说明镰刀菌毒素很可能是造成植株萎蔫死亡的原因之一。
综合分析可以看出,枯萎病的致病机理不是简单的某一个因素的作用,而是多种因素的共同结果。
1.1.4瓜类枯萎病的防治
瓜类枯萎病菌的厚垣抱子在土壤中可存活10年以上,在离开寄主的情况下也能存活5-8年。
在长期种植感病植物的情况下病原菌大量积累,重病田连续种植非寄主作物辣椒、茄子、玉米、大豆等能使病原菌数量下降。
病原菌主要存在于瓜类作物根表及根围土壤中,从根尖或根部伤口处侵入植株,可与土壤中的根结线虫发生复合侵染,加重病害的发生程度。
由于瓜类枯萎病的上述特性,为该病的防治造成了很大的困难。
目前各类防治措施对瓜类枯萎病都有局限性,采用单一的防治方法控制枯萎病比较困难,所以应因地制宜,采取综合防治措施。
1.1.4.1选育抗病品种
选用抗病品种是防治枯萎病的有效途径。
早在19世纪末,美国育种学家Orton开始西瓜抗病育种研究,并于1911年培育出等一个抗病品种Conqueror。
近年来培育出的甜瓜抗枯萎病品种有美国UoCPmR4和法国M17-18等[18];野生西瓜材料P12934是国际上公认的唯一一份抗西瓜枯萎病三个生理小种的抗原。
高抗西瓜枯萎病的品种有美国SummitCharlestonGray等品种和我国的西农8号,京抗小红,京抗二、三号等,黄瓜抗枯萎病品种国内有长春密刺、津研6号、7号等[18]。
这些抗瓜类枯萎病品种在生产上起到了一定的防病效果。
但抗病育种受很多因素制约,如周期长、抗病品种资源稀少,病原菌有多种专化型,且不稳定,抗病性为多基因控制,遗传规律较复杂等,因此难以满足生产上的需要。
1.1.4.2轮作
轮作是防治瓜类枯萎病一项重要措施。
轮作可使病害减轻,特别是与禾本科、豆科作物如玉米、大豆等轮作效果更好。
美国普遍采用抗病品种辅以短期轮作,对西瓜小种0和1极其有效。
在日本枥木县报道与百合科的大葱、大蒜,十字花科的甘蓝等轮作或混植对该病发生具有较好的控制作用,在瓜类连年种植的情况下,枯萎病也不发生。
1.1.4.3加强栽培管理
土壤深翻换土是一项有效的农业措施,结合地膜覆盖几乎完全控制了病害的发生。
施有机肥和饼肥比施无机化肥发病轻,中氮中磷及低钾不利病害的发展。
另外采用起垄栽培浅水沟灌发病较轻。
施足腐熟的有机肥,定植后要合理浇水,促使植株根系发育,增强抗病力。
结瓜后及时追肥,以防早衰。
1.1.4.4改良土壤理化性质
由于镰刀菌适宜弱酸环境,酸性土利于发病。
可施石灰改变土壤酸碱性,降低枯萎病发生率。
日光暴晒和土壤熏蒸也可对枯萎病产生一定防效。
Martyn等(1986)报道,日光暴晒30~60天可延缓枯萎病发生。
日光暴晒可显著减少上层10cm土壤中的枯萎病菌含量[19]。
日本、以色列等国利用太阳能加热土壤杀灭病菌,并结合增施有机物的综合防治方法很快得到推广[20]。
用威百亩熏蒸土壤可以阻碍枯萎病的发生,西瓜产量为处理对照的3倍[21]。
Ioannou等(2000)报道,铵肥熏蒸可提高日光暴晒的效果,日光暴晒配施硫酸铵或者磷酸二氢铵防治效果最佳,获得的产量是单纯采用日光暴晒的2倍[22]。
1.1.4.5嫁接防治
嫁接是防治西瓜枯萎病的有效方法。
常用的嫁接方法有切接、顶插接、靠接等,以切断胚轴扦插法为好。
采用瓠瓜、葫芦、南瓜、冬瓜等抗病力强的瓜类作砧木,均能达到防病的目的。
本研究室研究表明,瓠瓜抗性强,大多数品种对枯萎病免疫,用瓠瓜作砧木,获得的西瓜产量是连作地区西瓜的8.7倍,是间作地区的1.7倍(未发表资料)。
用葫芦作砧木,不论是干性或湿性土壤都有很高的防治效果,防效可达98%~100%。
砧木对西瓜的品质有不同程度的影响。
一般认为葫芦砧不影响果实的甜度、质地、色泽和风味,而南瓜砧则表现为果皮增厚和瓜瓤较硬,品质有下降的趋势。
嫁接优良砧木品种有中国农业科学院郑州果树研究所郑高飞选育的超丰1号葫芦、台湾农友公司的野生西瓜勇士以及日本的一些南瓜和葫芦型砧木。
1.1.4.6生物技术防治
目前,生物防治西瓜枯萎病越来越受到重视,主要采用拮抗微生物降低病原菌的密度或削弱病原菌的致病力从而达到控制病害的目的[23~24]。
其防治机理主要包括产生嗜铁素抑制病原菌的增殖、与病原菌之间的位点及营养竞争、诱导寄主产生抗性及交叉保护作用。
Park等从健康黄瓜根中分离非致病性Fusariumoxysporum菌株C5和C4,当和Pseudomonasputida一起加入土壤时,可以有效的抑制黄瓜枯萎病菌在根围或根表的定殖。
生防真菌研究较多的有Trichodermaharzianum、T.viride及Gliocladiumvirens等,作用机理主要是竞争、抗生及寄生作用。
P.fluorencens、P.putida、Serratiamarcescens和Arthrobatersp.是比较好的生防细菌,能很好地定殖在作物根际,通过产生荧光嗜铁素或几丁质裂解酶等细胞壁降解酶阻碍病原菌在寄主体内的增殖和扩展。
国内在无致病性或弱致病性菌株筛选方面有研究报道[25],由黄瓜枯萎病菌经紫外线诱变获得的突变体对黄瓜没有致病性,但对甜瓜和西瓜却有一定的侵染力。
研究发现突变体的非致病性并不稳定,经多次离体继代培养和在灭菌土壤中保存一段时间以及在活体植株上反复侵染,不同程度地恢复了致病性,所以应用突变体防治黄瓜枯萎病时要注意其对近缘作物的安全性,并不时对其稳定性进行监测。
绿色木霉作为重要的植物病害生防菌已引起人们的普遍关注,Yedidia等证实了哈茨木霉菌株T203穿透黄瓜根部产生了诱导抗性[26]。
庄敬华等(2005)证实,黄瓜幼苗经木霉菌处理后,病情指数由33.69分别降至13.12和10.28,黄瓜体内与抗性反应相关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及过氧化氢酶(CAT)活性有明显增加,分别为对照的2.75,2.49,2.42及15.84倍[27]。
生物杀菌剂农抗120对镰刀菌孢子形成和菌丝生长具有一定的抑制作用,可提高西瓜幼苗抗病菌毒素的能力[28]。
随着分子生物学及分子遗传学的逐步深入,利用细菌工程和基因工程技术进行生防微生物的遗传改良,构建新型高效生防菌。
Maurhofe将融合质粒pME3090导入P.fluorencensCHAO获得融合菌株,大大提高了对黄瓜枯萎病的生防能力[29];ChenWen-shaw等利用花粉管基因转导技术获得10株抗西瓜枯萎病植株。
通过转基因技术获得西瓜抗枯萎病品种是对常规育种技术的突破,在西瓜枯萎病防治领域可发挥独特作用。
1.1.4.7化学防治
利用化学农药防治瓜类枯萎病,主要是用多菌灵或高锰酸钾溶液浸种处理,用多菌灵进行苗床消毒和利用棉隆等进行土壤熏蒸处理等预防措施。
在发病初期用多菌灵或甲基托布津、绿亨一号等药剂喷洒发病植株或灌根,可以起到一定的防治效果,其中绿亨一号对西瓜和黄瓜枯萎病田间防效达80%以上,同时具有增产作用。
对孢子萌发抑制效果较好的有多菌灵、双效灵、农抗120、代森锰锌、苯来特、甲基托布津、菌毒清等,对菌丝生长抑制较好的有菌毒清、多菌灵、苯来特、甲基托布津等。
用化学药剂如敌克松等进行土壤消毒,效果也较好。
但是化学防治由于缺乏高效、低毒、无环境污染的杀菌剂,易造成农药残留,对人畜有伤害,而且由于枯萎病为土传病害,难以实行大面积的土壤药剂处理。
综上所述,由于目前各类防治措施对瓜类枯萎病都有其局限性,采用一种方法控制枯萎病比较困难,所以应因地制宜,采取综合防治的方法。
1.2植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的研究概况
植物细胞壁富含多糖,是抵抗病毒、细菌、真菌、线虫及昆虫等病原物侵染的第一道屏障。
植物病原物在侵染植物的过程中,首先必须分泌一系列能够降解细胞壁多糖的酶来破坏细胞壁结构,进而才能阻止病原物的侵入和发展;同时,PGIP可促进植物体内寡聚半乳糖醛酸的积累,从而激活特定的防卫反应,最终抑制相应病害的发生。
自从1971年Albersheim和Anderson在蚕豆和西红柿的细胞壁中首次发现PGIP以来[29],至今已在20多个属的多种植物中发现这类蛋白质[30-37]。
目前,PGIP基因是植物防卫反应研究的重点之一,由于研究多是针对植物真菌病害进行的,因而PGIP基因也是植物抗真菌基因工程的研究热点之一。
病原物分泌的PG是具有多种形式的同工酶,可能是为了适应不同的生存条件和不同的寄主,它们的一级结构、稳定性、特殊活性、最适pH值、作用方式、底物偏爱性等都不相同,释放出的低聚糖的类型也不相同[38]296。
在病原物与寄主相互作用的进化过程中,植物也进化出了不同的PGIP,可以特异性地识别出真菌释放的不同的PG,限制致病真菌的生长,同时引发植物的防卫反应。
例如,在韭葱(AlliumporrumL.)中就发现了18种PGIP[39]。
PGIP还是特异性的抑制剂,随着不同病原物分泌出的PG的不同,PGIP也就具有不同的抑制强度[40]1212。
梨的PGIP只抑制梨致病真菌分泌的PG,对由Aspergillusnige和Fusariumoxysporum分泌的PG则不进行抑制[41],这更加证实了不同的PGIP能够特异性地识别不同的PG。
1.3论文研究目的与意义
瓜类枯萎病是瓜类生产上的一种重要病害,严重影响瓜类作物的生产。
PG是瓜类枯萎病菌侵染瓜类的重要致病因子。
通过对健康瓜类幼苗进行诱导,分析PGIP的表达规律,了解黄瓜的PGIP对6种枯萎病菌PG酶活性的抑制作用及其在不同温度下抑制作用的规律,从而找出最适宜的抑制温度。
为PGIP诱导抗枯萎病的作用机制研究提供必要的基础理论依据。
对防治瓜类枯萎病具有重大的意义。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1试验材料
供试黄瓜(CucurbitaceaecucumisL.)的品种为“粤秀二号”,购于广东省农科院蔬菜所。
2.1.2供试菌株
黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum),甜瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.melonis),苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.momordicae),冬瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.benincasae),节瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.chieh-qua),香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4,Foc4),均为本实验室保存菌株。
2.1.3主要试剂
柑橘果胶、SA、二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrr-olidone,PVPP)、D-半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸、2-氰乙酰胺为Sigma原装进口,琼脂粉、KH2PO4、KNO3、KCl、MgSO4·7H20等其它试剂均为国产分析纯。
2.1.4主要仪器
高速组织捣碎机(美国斯伯明);
电子分析天平(上海天平仪器厂);
ML-902定时恒温磁力搅拌器(上海浦江分析仪器厂);
数显恒温水浴
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