染色体步移步骤.docx
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染色体步移步骤.docx
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染色体步移步骤
染色体步移技术〔GenomeWalking〕是一种重要的分子生物学研究技术,使用这种技术可以有效获取与序列相邻的未知序列。
染色体步移技术主要有以下几方面的应用:
1.根据的基因或分子标记连续步移,获取人、动物和植物的重要调控基因,可以用于研究构造基因的表达调控。
如别离克隆启动子并对其功能进展研究;
2.步查获取新物种中基因的非保守区域,从而获得完整的基因序列;
3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点,鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等;
4.用于染色体测序工作中的空隙填补,获得完整的基因组序列;
5.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。
其主要原理是根据
DNA序列,分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物〔SP Primer〕,与退火温度较低的兼并引物,进展热不对称PCR反响。
现在有很多GenomeWalkingKit,相应的说明书都介绍的很详尽,下面给你发一个原理图:
大致的原理是这样的,依据TaKaRa的试剂盒,具体的操作步骤如下:
1.基因组DNA的获取。
基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。
建议不要使用只经过简单处理的基因
组DNA〔例如:
只进展细胞热处理或蛋白酶处理〕作为模板,而要使用经过充分纯化的完整的基因组
DNA。
此外,由于本方法灵敏度极高,模板DNA一定不要污染,所需的DNA量不要少于3μg。
2.序列的验证。
在进展PCR实验之前必须对序列进展验证,以确认序列的正确性。
具体方法为:
根据序
列设计特异性引物〔扩增长度最好不少于500bp〕,对模板进展PCR扩增,然后对PCR产物进展测
序,再与参考序列比拟确认序列的正确性。
3.特异性引物的设计。
根据验证的序列,按照前述的特异性引物设计原那么设计三条特异性引物,即:
SP1、SP2、SP3。
4.1stPCR反响。
基因组DNA经OD测定准确定量后,取适量作为模板〔不同物种的最正确反响DNA量并不一样,实际
用量参考下面的注*1〕,以AP Primer〔四种中的任意一种,以下以AP1 Primer为例〕作为上游引
物,SP1Primer为下游引物,进展1stPCR反响。
① 按以下组份配制1stPCR反响液。
Template〔基因组DNA〕 x ng*1
dNTPMixture〔2.5mΜeach〕 8 μl
10×LAPCRBufferII〔Mg2+ plus〕 5 μl
TaKaRaLATaq®〔5U/μl〕 0.5 μl
AP1Primer〔100pmol/μl〕 1 μl
SP1Primer〔10pmol/μl〕 1 μl
dH2O upto50 μl
② 1stPCR反响条件如下:
94℃ 1min
98℃ 1min
94℃ 30sec
60~68℃*21min 5Cycles
72℃ 2~4min*3
94℃ 30sec; 25℃ 3min; 72℃ 2~4min*3
94℃ 30sec; 60~68℃*2 1min; 72℃ 2~4min*3
94℃ 30sec; 60~68℃*2 1min; 72℃ 2~4min*3 15Cycles
94℃ 30sec; 44℃ 1min; 72℃ 2~4min*3
72℃ 10min
5.2ndPCR反响。
将1stPCR反响液稀释1~1000倍后,取1 μl作为2ndPCR反响的模板,以AP1Primer为上游引
物,SP2Primer为下游引物,进展2nd
PCR反响。
①按以下组份配制2ndPCR反响液。
Template〔1stPCR反响液〕 1 μl*4
dNTPMixture〔2.5mΜeach) 8 μl
10×LAPCRBufferII〔Mg2+ plus〕 5 μl
TaKaRaLATaq®〔5U/μl〕 0.5 μl
AP1Primer〔100pmol/μl〕 1 μl
SP2Primer〔10pmol/μl〕 1 μl
dH2O upto50 μl
② 2ndPCR反响条件如下:
94℃ 30sec; 60~68℃ 1min*2; 72℃ 2~4min*3
94℃ 30sec; 60~68℃ 1min*2; 72℃ 2~4min*3 15Cycles
94℃ 30sec; 44℃ 1min ; 72℃ 2~4min*3
72℃ 10min
6.3rdPCR反响。
将2ndPCR反响液稀释1~1000倍后,取1 μl作为3rdPCR反响的模板,以AP1Primer为上游引
物,SP3Primer为下游引物,进展3rd
PCR反响。
①按以下组份配制3rdPCR反响液。
Template〔2ndPCR反响液〕 1 μl*4
dNTPMixture〔2.5mΜeach) 8 μl
10×LAPCRBufferII〔Mg2+plus〕 5 μl
TaKaRaLATaq®〔5U/μl〕 0.5 μl
AP1Primer〔100pmol/μl〕 1 μl
SP3Primer〔10pmol/μl〕 1 μl
dH2O upto50 μl
② 3rdPCR反响条件如下:
94℃ 30sec; 60~68℃*2 1min; 72℃ 2~4min*3
94℃ 30sec; 60~68℃*2 1min; 72℃ 2~4min*3 15Cycles
94℃ 30sec; 44℃ 1min; 72℃ 2~4min*3
72℃ 10min
7.取1st,2nd,3rd
PCR反响液各5μl,使用1%的琼脂糖凝胶进展电泳。
8.切胶回收清晰的电泳条带,以SP3Primer为引物对PCR产物进展DNA测序。
染色体步移的考前须知
CTAB提取DNA
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