胃肠道间质瘤的ckit基因突变检测.docx

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胃肠道间质瘤的ckit基因突变检测

胃肠道间质瘤的ckit基因突变检测

作者：

杨锋丁宝国杨堂斗贺慧颖钟镐镐李燕郑杰吴秉铨

　　【摘要】目的探讨CD117阳性的胃肠道间质肿瘤ckit基因突变分布及类型。

方法采用免疫组化技术，对10例GIST标本行CD117、CD34、SMA和S100检测，以确诊为GIST；采用PCR技术对CD117阳性的GIST进行ckit基因突变检测；采用直接测序方法对突变ckit基因11、9、13和17号的外显子突变进行序列分析。

结果4例成功提取了肿瘤DNA，其中3例检出了ckit基因突变，均分布于第11号外显子，均为557～558的缺失性突变；其中2例为纯合子性突变，1例为杂合子性突变。

结论CD117阳性的GIST通常有ckit基因突变，其11号外显子是经典分布热点，变异纯合子和杂合子突变为常见类型。

【关键词】胃肠道间质肿瘤；DNA突变分析；ckit基因

　　［ABSTRACT］ObjectiveToexplorethelocusandtypesofckit（CD117）mutationsingastrointestinalstromaltumors（GIST）.MethodsSpecimensof10GISTcasesweredetectedimmunohistologicallyforCD117,CD34,SMAandS100toconfirmthediagnosisofGIST.ForCD117positiveGIST,themutationofckitwasdetectedbyPCR,anditsexons11,9,13and17analyzedbydirectsequencingwassuccessfullyisolatedinfourcases,inwhich,mutationofckitwasfoundinthreecases,allthegenesdetectedwereatckitexon11withcodon557-558（WK）,homozygousmutationbeingnotedintwocasesandheterozygousinisusuallyckitgenemutationsinCD117positiveGIST,theexon11beingclassic“hotspot”ofthemutations.Thehomozygousandheterozygousaretheircommontypes.

［KEYWORDS］Gastrointestinalstromaltumor;DNAmutationaanalysis;ckitgene

胃肠道间质瘤是近年来被认识并命名的新实体瘤，CD117是其特异性敏感标志物[1]。

GIST具有ckit基因的11号外显子突变，从而导致酪氨酸激酶持续激活[2]。

GIST对酪氨酸激酶抑制剂Gleevec治疗敏感[3]。

基因诊断和分型为临床深入认识该病提供了重要前提[4]。

探讨了GISTckit基因突变分布及类型，现报告如下。

　　1材料和方法

　　标本及其来源

收集胶南市人民医院外科收治的10例临床病理诊断为GIST的肿瘤石蜡包埋组织标本，其中男6例，女4例，年龄31～72岁。

根据临床病理组织学形态特征将GIST分为：

梭形细胞型4例，上皮样细胞型3例和两者混合型3例。

肿瘤直径5cm、核分裂象>5/50HPF或肿瘤直径>10cm或核分裂象>10/50HPF3例。

　　免疫组化方法

将40g/L甲醛溶液固定、石蜡包埋的组织制成4μm连续切片，以CD117（A4502，1∶200）、CD34（M7165，1∶50）、SMA（M851，1∶100）、S100（Z231，1∶200）进行免疫组化标记。

CD117免疫标记采用Envision两步法；余者均采用SP三步法[5]。

CD117阳性细胞胞膜呈棕黄色；S100阳性细胞胞核和胞质呈棕黄色；CD34、SMA阳性细胞胞质呈棕黄色。

　　ckit基因突变检测分析

用QiagenDNA试剂盒提取石蜡包埋组织的DNA，行PCR扩增。

所有病例均首先进行ckit第11号外显子的扩增检测，发现有突变者，不再进行其他突变检测；对11号外显子突变无阳性发现者，再进行ckit9号外显子的扩增检测；无ckit9号外显子突变者，再进行13号和17号外显子的扩增。

所用引物序列、退火温度和PCR产物片段大小见表1。

表1PCR扩增引物序列、退火温度和产物片段外显子编号引物序列

PCR反应条件为：

95℃变性2min；94℃40s，退火40s，72℃35s，循环30～35次；最后72℃延伸5min。

以双蒸水代替模板作为阴性对照。

PCR产物北京华大中生生物科技发展公司纯化并测序。

有突变的病例再行反向测序证实，并与NCBI基因库ckit基因序列进行比对。

　2结果

经免疫组化检测CD117、CD34、SMA和S100，确认10例为CD117阳性GIST病例。

10例石蜡标本中仅4例成功提取了DNA，并进行了PCR扩增和测序。

按细胞类型分为上皮样细胞2例，梭形细胞1例，混合型1例。

按侵袭危险性分为高度危险性3例，其核分裂象（8～15）/50HPF；中度危险性1例，其核分裂象（1～2）/50HPF。

该4例中，有3例检出了ckit基因第11号外显子缺失突变，均为累及557～558的缺失性突变。

其中1例CD117、CD34，第11号外显子缺失突变，缺失片段为TGGAAGG，为杂合子性缺失突变；1例CD117、CD34，第11号外显子缺失突变；1例CD117、CD34，第11号外显子缺失突变。

后两者均为纯合子性缺失突变。

1例CD117、CD34，未检测到11、9、13、17号外显子的突变，属野生型序列。

其余6例，经反复提取DNA和检测，均失败。

　　3讨论

本组10例GIST的组织病理学研究显示，GIST肿瘤细胞主要有3种类型：

梭形细胞型、上皮样细胞型和梭形细胞与上皮样细胞混合型，但主要以梭形细胞型为常见。

组织学检查表明，GIST肿瘤细胞的核分裂象数目差异很大，而且与肿瘤的大小不相关。

光镜高倍视野下GIST肿瘤细胞核分裂象数目与肿瘤大小，均为FLETCHER等[6]对GIST侵袭危险度分级的主要指标，在评估病人预后上有重要意义。

研究结果进一步表明，免疫组织化学几项检测指标，特别是CD117和CD34对GIST的诊断是必需的。

95％以上GIST表达CD117阳性，70％左右表达CD34阳性。

因此，CD117和CD34是GIST病理诊断和鉴别诊断的关键性免疫形态学指标。

GIST从组织学上，被认为胃肠道间质中的Cajal细胞和其前身细胞[7]，这两种细胞都显示CD117和CD34阳性表达；SMA和S100则是用于鉴别平滑肌和神经源性肿瘤的免疫学指标。

本研究对10例GIST组织进行ckit基因突变检测分析，目的是揭示肿瘤赖以发生的突变基因靶点，寻找在基因水平上的序列异常改变，帮助临床选择恰当治疗方案。

但是，其中6例检测失败。

分析失败原因，主要是组织标本处理不规范，造成无法有效提取组织DNA。

因此，规范GIST的组织处理过程，是必须首先解决的问题。

本组GIST中有3例为ckit基因突变肿瘤，突变位点均位于11号外显子，并表现为纯合子缺失突变和杂合子缺失突变两种类型。

ckit基因是一种原癌基因，它的配体是细胞因子，ckit基因被激活后会引起受体的二聚体，并促进酪氨酸磷酸化，启动细胞内的信号传导，产生一系列增殖、分化、凋亡的调节功能。

ckit基因11号外显子是酪氨酸激酶抑制剂的靶向位点，因此是Gleevec药物作用的敏感位点。

按基因分类诊断，是推荐选择Gleevec靶向治疗药物的适宜对象。

而另1例病人的基因突变检测未发现ckit基因9、11、13、17号外显子突变，基因类型为野生型。

同时，根据其肿瘤大小和核分裂象分级，属高侵袭危险性GIST者，免疫组织化学检测其CD117和CD34均为阳性，属对靶向治疗药物Gleevec不敏感的GIST肿瘤病人。

因此，基因诊断分型是GIST的重要临床指标，为临床治疗提供依据，有重要意义。