RTPCR详细图文解析.docx

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RTPCR详细图文解析

一、实时荧光定量PCR原理

（一）定义：

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理

1、常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

3、如何对起始模板定量？

 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.

4、几个概念：

（1）扩增曲线：

（2）荧光阈值：

（3）Ct值：

CT值的重现性：

5、定量原理：

理想的PCR反应：

  X=X0*2n

非理想的PCR反应：

 X=X0（1+Ex）n

     n：

扩增反应的循环次数

     X：

第n次循环后的产物量

     X0：

初始模板量

     Ex：

扩增效率

5、标准曲线

6、绝对定量

1）确定未知样品的C（t）值

2）通过标准曲线由未知样品的C（t）值推算出其初始量

7、DNA的荧光标记：

二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍

方法一：

SYBRGreen法

（一）工作原理

1、SYBRGreen 能结合到双链DNA的小沟部位

 2、SYBRGreen 只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光

4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:

 1、SYBRGreen使用浓度:

太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测

 　　2、Primer：

引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准

 　　3、MgCl2的浓度:

可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物

　　4、反应Buffer体系的优化

　　5、反应温度和时间参数:

由酶和引物决定

　　 6、其他与常规PCR相同

（二）应用范围

1、起始模板的测定；

　　2、基因型的分析；

　　3、融解曲线分析：

可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

（三）优点及缺点

优点：

对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。

 缺点：

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；  对引物特异性要求较高。

方法二：

TaqMan---水解型杂交探针

 **5′端标记有报告基团（Reporter,R） ，如FAM、VIC等 

　　**3′端标记有荧光淬灭基团（Quencher,Q）

　　**探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

　　**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

（一）工作原理

注意：

每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光

PCR反应的建立：

1、引物、探针的设计：

 探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，

　　引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃

2、反应参数的确定：

一般为：

94℃，10-20S

　　 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）

　　 也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，

3、优化引物和探针浓度：

获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 

　　引物浓度：

50-900nM

　　 探针浓度：

50-250nM

4、其他与常规PCR相同

（二）优缺点

优点：

　　对目标序列的高特异性

      　　 ------阴性结果确定

　　设计相对简单

      　　------与目标序列某一区域互补

　　重复性比较好

缺点：

　　只适合一个特定的目标;

　　委托公司标记，价格较高;

　　不易找到本底低的探针