荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制00002.docx
- 文档编号:687099
- 上传时间:2022-10-12
- 格式:DOCX
- 页数:5
- 大小:432.66KB
荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制00002.docx
《荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制00002.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制00002.docx(5页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制00002
荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制
LT
粒DNA,也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物,当然也可以是基因组DNA,甚至cDNA,但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3.标准品的制备
一般一条标准曲线取四到五个点,浓度范围要能覆盖样品的浓度区间,以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次,对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
倍比梯度稀释方法:
1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液,得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii
1v标准品iii+9v稀释缓冲液,得标准品iv
1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v
依次倍比稀释
拷贝数的计算:
详见核酸拷贝数的计算
4.实例
标准品的制作:
将标准品依次进行10倍稀释,ASP-3700测得其拷贝数1.55×108copy/ul
标准曲线的绘制(1cycle=1min)
设置对照:
浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个,设空白对照
PCR反应:
以不同浓度标准品作为模板
标准品的扩增曲线
标准品的溶解曲线
标准品的标准曲线图
X
Log 7
6
5
4
3
2
1
Y
CT值 12.01
14.89
17.92
21.18
24.56
27.89
31.25
扩增效率(E)计算
E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04,E%=(2.04-1)×100%=104%
若未知样本的CT值为19.11,将CT值代入线性方程:
即19.11=34.29-3.23X,所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7
Quantityunknow=104.7=50118copies
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 荧光 定量 PCR 绝对 定量分析 标准 曲线 绘制 00002
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)