HPLC法检测丹参素钠.docx
- 文档编号:6867470
- 上传时间:2023-01-11
- 格式:DOCX
- 页数:16
- 大小:181.08KB
HPLC法检测丹参素钠.docx
《HPLC法检测丹参素钠.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《HPLC法检测丹参素钠.docx(16页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
HPLC法检测丹参素钠
目录
摘要……………………………………………………………………3
第一部分前言………………………………………………………4
第二部分实验部分………………………………………………7
致谢……………………………………………………………………20
中文摘要
目的:
本文建立HPLC法测定丹参素提取物中的丹参素的含量测定的分析方法。
方法:
对HPLC法的检测条件进行了优化,对HPLC法的稳定性、精密度、重复性、线性范围考察、回收率等进行了方法学研究。
结果:
确定了最佳分析条件为采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱温为35℃,进样量为20μL,流速为1ml/min,以甲醇-水-醋酸(12:
87:
1)为流动相,检测波长为281nm;。
在选定的检测条件能够很好的使丹参素峰与其它杂质峰有效的分离,具有专属性;在5小时内配制的溶液稳定能够满足测试要求,RSD小于1%;仪器具有良好的精密度,RSD小于1%;测定样品有很好的重复性;回归方程为:
Y=14989X-8.6234,r=1,表明丹参素钠在0.02055~0.411mg/mL之间线性关系良好;平均回收率:
99.44RSD%=0.80,具有良好的准确度。
HPLC法用做本品的质量控制方法,具有简便、快速、结果准确等优点。
关键词:
HPLC、丹参素、色谱条件
EnglishAbstract
Objective:
ToestablishedanHPLCmethodfordeterminationofdancensucontainedindancenextract.Method:
TooptimizethedetectableconditionofHPLCanddothemethodologyresearchofstability,precision,repeatability,thereviewoflinearityrange,recovery,andsoon.Result:
ThebestassayconditionisusingODSC18column,methanol:
water:
aceticacid(12:
87:
1)asmobilephase,withdetectionat281nm,temperatureofcolumnis35℃,rateflowis1.00ml/min..ItcancommendablyseparatetheDancensupeakfromotherpeaks,soithasverygoodspecialization.Thestabilityofthesolutionwhichconfectedin5hourcanfilltestrequest,RSD<1%.Theapparatushaveverygoodprecision,RSD<1%.Thedetectedsamplehasverygoodrepeatability.Theregressionequation:
Y=14989X-8.6234,r=1,itshowthatthelinearitywasobtainedovertherangof0.02055~0.411mg/mL,theaveragerecoreywas99.4,RSD=0.80;Thisestablishedmethodissimple,rapid,accurateandsuitableforthequalitycontrolofDancenextract.
Keywords:
HPLC,Dancensu,
第一部分前言
丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的根。
味苦,性微寒。
入心、肝经。
功能:
活血祛淤、凉血消痈、止痛、养血安神。
主治:
心绞痛、月经不调、痛经、经闭、血崩带下、癥瘕、积聚、淤血腹痛、骨节疼痛、惊悸不眠、恶疮肿毒。
【现代研究】
1.主要成分:
含脂溶性成分,如丹参酮(Tanshinone)Ⅰ、ⅡA、ⅡB,隐丹参酮(Cryptotanshi-none),异隐丹参酮(Isocryptotanshinone),羟基丹参酮(Hydroxytanshinone),降丹参酮(Nortanshi-none),异丹参酮(Isotanshinone)Ⅰ、Ⅱ,丹参新酮(Miltirone),左旋二氢丹参酮[(-)-Dihydrotan-shinone],丹参酸甲酯(Methyltanshinonate),丹参醇Ⅰ(TanshinolA),丹参醇Ⅱ(TanshinolB),丹参醇Ⅲ(TanshinolC),紫丹参甲素(PrzewatanshinquinoneA),紫丹参乙素(Prze-watanshinquinoneB),丹参醌(Tanshiquinone)A、B、C,亚甲基丹参醌(Methylenetanshinquinone)以及丹参酚(Salviol),丹参醛(Tanshialdehyde)等。
亦含水溶性成分,如丹参素(β-3',4'-二羟基苯基乳酸),丹参酸甲、乙、丙(DanshensuanA、B、C),原儿茶酸(Protocatechuicacid),原儿茶醛(Proto-catechuicaldehyde)。
从丹参制成的注射液中分离得到了黄芩甙(Baicalin)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、隐丹参酮、熊果酸(Ursolicacid)、胡萝卜甙(Daucosterol)、原儿茶醛、异阿魏酸(Isoferulicacid)、二氢丹参酮Ⅰ (DihydroisotanshinoneⅠ)。
2.提取工艺:
通过多种提取工艺的比较(传统水煎法、乙醇回流法、动态温浸法、超声波法、渗漉法等),以丹参素、原儿茶醛、丹参酮ⅡA为指标成分,采用高效液相法测定提取量。
结果,以丹参素和原儿茶醛指标成分的提取总量考虑,采用传统水煎法好;以丹参酮ⅡA的指标成分提取总量考虑,采用95%乙醇回流法好;以3个指标成分提取总量综合考虑,采用95%乙醇-50%乙醇-水提取法好[1]。
采用纸层析比色法测定不同乙醇浓度沉淀后丹参中有效成分之一—丹参素的含量,结果表明随着乙醇浓度的升高,丹参素的损失率增大。
以60%乙醇浓度沉淀后的提取率最佳。
随着沉淀用乙醇的增高,药液中丹参素的含量降低,即丹参素的损失率增大。
但乙醇浓度由80%提到85%,损失率变化不大[2]。
从而为在各种丹参制剂工艺中保证丹参素的回收率提供了实验依据。
采用薄层扫描法,以原儿茶醛为检测指标,考虑了不同醇沉浓度对原儿茶醛的影响。
实验结果表明,采用50%或60%醇沉浓度原儿苯醛损失较小[3]。
王志平[4]等经过D301树脂处理后,其出膏率较未经树脂处理的原提取液降低10倍;其固体膏中有效成分(丹参素和原儿茶醛)含量是未经树脂处理的8倍;经D301树脂处理的出膏率比经醇处理的出膏率低4倍;所得的固体膏中有效成分(丹参素和原儿茶醛)的含量高4倍;而其他种类树脂的出膏率及固体膏中有效成分的含量,则与D301树脂相差很大。
丹参水溶性有效成分的提取可采用D301树脂吸附,80%乙醇洗脱。
该提取分离工艺可替代传统的水提醇沉处理,降低出膏率,提高膏中有效成分的含量。
3药理作用
近年来,我国学者对丹参素的药理作用进行了许多研究,证明其具有多种药理活性。
3.1 对心肌的作用
丹参素具有缩小心肌梗塞范围和减轻病程的作用,同时对大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用[5、6]。
张力等报道丹参素为超氧阴离子(O-2)清除剂,从而推测其可保护心肌线粒体免受氧自由基引发的脂质过氧化物的损害。
常英姿等研究表明丹参素可防止鼠心肌线粒体H+ATP酶水解活性的下降,具有明显保护作用,并呈一定的浓度依赖关系和“饱和”效应。
苏晓华等研究表明丹参素对大鼠心肌线粒体ADP/O,RCR及细胞色素氧化酶具有保护作用,提示丹参素为良好的OH清除剂。
即丹参素具有对大鼠心肌线粒体膜的保护作用[7-9]
3.2抑制血小板聚集及抗凝作用
丹参素能明显抑制血小板的聚集性,而且在抑制血小板聚集剂量的丹参素作用下,血小板膜流动性明显增加,提示其治疗冠心病有效。
[10]它可提高红细胞的负电荷,使彼此不易聚集;降低全血粘度,抑制血小板聚集,激活纤溶酶系统;增加红细胞膜的机械强度,减少红细胞的破坏。
[11]大剂量丹参素及复方丹参都有增加血管脆性的作用,这可能与丹参素具有抗血小板聚集和促进纤维蛋白降解功能有关。
[12]它可提高机体抗凝和纤溶活性,并且具有明显的抗凝血及抑制体外血栓形成的作用。
[13、14]另外,它可以抑制血小板合成与释放TXA2等前列腺素类血管物质的能力[15]。
3.3降血脂及抗动脉粥样硬化作用
丹参素有抑制细胞内源性胆固醇(Ch)合成的作用,同时还具有抗脂蛋白氧化作用。
提示它具有降低血Ch,保护血管屏障,防止脂质沉积及动脉粥样硬化(AS)斑志形成的作用[16]。
另外,丹参素对牛主动脉平滑肌细胞氧化修饰LDL具有抑制作用[17]。
34 抗炎及增强机体免疫作用
丹参素能够显著抑制大鼠腹腔巨噬细胞产生DGE2及TXB2,其抗炎作用部分机理是抑制钙离子内流[18]。
它能分别激活单核吞噬细胞分泌TNFα(肿瘤坏死因子α),IL1,IL6及IL8(白细胞介素1,6,8),但所分泌的量显著低于由内毒素诱导所产生的量(P<001)。
此外,它还能显著抑制由内毒素诱导的上述因子的大量分泌(P<001)。
故具抗炎及增强机体免疫作用[19]。
35 保肝作用
近年来对丹参素保肝作用研究发现,丹参素能直接刺激肝细胞增殖,且两者之间有一定剂量依赖关系,它对D半乳糖胺引起的肝细胞损伤和坏死具有保护作用。
[20]另外,实验研究表明氰化钾对肝细胞具有毒性,丹参素能使含25mmol/L氰化钾肝细胞培养液中LDH活性显著降低,显著增强肝细胞SOD活力,降低LDO含量,提示氰化钾致肝细胞损伤与自由基毒性作用密切相关,丹参素具稳定细胞膜,清除自由基的作用[21]。
36 其它作用
丹参素能显著延长小鼠耐缺氧时间,而且对后叶素引起的大鼠缺血性心电变化,具有显著保护作用。
另外,它能明显扩张冠状动脉,使其血流量显著增加,并有对抗吗啡和心得安收缩冠状动脉的作用。
它还可拮抗低氧性肺血管收缩作用,提示可为肺心病、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)等危重疾病的治疗提供帮助[22]。
丹参素对微循环障碍具有明显改善作用,它可降低血浆乳酸含量,能改善细胞缺血缺氧所致的代谢障碍。
另外,它并不影响静息状态下的红细胞中游离钙的变化,提示其有阻滞红细胞钙内流的作用[23]。
第二部分实验部分
丹参素提取物是丹参药材粉碎成粗粉,加碱性溶液,煎煮二次,合并滤液,加盐酸调成酸性,上大孔吸附树脂柱,洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,减压干燥,而得。
本品丹参素提取物主要有效成分为丹参素,采用HPLC法,以丹参素钠为定量依据并作为本品的质量控制指标,对提取物中的丹参素进行了定量分析,并对HPLC法的稳定性、精密度、重复性、线性范围考察、回收率等进行了方法学研究。
研究结果表明,HPLC法用做本品的质量控制方法,具有简便、快速、结果准确等优点。
而且,HPLC法还具有良好的专一性。
HPLC法的方法学考察条件及结果如下。
1仪器与试药
Agilent1100型高效液相色谱仪(包括一元泵、柱温箱、手动进样器、VWD检测器、HP-ChemStation);色谱柱:
AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm);流速:
1.0ml/min;柱温:
35(CBLModel100型柱温箱);检测波长:
281nm。
日本岛津UV-2401PCUV-VISRecordingSpectrophotometer;1cm石英吸收池。
甲醇(色谱纯,天津市四友生物医学技术有限公司出品,批号:
0601101)
冰醋酸(AR、天津市福晨化学试剂厂;批号:
060222)
丹参素钠对照品(自制;批号:
060405)
丹参素提取物供试品(自制;批号:
060205、060211、060215)
2HPLC检测波长的选择
取丹参素钠对照品及丹参素提取物样品适量,分别加流动相使溶解并配制成每1ml约含40μg的溶液,照分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA),以流动相为空白,在200~500nm波长范围内进行光谱扫描,紫外光谱图见图1。
从图1紫外吸收光谱图可以看出,供试品溶液与对照品溶液的紫外吸收特性基本一致,其最大吸收波长均在281nm波长处,因此,选择281nm作为HPLC的检测波长。
图11:
丹参素钠对照品(实线)2:
丹参素提取物的供试品溶液(蓝线)3:
空白对照液(虚线)
3HPLC流动相的选择
3.1流动相选择依据
根据文献资料我们选定下列流动相对丹参素钠进行了流动相的筛选。
在同一供试品溶液、色谱柱、流速(1.0ml/min)、检测波长和HPLC仪器的其他条件相同的情况下,通过对多种溶剂系统进行考察,其中包括
(1)甲醇-水-醋酸(12:
87:
1)、
(2)甲醇-水-磷酸(20:
79:
1)、(3)甲醇-0.5%醋酸(10:
70)、(4)水-乙腈-醋酸(80:
17:
3)、(5)甲醇-乙腈-15%醋酸(30:
20:
10)等。
通过对供试品色谱图中所呈现的丹参素钠色谱峰的相对保留时间、分离度、理论塔板数、托尾因子等进行比较和分析,流动相甲醇-水-醋酸(8:
91:
1)项下色谱峰的分离度、理论塔板数均大于其他流动相,分析时间短,分离度也大于中国药典2005年版一部附录ⅥD液相色谱法对分离度的要求。
最后确定甲醇-水-醋酸(8:
91:
1)作为流动相;流速为1.0ml/min;柱温为35℃。
3.2试验结果与结论:
不同流动相的色谱行为分析结果见表1,色谱图见图2-6。
从分析结果看,以甲醇-水-醋酸(8:
91:
1)、甲醇-水-磷酸(20:
79:
1)为流动相效果较佳,而甲醇-水-醋酸(8:
91:
1)为流动相时D(+)β-(3,4-二羟基苯基)乳酸钠的保留时间更适宜。
因此确定以甲醇-水-醋酸(12:
87:
1)作为HPLC法检测丹参素提取物的流动相,并最终确定色谱条件为:
采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱温为35℃,进样量为20μL,流速为1ml/min,以甲醇-水-醋酸(12:
87:
1)为流动相,检测波长为281nm。
理论板数按丹参素钠峰计算应不低于4000。
表1、流动相的选择结果
流动相组成
峰个数
丹参素钠的
保留时间(min)
峰面积
百分比(%)
理论板数
分离度
甲醇-水-醋酸(8:
91:
1)
31
8.534
1610
26.84
13218
-
甲醇-水-磷酸(20:
79:
1)
29
5.085
1623
16.62
10133
-
甲醇-0.5%醋酸(10:
70)
26
7.863
825
9.75
7988
1.36
水-乙腈-醋酸(80:
17:
3)
41
2.96
2720
6.43
8176
-
甲醇-乙腈-15%醋酸(30:
20:
10)
15
2.860
2449
8.32
4162
1.39
图2:
甲醇-水-醋酸(12:
87:
1)
图3:
甲醇-水-磷酸(20:
79:
1)
图4:
甲醇-0.5%醋酸(10:
70)
图5:
水-乙腈-醋酸(80:
17:
3)
图6:
甲醇-乙腈-15%醋酸(30:
20:
10)
4供试品溶液稳定性试验
4.1供试品溶液的制备:
精密称取丹参素提取物供试品25.64mg,置25ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
4.2对照品溶液的制备:
精密称取丹参素钠对照品5.21mg,,置25ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
4.3试验方法:
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,然后每间隔1小时进样一次,比较丹参素钠峰的峰面积,考察溶液的稳定性。
4.4试验结果与结论:
测定结果见表2。
从测定结果可以看出,供试品溶液和对照品溶液在5小时内比较稳定,可以满足含量测定方法对分析时间的要求。
表2、供试品溶液的稳定性试验结果
进样时间
峰面积
供试品溶液
对照品溶液
0小时
3145.96
2877.25
1小时
3133.11
2866.28
2小时
3122.9
2864.15
3小时
3135.85
2878.08
4小时
3136.46
2870.23
5小时
3135.56
2875.80
平均值:
3134.973
2871.965
RSD%
0.24
0.21
5仪器精密度试验
5.1试验方法:
取“供试品溶液稳定性试验”中对照品溶液,精密吸取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。
连续进样6针,考察仪器的精密度。
5.2试验结果与结论:
测定结果见表3。
从测定结果可以看出,仪器具有良好的精密度。
表3、仪器精密度验结果
次数
峰面积
1
2877.25
2
2877.75
3
2871.51
4
2866.28
5
2871.74
6
2864.15
平均
2871.447
RSD%
0.193`
6.丹参素钠线性范围的考察
6.1对照品溶液的制备:
精密称取丹参素钠对照品20.55mg,置50ml量瓶中,加流动相溶液使溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml于10ml棕色量瓶中,加流动相溶液稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
6.2标准曲线的制备:
精密吸取上述系列对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,每份对照品溶液进样二次,记录色谱图,以丹参素钠的峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,计算回归方程。
6.3试验结果:
测定结果见表4。
对测定结果进行回归分析,得回归方程为:
Y=14989X-8.6234,r=1,表明丹参素钠在0.02055~0.411mg/mL之间线性关系良好。
标准曲线见图7。
表4、线性范围考察结果
编号
1
2
3
4
5
6
7
浓度(mg)
0.02055
0.0411
0.0822
0.1644
0.2466
0.3288
0.411
6138.62
6133.82
6136.22
峰面积
302.75
608
1212.31
2448.63
3719.35
4925.25
303.24
607.02
1212.23
2441.02
3707.86
4931.26
平均值
302.995
607.51
1212.27
2444.825
3713.605
4928.255
图7、丹参素钠标准曲线(HPLC法)
7重复性试验
7.1对照品溶液的制备:
精密称取丹参素钠对照品4.95mg,置25ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
7.2供试品溶液的制备:
精密称取同一批号的丹参素提取物供试品(批号:
060205)共5份,每份约25mg,置25ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
7.3检测方法:
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得。
7.4试验结果与结论:
重复性试验测定结果见表5。
从测定结果可以看出,本法具有良好的重复性。
表5、重复性试验结果
样品编号
丹参素钠的含量(%)
1
2
3
4
5
平均值
16.34
16.52
16.18
16.63
16.38
16.41
RSD%
1.05
8回收率试验
分别不等量取已知含量的供试品(约分别为药品标准正文中【含量测定】项下拟定取样量的40%、50%、60%)制备成不同浓度的溶液,约等量加入已知浓度的对照品溶液,进行回收率试验。
8.1对照品溶液的制备:
精密称取丹参素钠对照品5.17mg,置25ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
8.2加样用对照品溶液的制备:
精密称取丹参素钠对照品25.24mg,置50ml容量瓶中,流动相溶液适量,振摇使溶解,并稀释至刻度,摇匀,即得。
8.3供试品溶液的制备:
精密称取已知含量(16.41%)的供试品10.32mg、10.67mg、12.14mg、12.35mg、15.24mg、15.08mg,分别置25ml量瓶中,各加加样用丹参素钠对照品溶液4.0ml、4.0ml、5.0ml、5.0ml、6.0ml、6.0ml,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
8.4测定方法:
分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液各20ul,注入液相色谱仪,测定,按下式计算回收率。
回收率实验%=
结果与结论:
测定结果见表6。
通过对回收率试验结果的分析,表明HPLC法用于本品的质量控制方法具有良好的准确度。
表6、回收率试验结果
编号
取样量(mg)
样品含(mg)
加入量(mg)
测得量(mg)
回收率%
1
10.32
1.69
2.02
3.708
99.84
2
10.67
1.75
2.02
3.775
100.12
3
12.14
1.99
2.52
4.450
98.63
4
12.35
2.03
2.52
4.476
98.44
5
15.24
2.50
3.03
5.491
99.27
6
15.08
2.47
3.03
5.524
100.35
平均回收率:
99.44RSD%=0.80
9.丹参素提取物的含量测定方法的确定
通过上述方法学考察,确定丹参素提取物的含量测定方法如下:
照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VD)测定。
9.1对照品溶液的制备:
精密称取丹参素钠对照品5.0mg,置25ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
9.2供试品溶液的制备:
取本品约25.0mg,精密称定,置25ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
9.3测定法:
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得。
10.三批丹参素提取物的含量测定
按以上拟订的方法,对连续三批样品进行丹参素提取物的含量检测(批号:
060205、0060211、0060215),结果见表7。
根据三批样品实测结果,暂定本品含丹参素以丹参素钠计,应不低于15.0%。
表7三批样品测定结果
批号
丹参素含量(%)
样品1
样品2
平均值
060205
16.37
16.43
16.4
0060211
18.21
17.96
18.09
0060215
19.82
19.78
19.8
11.含量限度
根据三批丹参素提取物的含量测定结果,暂定本品含丹参素以丹参素钠计不得少于15.0%。
结果与讨论
通过以上方法学研究表明,HPLC在测定丹参素提取物中丹参素的含量,具有专属性,在选定的流动相能够很
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- HPLC 检测 丹参
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)