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硝基苯降解菌的筛选及其最适降解条件研究
硝基苯降解菌的筛选及其最适降解条件研究
王琦bjwang1999@北京
[摘要]经过驯化,富集,分离到一高效菌株。
所富集的高效菌群对硝基苯的最佳降解条件为:
厌氧,pH6.8-7.8,33-37℃,盐浓度为3.5-5.5g/L。
该菌群不单能耐受较低浓度的铜、钴、铬、铅等重金属离子,而且对二硝基甲苯也具有降解能力。
厌氧填充床运行表明,硝基苯浓度低于300ppm时,停留时间为20h时,硝基苯的去除率为95%。
硝基苯浓度为500ppm,在停留时间为22h时,硝基苯去除率为82%,显现出了稳定高效的降解性能。
[关键词]硝基苯废水;生物降解;厌氧
Researchpresentconditionofwasteprocessingtechnique
WangQi【1】,LiYuping【2】
(1.BeijingSure-techncrop,Beijing100070;2.InstituteOfProcessEngineering,ChineseAcdemyOfSciencesBeijing100190)
Abstract:
Agroupofobligateeffectiveanaerobicbactericidestrains,whichcanhighlyreducenitrobenzenetoanilinewereobtainedbyenriching,screeningandacclimatizing.Thegrowingconditionsareoptimizedasfollows:
pH6.8-7.8,33-37℃,andNaCl0.4%-0.5%.Thestrainsalsocanreducenitrobenzenebyco-metabolismwithethanolandglycerin.thestrainsnotonlycantoleratesomeheavymetalsaltswithlowconcentrationsuchasCu2+,Co2+,Cr6+,Pb2+aswellasHg2+,butalsohaveacapabilityonreducing1,4-Dichlor-2-nitrobenzol,β-Nitroso-α-naphtholand2-Nitro-toluene.
thebactericidestrainsshowedastable,powerfuldegradativecapabilityappliedtotreatmenttowastewater.Theycandegradenitrobenzeneupto600ppm.Nitrobenzeneof300ppmwaseliminatedin25hoursandnitrobenzeneof500ppmwasreducedmorethan80%in25hoursinanaerobicpackedbedreactor.
Keywords:
nitrobenzenewastewater;chemistrymethod;physicschemistrymethod
1前言
硝基苯作为一种难生物降解的有机物,传统生物处理工艺不能有效维持连续的驯化培养物,冲击负荷大。
于是人们试图通过对代谢菌种改良和反应工艺改进与优化来提高难生物降解有机废水的降解效率。
有关采用生物法寻找降解硝基苯的菌株来处理硝基苯类废水国内外都进行了大量的研究。
有效菌株的获得主要有两个方面,一是从污染现场或处理设施中筛选分离得到,在长期受到难降解有机物污染的现场,经过长时间的诱导以及缓慢的自然驯化和选择过程,常存在有少量有效降解菌株,通过筛选分离即可得到。
在这一方面研究人员通过现场分离已得到了不少难降解有机物的高效降解微生物。
二是利用分子生物学技术构建工程菌。
利用基因改良,原生质体融合等技术构建和改良基因工程菌,建设高效降解菌株库,构建系统进化树,从分子生物学水平探讨降解代谢途径的起源与进化并促进微生物资源的利用。
2硝基苯降解菌的富集驯化与菌种分离鉴定
2.1实验材料和测定方法
2.1.1菌种来源:
本实验室硝基苯废水处理系统活性污泥。
2.1.2培养基
无机盐培养基:
NaCl2-6g/L
MgSO40.5g/L
KH2PO43.0g/L
Na2HPO45.0g/L
蒸馏水1000ml
pH7.0
高压灭菌,0.05MPa(表压),121℃,30min。
富集驯化培养基:
在以上无机盐培养基中加入0.5%的葡萄糖和0.3%的蛋白胨融化。
平板固体培养基:
在无机盐培养基加入2%的琼脂,1.0%的蛋白胨以及一定量的硝基苯融化灭菌后倒平板,冷却后使用。
2.1.3试剂
本实验所有试剂均为国产分析纯试剂。
苯胺使用前经过蒸馏提纯,硝基苯经过减压蒸馏提纯。
2.1.4实验仪器
HZQ-C空气浴振荡器哈尔滨东联电子公司
HZQ-C水浴振荡器哈尔滨东联电子公司
手提式压力蒸汽消毒器江阴滨江医疗设备厂
6890N型气相色谱仪美国Agilent公司
UV-240型紫外分光光度计日本Shimadzu公司
Phs-25数显pH计上海精密科学仪器有限公司
2.1.4分析方法
后期分析硝基苯和苯胺浓度通过液液萃取进行以二硝基甲苯为内标物气相色谱分析(Agilent6890N)。
前期驯化时采用萘乙二胺偶氮光度法测定硝基苯浓度用紫外分光光度计扫描测定(波长200nm-400nm)。
微生物的相对生长情况用光密度OD600表示。
OD600值用UV-240型紫外分光光度计测定(波长600nm)。
2.2实验方法
2.2.1菌种的驯化与分离方法
将所保存菌液接种到装有富集培养基的培养瓶里,再将适当浓度的硝基苯溶液直接加到该培养瓶中(硝基苯的初始浓度为20mg/L),通氮气两分钟,放在30℃水浴中恒温静止培养。
培养一段时间至溶液浑浊,且经紫外可见扫描硝基苯降解良好,苯胺峰明显时,倒掉一半培养液换上新的含硝基苯的富集培养液,新溶液中的硝基苯浓度比第一次增加。
如此这般,保持其它条件不变,不断重复该过程并逐步提高硝基苯的浓度,经过约两个月的驯化培养,得到能降解较高浓度硝基苯的混合菌株。
当硝基苯浓度提高到200ppm时,驯化的同时再通过在平板上不断分离纯化得到高效降解菌株。
2.2.1降解特性研究实验方法
(1)在培养瓶中配制体积为200ml,起始硝基苯浓度为200mg/L的无菌培养液,都接入5ml处于对数生长期的菌液(OD=0.30),以1.0g/L的葡萄糖作为生长基质,分别改变温度,盐浓度,pH值,通气条件,隔时取样分析上述因素对降解率的影响。
(2)另取四支培养瓶改变生长基质葡萄糖的浓度,起始硝基苯浓度为500mg/L,研究葡萄糖浓度对硝基苯去除率的影响。
温度:
25℃,30℃,35℃
盐浓度:
2g/L,3g/L,4g/L,5g/L,6g/L
pH值:
5,6,7,8,9,10
通气条件:
通氮气5min,不通氮气
葡萄糖:
0.3g/L,0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L
重金属离子:
Hg2+0.01mmol/L,Ag+0.05mmol/L,Pb2+0.10mmol/L,
Co2+2.0mmol/L,Cu2+2.0mmol/L和Cr6+1.0mmol/L。
2.3结果与讨论
硝基苯的溶解度(体积比)约为1/500,由于它的难溶性,不能将其直接加到培养液中。
应先取少量硝基苯于一定量的水中,用力振荡使其溶解,再将硝基苯溶液按比例加入。
另外,硝基苯为易挥发性物质,在灭菌过程中由于挥发会导致硝基苯浓度降低。
故本实验是先将硝基苯溶解在双蒸馏水中,再加入到灭菌的无机盐培养基中。
在革兰氏染色中,要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色;涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性;火焰固定不宜过热,以玻片不烫手为宜。
染色结果是否正确,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节,脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌,脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌。
经过40多天的富集驯化,已得到能耐受600mg/L高浓度硝基苯的菌株,均高于文献报道。
该混合菌的降解性能还是很强的。
萘乙二胺偶氮光度法测定苯胺浓度【29】。
苯胺类化合物在酸性条件下与亚硝酸盐重氮化,再与盐酸萘乙二胺耦合,生成紫色染料,根据波长在545nm处的吸收进行定量。
于7个25ml具赛比色管中分别加入0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml苯胺标准溶液(10.0μg/ml),各加水至10ml,摇匀;用盐酸调pH至1.5-2.0,加1滴5%的NaNO2溶液,摇匀,放置3min;加入2.5%氨基磺酸铵溶液0.5ml,充分振荡后放置3min;待气泡除尽,加入2%EDTA溶液1.0ml,加水稀释至刻度,摇匀,放置30min,于545nm波长处,以水为参比测定吸光度。
所得标准曲线为:
C0=5.0993*A-0.1735R2=0.9998
若取样量为V(ml),则实际苯胺浓度为C1=10C0/V
起始硝基苯浓度为200ppm,培养50h后的描迹曲线如图:
起始硝基苯浓度为500ppm,培养24h后的描迹曲线如图:
添加扫描图
革兰氏染色采用如下步骤
1:
制片,取对数生长期的菌种培养物常规涂片、干燥,固定。
2:
初染,滴加结晶紫使刚好将菌膜覆盖,染色1—2分钟,水洗。
3:
媒染,用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1分钟,水洗。
4:
脱色,用滤纸吸去残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直到流出的乙醇无紫色时(约20—30秒),立即水洗。
5:
复染,用番红液复染约2分钟,水洗。
6:
镜检,干燥后,用油镜观察,
经初步鉴定,菌株的革兰氏染色呈阴性,杆菌,不具运动性。
3最适降解条件研究
对细菌来说,影响其生长繁殖的主要因素有营养、温度、盐浓度、pH值、气体条件几个方面。
本章内容即是在这几个方面对该菌群的环境适应性进行摸索。
3.1实验装置和方法
3.1.1实验装置仪器:
同前一章节
3.1.2实验方法
3.1.3气相色谱法测定苯胺、硝基苯浓度。
采用有机溶剂萃取,根据极性、沸点的不同,进行色谱分析。
不同有机物在色谱柱中的停留时间长短不同,再根据其出峰面积可计算出其含量。
将少量2-nitro-toluene溶在500ml三氯甲烷中(42.14mg/L)作为内标物。
从已配好的苯胺,硝基苯储备液中各取1ml,5ml,10ml,20ml于四支100ml容量瓶,定容得:
1#
2#
3#
4#
苯胺(mg/L)
11.87
59.35
118.7
213.66
硝基苯(mg/L)
14.06
56.24
112.48
210.9
分取2ml上述四组溶液于干燥的10ml比色管中,用20%的NaOH调pH8-9,然后加0.4gNaCl,振荡溶解后,准确加入上述CHCl32.0ml,振荡3min,静置10min后吸去水相,加无水硫酸钠吸去残余水相后测定。
得标准曲线为:
苯胺:
C=0.89644*A-0.00248R2=0.99999
硝基苯:
C=1.14595*A-0.01241R2=0.99997
测样时,取2ml菌液按相同步骤操作,进样分析后可直接得到两种物质的浓度。
色谱柱:
固定相:
载气:
温度:
气化室温度250℃,柱温120℃,
柱流量:
1.5ml/min,H240,Air400
进样量:
2μl
3.2结果与讨论
实验中发现,生成的苯胺与去除的硝基苯不呈对应关系,苯胺并不是该生物降解的唯一产物,还有亚硝基苯等别的中间产物产生(这将在第五张阐述),故在考察该菌的降解能力时,以所监测到的剩余硝基苯量来表征比较准确。
在所有影响因素中,以pH值变化影响最为明显。
在酸性环境中,该菌降解硝基苯的能力很低,而在碱性条件下降解情况较好,最适pH值是7-8。
通气条件也只是在培养开始前通氮气2min以赶除部分氧气,使其尽可能保持厌氧环境。
3.2.1温度对降解率的影响
将对数生长期的菌液以10ml的接种量,接种于四个含200ppm硝基苯的培养瓶中,分别置于室温(约25℃)、30℃、35℃、40℃下培养。
生长65h时测各瓶中剩余硝基苯浓度,作出不同温度下的降解影响图。
见图1。
由图可以看出,该菌对硝基苯降解的适宜温度在32℃-37℃范围内,温度过低或过高均不利于硝基苯的降解。
3.2.2不同通气条件对硝基苯降解率的影响
将对数生长期的菌液以10ml的接种量,接种于四个含200ppm硝基苯的培养瓶中,对1#,2#通氮气2min,3#和4#不通。
于30℃培养生长65h时测各瓶中剩余硝基苯浓度,去平均值后作出不同通气条件下的降解影响图。
通气条件对硝基苯降解率的影响见下表。
24h
48h
60h
OD
NB去除率
OD
NB去除率
OD
NB去除率
通N22min
0.193
23%
0.486
57%
0.587
78.5%
不通
0.225
14%
0.437
32.5%
0.502
52%
由表可以看出,培养开始前排一排氧气有利于硝基苯的降解。
同时也说明了该菌群为兼性厌氧,在厌氧条件较为有利。
3.2.3pH对硝基苯降解率的影响
将对数生长期的菌液以10ml的接种量,接种于六个含200ppm硝基苯的培养瓶中,该培养基事先以磷酸盐缓冲液配制,后用盐酸和氢氧化钠调节pH值分别为5,6,7,8,9,10。
生长65h时测各瓶中剩余硝基苯浓度,作出不同pH下的降解影响图。
见图2。
由图可以看出,在pH6-10之间,硝基苯具有较高的降解率,最适宜的pH在7-8之间。
该菌适应碱的能力比较强。
3.2.4盐浓度对硝基苯降解率的影响
将对数生长期的菌液以10ml的接种量,接种于四个含200ppm硝基苯的培养瓶中,调节盐浓度分别为2g/L,3g/L,4g/L,5g/L,6g/L。
生长65h时测各瓶中剩余硝基苯浓度,作出不同盐浓度下的降解影响图。
见图3。
由图可知,在盐浓度为4g/L时效果最好,但盐浓度对该菌群的影响比较小,在3-6g/L范围内硝基苯的降解效果都不错。
在4g/L培养40h时的气相色谱图如下:
3.2.5葡萄糖浓度影响
将对数生长期的菌液以10ml的接种量,接种于四个含500ppm硝基苯的培养瓶中,调节葡萄糖浓度分别为0.3g/L,0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L。
培养四天,五天,六天时测各瓶中剩余硝基苯浓度,作出不同葡萄糖浓度下的降解影响图。
3.2.6其它生长基质的利用情况
在前述无机盐培养基中分别加入5ml乙酸,乙醇,乳酸,丙三醇取代葡萄糖作为其生长基质,起始硝基苯浓度为100mg/L,接种量为10mL,30℃,静止培养50小时检测。
生长基质
乙醇
丙三醇
乙酸
乳酸
剩余硝基苯浓度ppm
46.013
54..902
87.136
74.696
硝基苯去除率%
54
46
13
26
数据表明该菌能利用乙醇,丙三醇,乙酸,乳酸作为生长基质代谢降解硝基苯,但效果乙醇和丙三醇明显好于乙酸和乳酸。
3.2.7重金属离子对硝基苯降解率的影响
在前述无机盐培养基中按如下比例分别加入各重金属离子,以1.0g/L葡萄糖作为其生长基质,起始硝基苯浓度为200mg/L,接种量为10mL,30℃,静止培养65h后检测培养液中剩余硝基苯浓度。
作出重金属离子影响图。
如下:
Hg2+0.01mmol/L
Ag+0.05mmol/L
Pb2+0.10mmol/L
Co2+2.0mmol/L
Cu2+2.0mmol/L
Cr6+1.0mmol/L
由上图可知,该混合菌对重金属离子的耐受能力比较强。
而在实际工业废水中,因为环境因素复杂,也往往含有一定浓度的重金属离子。
因此该菌群的这一能力具有重要的实际应用价值。
4对实际硝基苯废水的降解
4.1实验装置和方法
4.1.1实验装置:
厌氧填充床如图所示(扫描照片)
4.1.2实验方法
分别将微量硝基苯、苯胺、苯胲、亚硝基苯、对氨基酚溶于1:
1乙醇中作为标准物质。
将对数生长后期的菌液离心(5000转,10min),取上清,用高校液相色谱仪定性分析中间产物。
在人工配置不同浓度(100mg/L-500mg/L)的硝基苯废水中加入不同浓度(0.5g/L-2.0g/L)的葡萄糖和50ml对数生长期菌液,接入厌氧填充床内,进行挂膜运行,经过17天连续流加营养物质培育后,载体上形成一层菌膜。
挂膜时进水中加入适当浓度的硝基苯,从100mg/L逐步增加至500mg/L。
既使微生物始终处于硝基苯溶液环境中,又能形成生物膜。
4.2结果与讨论
该高效菌群的最佳降解条件为:
厌氧条件,33℃-37℃,pH值6.8-7.8,盐浓度为3.5-5.5g/L。
每克葡萄糖可共代谢约350-400mg硝基苯。
在生长基质的选择上,除葡萄糖外还可以利用乙醇,丙三醇作为生长基质且生长良好。
初步分析硝基苯的降解途径为:
硝基苯还原时有很多中间产物生成,最后产物是苯胺。
当硝基苯浓度低于200ppm时,经厌氧填充床处理20h,出水硝基苯浓度低于10个ppm。
硝基苯浓度为500ppm,在停留时间为20h时,出水硝基苯浓度为90ppm,日处理能力也能达80%以上。
经检测在进水硝基苯浓度为300mg/L时,经15小时,出水硝基苯浓度为47mg/L,去除率达84%。
此后,装置进入正常运行,向填充床连续流加含1.0g/L葡萄糖的实际废水(处理前调节ph至7.5),硝基苯浓度为500ppm。
控制停留时间25h,平均水温为室温26℃。
在对进水和出水的检测结果中,硝基苯去除率达到90%。
从处理效果看,厌氧菌对实际废水具有较好的降解能力。
参考文献
【1】赵军,等,O3氧化处理苯胺、硝基苯废水的试验研究[J].环境保护科学.1997,23(3);12-14
【2】MunterR,etal.Methologyofozoneintroductionhintowaterandwastertreatment[J].ScienceandEngineering,1993.15
(2);149-165
【3】钱易,等,水体颗粒物和难降解有机物的特性与控制技术原理(下卷:
难降解有机物)[M],北京:
中国环境科学出版社,2000.6
【4】RajagopalC.KapoorJC,Developmentofadsorptiveremovalprocessfortreatmentofexplosivescontaminatedwastewaterusingactivatedcarbon[J].JournalofHazardousMaterials,2001,87(1-3);73-98.
【5】徐中期,陆晓华.活性炭纤维在硝基苯水溶液中的吸附和再生[J].华南理工大学学报,2000,28(7);102-104
【6】毛连山,等,硝基苯废水的治理[J],环境污染与防治,2000,22,(6)22-25
【7】顾曼华,等,有机膨润土吸附硝基苯的性能及其在废水处理中的应用[J],水处理技术,1994,20(4);236-239
【8】林中祥,程康华,萃取法去除硝基苯生产废水中的硝基酚[J],环境导报,2000,
(2);18-20
【9】沙耀武.赵文超.含硝基苯或硝基氯苯的废水处理的研究[J],精细化工,1996,13(5);57-58
【10】AbinashAgrawal,PaulGTratnyek.Reductionofnitroaromaticcompoundsbyzero-valentironmetal[J],Environ.Sci.Technol.1996,30;153-160
【11】李劲,等,电流体直流放电降解水中硝基苯的研究[J],环境科学,2001,22(5);99-101
【12】朱先军,等,酸性溶液中离子注入钯的玻璃电极上硝基苯的电化学还原[J],应用化学,1996,13(4);30-33
【13】刘东,蔡宏道,硝基苯类化合物降解菌的分离鉴定及其最适降解条件的研究[J],环境与健康杂志,1989,6(5);12-15
【14】刘红果,等,硝基苯降解菌的分离鉴定及其对硝基苯的降解[J],环境科学与技术,1991,1;16-17
【15】赵珏,等,多株硝基苯降解菌的筛选[J],应用与环境生物学报,2002,8(4);427-429
【16】蔡帮成,等,一株硝基苯高效降解菌的筛选及其降解特性[J],环境科学与技术,26(4)1-2
【17】HauglandRA,SchlemnDJ,LyonsRP,etal.Degradationofthechlorinatedphenoxyacetateherbicides2,4-Dichlorophenoxyaceticacidand2,4,5-Trichlorophenoxyaceticacidbypureandmixedbacterialculture[J].ApplEnvironMicrobiol,1990,56(5):
1357-1362.
【18】KröckelL,FochtDD.Constructionofchlorobenzene-utilizingrecombinantsbyprogenitivemanifestationofarareevent[J].ApplEnvironMicrobiol,1987,53(10):
2470-2475.
【19】BillyEH,SpainJC,ApplEnvironMicrobiol,1991,57(11);3156-3162
【20】KwanHJ,JangYL,Haksk.Bioengng,1995,48;625-630
【21】HaiglerBE,SpainJC.Biodegradationof4-nitrotoluenebypseudomonassp.Strain4NT[J].ApplEnvironMicrobiol,1993,59(7):
2239-2243.
【22】鞠宇平,张林生.ABR-SBR工艺处理电泳涂膜废水[J].中国给水排水,2003,19
(2):
51-52.
【23】MaloneySW,AdrianNR,HickeyRF,etal.AnaerobictreatmentofpinkwaterinafluidizedbedreactorcontainingGAC[J].JHazardousMaterials,2002,92
(1):
77–88.
【24】沈树宝,陈英文,夏明芳,等.仿生膜生物反应器处理高浓度有机农药废水的研究,工业水处理,2003
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- 硝基苯 降解 筛选 及其 条件 研究