分子生物学讲义 中山大学.docx

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分子生物学讲义中山大学

重组与转座（recombinationandtransposition）

1.重组的类型

⏹同源重组（homologousrecombination）

⏹位点专一重组（site-specificrecombination）

⏹转座（transposition），又称异常重组（illegitimaterecombination

2.同源重组

（1）同源重组的形式

⏹常发生在同源染色体之间（分子间重组），也可发生在同一DNA分子内（分子内重组）

2）Holliday模型

⏹说明同源重组的一个经典模型，基于重组过程中有十字形的中间产物

（3）RecBCD重组途径

⏹存于E.coli中，需要RecBCD蛋白（RecBCDprotein，recB、recC、recD基因的产物）的参与

⏹RecA

38kD的蛋白质，具多种功能，其中一种就是在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是一单链与一双链中的同源单链交换）；交换过程需ATP

⏹RecBCD

一种具多功能的酶

依赖于DNA的ATPase（水解ATP，为DNA的解螺旋提供能量）

DNAnuclease，可作用于单链或双链DNA，切割χ位点（GCTGGTGG）χ（chi）:

crossoverhotspotinstigator

DNAhelicase活性

RecBCD的切点与底物（序列）有关，可在χ位点3’端4~6nt

⏹RuvA和RuvB

两者均具DNAhelicase活性（RuvB还有ATPase活性），且两者一起才能与DNA很好地结合（RuvA先结合，然后RuvB才能结合）

它们专门与Hollidayjunction这样一种结构结合，促使branchmigration发生

RuvA和RuvB与Hollidayjunction的结合位置十分特异

⏹RuvC

解开Hollidayjunction所需的一种核酸酶，能特异地与Hollidayjunction结合，并在特异位点切开Hollidayjunction

RuvC是二聚体，有2个活性位点，因此能切开Hollidayjunction中的两条链

切割位点必须有特异的序列，因此，必须通过branchmigration到达特异序列后，RuvC才能起作用（Hollidayjunction两种解开方式的相对多寡取决于两对同源单链上所具有的RuvC切割位点的相对多寡）

（4）减数分裂重组（meioticrecombination）

真核生物中常见的重组，与细菌中的重组有不少相似之处，但在起始的步骤有较大的差异（有DNA双链断裂，double-strandedDNAbreak）

（5）基因转换（geneconversion）

多见于真核生物

当两相似的序列（等位基因、非等位基因均可）靠在一起时，就有可能发生基因转换，即一DNA序列转换成另一相似的序列

基因转换的机制是基于重组，即先交换一段DNA序列，然后进行修复，就会使某一序列的比例增加

3.位点专一重组

（1）噬菌体的整合与切除

噬菌体整合到宿主基因组需整合酶（Int，的int基因编码）及宿主蛋白IHF，并通过同源区域attP（）与attB（宿主）的重组而达成

噬菌体从宿主基因组切除需整合酶（Int）、Xis（的xis基因编码）及IHF，是整合的逆过程

附着（整合）位点（attsites）

attP与attB只在它们的中间区域有一小段同源序列（15bp，称为O）；attP的必需序列从–152到+82（以O的中点为0），而attB只需25bp左右的序列（包括中间的O）

4.转座

（1）细菌转座子

⏹插入序列（insertionsequences，IS）

最简单的转座子，只含有转座所必需的元件：

两端有反向重复序列（invertedrepeats,15~25bp），中间有编码转座所需的酶的基因（至少有2个，编码转座酶，即transposase）

插入序列在转座时，其插入位点两旁会产生一小段正向重复（directrepeats）

带有抗生素抗性基因的转座子

除了必要的转座元件外，还含有抗生素抗性基因，能赋予其携带者某种抗性

⏹转座的机制

复制性转座（replicativetransposition）

转座过程有DNA复制，结果一个转座子留在原位，另一个插入到新的位点

保守性转座（conservativetransposition）

转座子离开原位置，插入到新的位点；这种转座又称非复制性转座（nonreplicativetransposition）

（2）真核生物的转座子

⏹玉米的Ds（dissociation）和Ac（activator）

最早发现（1940s）的转座子，与某些品种的玉米种子上的色斑变化有关（玉米种子的颜色由C基因编码的因子造成；若C基因突变，就没有色素产生，种子几乎白色；若部分细胞产生回复突变，就会在种子上形成颜色斑点）

⏹玉米的Ds（dissociation）和Ac（activator）

Ac能自行转座，而Ds必须要有Ac的帮助才能转座

Ac或Ds插入到功能基因中，就会使该基因失活

⏹Ds和Ac结构

Ac与细菌的转座子相似，约4500bp，两端有反向重复序列，中部含有转座酶基因

Ds是Ac的衍生物（功能不全，不能自主转座），有Ds-a、Ds-b、Ds-c3种

⏹反转录转座子（retrotransposons）

以RNA作为中介进行复制（转座），与反转录病毒（retroviruses）的复制相似，含有编码反转录酶的基因，能进行反转录；酵母中的Ty（transposonyeast）、果蝇中的copia等反转录转座子的两端有LTRs（longterminalrepeats）

原核生物的基因转录及表达调控

1.转录机器（装置）（transcriptionapparatus）

（1）RNA聚合酶（RNApolymerase）

⏹（40kD）

⏹（150kD），‘（160kD）

⏹（70kD）：

specificityfactor

⏹核心酶（coreenzyme）：

，‘，2

⏹全酶（holoenzyme）：

，‘，2，

（2）启动子（promoter）

⏹聚合酶的结合位点（bindingsite），一般位于转录起始位点上游

⏹RNA聚合酶与启动子的结合

（RNApolymerase/promoterbinding）

Closedpromotercomplex

Openpromotercomplex，转录才能开始

⏹Promoterstructure共同序列（consensussequence）

Pribnowbox（-10box,DavidPribnow发现）

-35box（-10box与-35box的最佳距离为171bp）

⏹下调突变（downmutation）

⏹上调突变（upmutation）

⏹Promoterstructure

强启动子还有一些额外的元件，如E.coli编码rRNA的rrngene中的UPelement（上游元件），可提高表达数十倍

（3）转录起始（transcriptioninitiation）

Foursteps:

⏹Formationofaclosedpromotercomplex

⏹Conversionoftheclosedpromotercomplextoanopenpromotercomplex

⏹Polymerizingthefirstfewnucleotides（upto10）whilethepolymeraseremainatthepromoter

⏹Promoterclearance

（4）延伸（elongation）

⏹核心酶起极其重要的作用，亚基参与转录出的RNA的磷酸二酯键的形成

⏹转录的拓扑学：

两种假说

RNApolymerase及新合成的RNA都围绕DNA旋转

RNApolymerase前后的DNA反向旋转

第二种假说有较多的依据：

拓扑异构酶（topoisomerase）的存在

（5）转录终止（terminationoftranscription）

⏹聚合酶到达终止子（terminator）就会从模板上脱落

⏹终止子有两种（终止方式也有两种）

intrinsic（-independent）terminator（termination）

-dependentterminator（termination）

⏹-independenttermination

较为简单，一段反向重复序列（invertedrepeat）与一富含T的区域（T-richregioninthenontemplatestrand）即为终止信号

终止子只有一段反向重复序列（能形成hairpin结构）

是一种蛋白质（6聚体），可使RNA聚合酶的转录能力大大下降（具RNA-DNA解螺旋酶的作用，能解开转录复合体中RNA-DNA双链）

2.基因表达调控

原核生物基因表达的调控主要以操纵子（operon）的方式进行

Operon:

Agroupofcontiguous,coordinatelycontrolledgenes

（1）乳糖操纵子（thelacoperon）

⏹lacZ:

-半乳糖苷酶（-galactosidase）基因

⏹lacY:

半乳糖苷透过酶（galactosidepermease）基因

⏹lacA:

半乳糖苷乙酰基转移酶（galactosidetransacetylase）基因

⏹lacI:

调节基因（regulatorygene）

⏹Operator:

操纵区

⏹Repressor:

阻遏子（阻遏物）

⏹Inducer:

诱导物（异构乳糖，allolactose）

（2）操纵子的发现

⏹发现过程

-半乳糖苷酶可被诱导（Monod,1940s）

半乳糖苷透过酶与-半乳糖苷酶一起被诱导出来

（发现一种不能产生半乳糖苷透过酶的突变体）

发现半乳糖苷乙酰基转移酶也是同时被诱导出来

发现一种组成型突变体（constitutivemutants）

构建局部（部分）二倍体（merodiploid，带有野生型与组成型突变的等位基因），进行“PaJaMo”系列实验（ArthurPardee,Jacob,Monod），发现乳糖代谢基本调控规律

⏹研究局部（部分）二倍体所得出的发现

野生型（可被诱导型）等位基因是显性的，说明野生型等位基因能产生某种物质，使得与乳糖代谢有关的基因处于关闭状态，而在被诱导后才表达

推测

有一种可称为阻遏物（repressor）的物质存在；组成型突变体则是产生阻遏物的基因有缺陷

既然有repressor，就应该有与repressor结合的DNA序列（operator）；若operator有突变，不能与repressor结合，则是一种显性的组成型突变体

⏹结论

通过阻遏基因（阻遏物）与操纵区，lacZ、lacY、lacA这3个结构基因是一起被调控的，它们组成了一个操纵子（thelacoperon）

后来的研究证实了Jacob与Monod的预言，并使操纵子的慨念进一步完善

（3）阻遏的机制

两种假说

⏹聚合酶与阻遏物可一起结合在lacoperon的启动子区，阻遏物的作用只是阻止转录从起始状态进入延伸状态

⏹阻遏物的作用是不让RNA聚合酶进入lacoperon的启动子（得到最新实验数据的支持）

（4）乳糖操纵子的正调控

⏹阻遏物的调控是负调控，乳糖操纵子的调控还需正调控因子

⏹代谢物阻遏效应（cataboliterepression）

⏹cAMP在细胞中的浓度与葡萄糖的含量成反比，它与一种称为代谢物激活蛋白（cataboliteactivatorprotein，又称CAP，另一称呼是环腺苷酸受体蛋白：

cAMPreceptorprotein，CRP）一起，起到正调控作用。

因此，起正调控作用的是CAP-cAMP

⏹乳糖操纵子的启动子实际上是一种弱启动子，其-35box与原核启动子相应的共同序列相差甚大，因此才需要CAP-cAMP进行正调控；如果是强启动子（与共同序列十分相近），则不需要正调控，但这种情况会使得即使葡萄糖存在，乳糖操纵子也一样运作。

（5）CAP的作用机制

⏹通过对有关突变体进行分析，发现CAP-cAMP的结合位点在启动子的上游（与启动子紧密相邻），该位点称为激活物位点（activatorsite）。

CAP-cAMP结合到激活物位点后，就会促进RNA聚合酶与DNA形成openpromotercomplex（CAP-cAMP能加快closedpromotercomplex的形成，从而提供了更多形成openpromotercomplex的机会），结果是促进转录。

6）阿拉伯糖操纵子（thearaoperon）

⏹像乳糖操纵子那样，也是一种有代谢物阻遏效应的操纵子

⏹thearaoperon又称thearaCBADoperon，即有控制基因C和结构基因B、A、D（编码阿拉伯糖代谢所需的酶）

⏹独特之处

两个ara操纵区：

araO1和araO2，前者调控控制基因araC的转录，后者控制启动子PBAD（在PBAD上游265与294bp之间）

CAP（cataboliteactivatorprotein）结合位点在ara启动子（PBAD）的上游约200bp处

⏹araC的自我调节（autoregulation）

araO1起作用：

当AraC（araC的产物）含量升高，便与araO1结合，阻止进一步转录araC，以免产生过多的AraC

（7）色氨酸操纵子（thetrpoperon）

⏹合成代谢的操纵子，所编码的酶能把色氨酸前体分枝酸（chorismicacid）转化为色氨酸。

色氨酸浓度高，则关闭；色氨酸浓度低，则开启

⏹具弱化子（attenuator），无CAP-cAMP调控

⏹色氨酸操纵子有5个结构基因（EDCBA）及1个调节基因（R）

⏹启动子（trpP）与操纵区（trpO）在结构基因的上游，且操纵区完全在启动子里面

⏹在调控中，色氨酸的作用是帮助阻遏物结合到操纵区，从而使操纵子关闭

⏹弱化作用（attenuation）

在阻遏作用的基础上（色氨酸操纵子的阻遏作用较弱），能再降低转录水平10倍

前导区与弱化子转录物的第一种较稳定的结构有一终止子（-independentterminator），能使弱化作用发生，转录终止

转录物的第二种较不稳定的结构没有终止子，转录能继续

色氨酸的多寡决定形成哪一种结构（在转录与翻译偶联的情况下）

⏹在细菌中，当色氨酸操纵子的前导区转录后，翻译就开始

⏹核糖体到达色氨酸密码子

色氨酸缺乏，核糖体不能前进，翻译受阻，前导区与弱化子转录物只能形成第二种结构；结构基因能转录

色氨酸充足，前导肽的翻译能顺利完成，前导区与弱化子转录物能形成第一种较稳定的结构，导致弱化作用发生

⏹调控能达成的必要条件

转录与翻译偶联，且速率大致相等

每个结构基因的转录产物都有其起始密码子，核糖体从各个基因的mRNA的起始信号（密码子）开始翻译，即结构基因的翻译与前导序列的翻译无关

⏹细菌能符合这样的要求，说明其体系中各组分的协调性

3.基因表达调控的重大变化

（1）宿主RNA聚合酶的变化

⏹主要由因子的改变引起

⏹枯草杆菌（Bacillussubtilis）被其噬菌体SPO1入侵后的情况

SPO1早期基因（earlygenes）的表达

用宿主本身的RNA聚合酶，仍可有很多宿主基因表达

SPO1中期基因（middlegenes）的表达

宿主中基本上只有噬菌体的基因在表达

SPO1后期基因（lategenes）的表达

（2）T7噬菌体编码的RNA聚合酶

⏹T7基因的转录分3个阶段（在宿主E.coli中）

ClassI（共5个基因，其中一个编码一种噬菌体专一的RNA聚合酶）

ClassII

ClassIII

⏹先由宿主的RNA聚合酶，然后由T7自己的RNA聚合酶来达成3个阶段的转录

（3）芽孢形成过程的转录控制（枯草杆菌）

⏹通过变换RNA聚合酶的因子而达成

每种因子所识别的启动子都各不相同

⏹从营养（植物性）生长到产生内生孢子（芽孢）

需关闭很多营养生长期的基因，并开启专门用于芽孢形成的基因

⏹营养生长期RNA聚合酶的因子

43（A）

⏹芽孢形成时RNA聚合酶的因子

至少有29（E）、30（H）、32（C）

4）具多启动子的基因

⏹枯草杆菌的spoVG基因

芽孢形成所需的基因之一

该基因有分别被B和E识别的启动子

两个启动子互相重叠

可被含B或E的RNA聚合酶转录

⏹鱼腥蓝细菌属（Anabaena）谷酰胺（glutamine）合成酶基因（glnA）

NH4+充足时，细胞处于营养生长状态

NH4+缺乏时，会产生一些能固氮的异形胞（heterocyte）；在异形胞中，大部分营养生长的基因都关闭了，而固氮基因（nif）则开启

glnA基因在营养生长时及固氮的异形胞中都必不可少

glnA基因有两个启动子，可被不同的识别

⏹E.coli的谷酰胺合成酶基因（glnA）

NH4+充足时，RNA聚合酶用70，识别弱启动子P1

NH4+缺乏时，RNA聚合酶用54，识别强启动子P2，以合成出更多的谷酰胺（起到贮存NH4+的作用）

双启动子的意义

⏹使基因在不同情况下都可表达，或不同情况下有不同的表达强度

5）E.coli的热激基因（heatshockgenes）

⏹热激反应（heatshockresponse）

细胞处于较高的温度中所引发的反应

正常的转录减少或停止，热激反应的转录物开始产生，以降低细胞的损伤程度

⏹分子伴侣（molecularchaperon）

协助蛋白质正确折叠的一类物质（一般也是蛋白质），在热激反应中也会产生

在热激状态下，分子伴侣的作用是帮助已部分变性（折叠已发生变化）的蛋白质重新正确折叠好

⏹在热激状态下，细胞还会产生蛋白酶，以降解不能重新折叠好的蛋白质

⏹热激反应所需的基因表达重大改变也是通过更换RNA聚合酶的因子而达成

32（H）代替70（A）

H并非在热激后才产生，细胞原来已有少量的H存在，但处于一种不起作用的状态（被隔离）

受热激后，这些H能马上起作用，导致更多的H以及分子伴侣和蛋白酶的产生

（6）噬菌体对E.coli的侵染

⏹溶菌模式（lyticmode）

噬菌体DNA进入宿主细胞后，利用宿主的RNA聚合酶进行转录，进一步翻译产生噬菌体蛋白质

噬菌体DNA进行复制，从而组装出许多子一代的噬菌体

宿主细胞裂解，释放出这些子代的噬菌体

⏹溶原模式（lysogenicmode）

噬菌体DNA进入宿主细胞后，进行一些早期基因的转录和翻译

产生一种27kD的蛋白质（阻遏物，repressor），该阻遏物通过与2个操纵区结合，使得本身的大部分基因关闭，只剩下阻遏物的基因在表达

⏹噬菌体DNA整合到宿主基因组中，与宿主DNA一起复溶原菌（lysogen）

携带有整合在基因组中的噬菌体DNA的细菌

⏹原噬菌体（prophage）

整合在宿主基因组中的噬菌体DNA

⏹噬菌体的基因组

线状：

在噬菌体粒子中的存在状况，两端有粘性末端（cos）

环状：

噬菌体DNA刚进入宿主后的存在状况

⏹溶菌模式的基因表达调控

⏹三个转录阶段

前早期（immediateearly）

晚早期（delayedearly）

晚期（late）

⏹三个时期的基因在基因组中顺序排列

⏹用到抗转录终止（antitermination）机制

⏹抗转录终止（antitermination）的机制

抗终止蛋白与mRNA或DNA上的特异位点结合，再改变RNA聚合酶，使其忽略有关的终止子

与mRNA结合：

抗终止蛋白N

与DNA结合：

抗终止蛋白Q

⏹溶原模式的建立

晚早期部分基因的产物是进入溶原模式所需的

整合噬菌体DNA到宿主基因组所需的蛋白质

引起cI基因转录，产生阻遏物（cII和cIII产物的作用）

⏹cII和cIII产物的作用

cII的产物能帮助RNA聚合酶结合到PRE，从而可开始转录cro的反义RNA及cI的mRNA；前者能抑制cromRNA的作用，后者可翻译出阻遏物

cIII的产物能延迟细胞内的蛋白酶分解cII的产物

⏹溶原模式的维持与cI基因的自我调节

阻遏物（cI的产物）产生后，通过与操纵区OR和OL结合，可阻止更多的早期基因转录，又能促使RNA聚合酶以PRM为启动子转录cI基因

cI基因的产物（阻遏物）的浓度能调节cI基因本身的转录（自我调节）

⏹溶菌模式还是溶原模式？

由cI与cro基因产物的竞争结果决定

cI取胜，进入溶原模式

cro取胜，进入溶菌模式

⏹CII（cII基因的产物）的浓度决定cI与cro谁胜谁负，CII越多，越容易进入溶原模式

⏹CII的浓度又取决于细胞内蛋白酶的浓度

生长环境好（养分丰富），细胞内蛋白酶浓度高

处于饥饿状态，细胞内蛋白酶浓度低

细胞处于饥饿状态，有利于溶原模式的建立

生长环境好，有利于溶菌模式的建立

溶菌模式与溶原模式在不同条件下建立的生物学意义

⏹溶原菌进入溶菌模式的诱导

溶原菌受到化学诱变剂或辐射作用后，其原噬菌体就会进入溶菌途径

诱变导致DNA损伤，引发SOS应答（SOSresponse），其中recA基因起最重要的作用（RecA用于DNA损伤的重组修复）

诱变的环境还会使RecA成为一种辅蛋白酶（coprotease），激活阻遏物本身的蛋白酶活性，使其自我切割，从操纵区脱落，从而引发溶菌模式

四、真核生物的基因转录及其调控

1.真核生物的RNA聚合酶

⏹RNA聚合酶I（polymeraseI）

⏹位于核仁

⏹RNA聚合酶II（polymeraseII）

⏹位于核质

⏹RNA聚合酶III（polymeraseIII）

⏹位于核质

1）三种RNA聚合酶对转录抑制剂的反应

⏹-鹅膏蕈碱（-amanitin）

⏹抑制polymeraseII（低浓度）

⏹抑制polymeraseII和polymeraseIII（高浓度）

⏹放线菌素D（actinomycinD）

⏹抑制polymeraseI

（2）真核RNA聚合酶的亚基组成

⏹PolymeraseI、II、III都由多个亚基组成

⏹均有两个较大的亚基（>100kD）

⏹另有多个较小的亚基（大部分<50kD）

⏹三种聚合酶都有一些共有亚基（commonsubunit）

⏹以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的PolII为参照：

Rpb5、Rpb6、Rpb8、Rpb10、Rpb12

（3）RNA聚合酶II的结构

⏹研究得比较清楚的一种