第六章基因重组与基因工程DOC.docx
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第六章基因重组与基因工程DOC
第六章基因重组与基因工程
教学大纲要求
1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念;
2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程;
3.了解重组DNA技术在医学上的应用。
教材内容精要
一、自然界的基因转移和重组
自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的,它是基因变异和物种演变、进化的基础。
基因重组的方式有:
接合作用、转化、转导、转座。
1.接合作用(Conjugation)当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时,质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。
2.转化与转导作用
(1)转化作用(Transformation):
由外源性DNA导入宿主细胞,并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程,称为转化作用。
(2)转导作用(Transduction):
当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来,再次感染另一(受体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。
3.转座(转位)(Transposition)可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。
故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。
转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。
可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。
4.基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。
基因重组有两种类型:
位点特异的重组(sitespecialrecombmatlon)和同源重组(homologousrecomblnation)。
二、重组DNA技术’
1.重组DNA技术的相关概念
(1)DNA克隆:
克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。
DNA克隆(DNAclone):
应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子,通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增,提取获得大量同一DNA分子的过程。
DNA克隆又称基因克隆或重组DNA。
DNA克隆也指将DNA重组体引进受体细胞中,建立无性系的过程。
因此,又称为基因克隆(genecloning)、基因工程(gentreengneering)、重组DNA技术。
(2)工具酶;常用的有:
内切酶、连接酶、聚合酶I、反转录酶等。
在所有工具酶中以限制性内切核酸酶最重要。
限制性内切核酸酶(Restrictionendonuclease)是指能识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
根据组成和作用特性的不同,常用的限制性核酸内切酶可分为三类。
,重组DNA技术用到的为Ⅱ类。
其特点为:
①具有识别特异性:
识别DNA分子上特定的核苷酸序列,该序列一般呈回文结构(Palindrome),如:
E.CoRI识别的序列为5'GAATTC3'。
②具有切割特异性:
从某一特定位点或其周围切割,产生后产生粘性本端或钝性末端,如:
E.CoRI从G和A之间切开,产生两个粘性本端(5'G↑AATTC3')。
不同的限制性内切核酸酶识别DNA中的核苷酸长短不一,切割位点的多少也不同,产生的片段大小各异。
(3)目的基因:
目的基因(targetgene)是我们要研究或利用的DNA序列或基因,称为目的基因。
目的DNA有两种类型:
cDNA和基因组DNA。
cDNA(ComplementaryDNA)是以RNA为模板,经反转录合成的与RNA互补的单链DNA。
以cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。
基因组DNA(genomicDNA)是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。
(4)基因载体:
也叫克载隆体(cloningvector)是携带目的基因,实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
具有转录和翻译所必须的DNA序列,可以完成目的基因表达过程的载载体称为表达载体(expressionvector)。
作为载体,必须要有独立的复制能力,可导入宿主细胞,并且要便于检测。
常用的载体有质粒DNA、噬菌体DNA、和病毒DNA。
质粒(P1asmid)是存在于细菌染色体以外的环状DNA分子。
质粒大小适宜,拷贝数多,易于转化,利于筛选,有理想的酶切位点。
噬菌体(phage)是侵袭细菌的病毒。
常见的噬菌体有λ噬菌体和M13噬菌体。
基因工程所使用的噬菌体DNA均是经过人工改造的。
Ml3噬菌体的基因间隔区插入E.Co1i的调节基因及LacZN一端146个aa残基编码基因,其产物为β-半乳糖苷酶的α-片段。
而突变型Lac-EColi可表达β-半乳糖苷酶的ω-片段(酶的C-端),单独的α-片段及ω-片段均无β-半乳糖苷酶的活性。
当舍有LacZ的M13噬菌体转化Lac-E.coli细菌时,α-片段及ω-片段共同表达,宿主Lac—E.COli细菌才有β-半乳糖苷酶活性,使特异的作用物变为兰色化合物,生长的细菌为兰色,这就是α-互补。
可用于重组体的筛选。
如果目的基因插入lacZ基因内,则LacZ不表达,为白色菌落。
2.重组DNA技术
一个完整的DNA克隆过程包括目的基因的获取(分),克隆载体的选择和构建(切),目的基因与载体的连接(接),重组体导入受体菌(转),重组体的筛选(筛),克隆基因的表达(表)六个过程。
(1)目的基因的获取:
可以通过化学合成、文库筛选,PCR等方法获得。
基因组DNA文库(genomicDNAlibrary):
转化细菌内,由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库。
构建方法是把生物体全部的DNA提纯后,用限制性内切核酸酶,随机切割成许多片段,将所有片段均重组入同一类载体上,得到许多重组DNA分于,继而全部转入受体酋扩增,使每个细茼内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝,这样生长的全部细菌所携带的所有基因组DNA片段,即为整个基因组。
需要时用探针即可获得。
cDNA文库(cDNAlibrary)是与基因组DNA文库类似,以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的cDNA。
以总mRNA制作的cDNA文库,包含了细胞的各种mRNAcDNA。
聚合酶链反应(p01ymerasechainreaction,PCR)是DNA迅速大量扩增的方法,短时间内获得大量DNA,有利目的基因的获得。
(2)克隆载体的选择和构建:
根据不同的目的基因,选择不同的载体。
并选用限制性内切核酸酶切割目的基因和载体。
(3)目的基固与栽体的连接:
利用DNA连接酶将目的基因DNA与载体DNA连接在一起,形成重组体。
其连接方式有:
粘性末端连接、平端连接、同聚物的加尾连接和人工接头连接等。
(4)重组体导入受体菌:
即把重组DNA导入受体菌的过程。
根据载体的性质不同导入方式有:
转化、转染、感染等早入方法如下:
选择适当的受体茵。
符合安全标准,为限制酶和重组酶缺陷型。
感受态细胞(competentcell):
具备接受外源DNA的能力的经过特殊方法处理的受体菌。
(5)重组体的筛选:
筛选出含重组DNA的受体菌,有直接筛选法和非直接筛选法。
抗药性标志选择,标志补救及分子杂交属直接选择法;免疫化学湘酶联免疫检测法属非直接选择法。
通过转化、转染、感染等,导入重组体的受体细胞,经过培养得到大量的菌落或噬菌斑,因为每一个重组体只携带某一段外源基因,转化或转染时,每一受体菌仅接受一个重组体分子,所以要将它们区分,并鉴定那一菌落,含有带目的基因的重组体。
即得到目的基因克隆。
(6)克隆基因的表达:
可以生成有价值的蛋白质或多肽。
原核生物表达体系;E.coil是最常见的。
运用E.COti表达有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合以下标准:
舍有大肠杆菌适宜的选择标志,具有强启动子,舍有适当的翻译控制序列,合有合理设计的多接头克隆位点。
真核表达体系常见的有酵母、昆虫、哺乳类细胞等。
3.重组DNA技术与医学的关系:
现代分子医学是重组DNA技术及其他分子遗传学技术、理论与医学实践相结合的结果,特别是在疾病基因的发现、发展生物制药、DNA诊断、基因治疗、遗传病的预防等方面有重要意义。
[测试题]
一、名词解释
1.基因工程
3.转化作用
4.转导作用
5.同源重组
6.限制性核酸内切酶
7.回文结构
8.目的DNA
9.互补DNA
10.克隆载体
11.表达载体
12.质粒
13.α-互补
14.基因组DNA文库
15.感受态细胞
16.cDNA文库
二、填空题
1.自然界的常见基因转移方式有、、、。
2.不同DNA分子间发生的共价连接称为,有、两种方式。
3.由和介导的基因移位或重排称为转座。
4.基因工程的载体必须具备的条件有、、。
5.限制性内切核酸酶识别的核苷酸序列的个数为、和——,其切口有端和端。
6.基因工程常用的载体DNA分子有、和。
7.一个完整的DNA克隆过程应包括、、、、。
8.目的基因获取的途径或来源有、、、。
9.基因工程过程中重组体直接筛选法的方式有、、。
10.基因克隆真核生物表达体系常见的有、、表达体系。
11.根据重组体DNA的性质不同,将重组体DNA导人受体细胞的方式有、、等。
12.如果Mi:
的外源基因被插入到lacz基因内,则在含有X-gal的培养基上生长时会出现色菌落,如果在1acz基因内无外源基因插入,在同样的条件下呈现色菌落。
13.重组DNA技术中常用的工具酶有、、、。
三、选择题
A型题
1.cDNA文库包含
A.一个物种的全部基因信息
B.一个物种的全部mRNA信息
C.一个生物体组织或细胞的全部基因信息
D.一个生物体组织或细胞的全部mRNA信息
E.一个生物体组织或细胞所表达mRNA信息
2.关于接合作用正确的是
A.细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时,染色体DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)
B.细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时,某些较大质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)
C.细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时,噬菌体DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)
D.细胞与细胞或细菌通过苗毛相互接触时,所有类型的质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)
E.细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时,所有类型的噬菌体DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)
3.基因工程的特点是:
A.在分子水平上操作,在分子水平上表达
B.在分子水平上操作,在细胞水平上表达
C.在细胞水平上操作,在分子水平上表达
D.在细胞水平上操作,在细胞水平上表达
E.以上均可以
4.实验室内常用的连接外源性DNA和载体DNA的酶是:
A.DNA连接酶B.DNA聚合酶IC.DNA聚合酶1
D.DNA聚合酶IE.反转录酶
5.用来鉴定DNA的技术是:
A.Northern印迹B。
Southern印迹C.Western印迹
D.亲和层析E.离子交换层析
6.用来鉴定RNA的技术是:
A.Northern印迹B。
Southern印迹
E.Western印迹D.亲和层析E.离子交换层析
7.重组DNA技术中常用的工具酶下列那项不是:
A.限制性核酸内切酶B.DNA连接酶C.DNA聚合酶I
D.RNA聚合酶E.反转录酶
8.F一细胞与F十细胞混合培养,产生F+细胞的过程为:
A.转化B.转导C接合n突变E.转位
9.DNA致癌病毒感染宿主细胞后,使之发生癌变是因为发生了:
A.转化B.转导E.接合D.转座E.转位
10.关于基因工程的叙述,不正确的是:
A.根据实验目的选择目的基因
B.选择一个适合的载体
C.把目的基因和载体分别用限制性核酸内切酶切开
D.连接酶只连接目的基因和载体
E.把重组体转化到细胞中去的过程不是绝对的
11.限制性核酸内切酶不具有那项特点:
‘
A.仅存在原核细胞中
B.用于重组DNA技术中的为I类酶
C.能识别双链DNA中特定的碱基顺序
D.具有一定的外切酶活性
E.辨认的核苷酸序列常具有回文结构NA片段,与适当载体连接后转入受体菌,扩增为eDNA文库,因此eDNA文
12.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是[答案JE
A.正,coli表达体系B.原核表达体系C.酵母表达体系
D.昆虫表达体系E.哺乳类细胞表达体系
13.限制性核酸内切酶切割DNA后产生E
A.3'磷酸基末端和5'羟基末端B.5'磷酸基末端和3'羟基末端
C.3'磷酸基末端和5'磷酸基末端D.5'羟基末端和3'羟基末端
E.3'羟基末端、5'羟基末端及磷酸
14.下列描述最能确切表达质粒DNA作为克隆载体特性的是[答案]D
A.小型环状双链DNA分子B.携带有某些抗性基因
C.在细胞分裂时恒定地传给子代细胞D.具有自我复制功能
E.获得目的基因
15.在分子生物学领域,分子克隆主要是指
A.DNA的大量复制B.DNA的大量转录
C.DNA的大量剪切U.RNA的大量反转录
E.RNA的大量剪切
16.在重组DNA技术中,不常用到的酶是
A.限制性核酸内切酶B.DNA聚合酶C.DNA连接酶
D.反转录酶E.DNA解链酶
17.多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为
A.乎头末端B.3'突出末端C.5'突出末端
D.粘性末端E.缺口末端
18.cDNA是指
A在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA
D.在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA
C在体外经转录合成的与DNA互补的RNA
D.在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA
E.在体内经转录合成的与DNA互补的RNA
19.基因组代表一个细胞或生物体的
A部分遗传信息B.整套遗传信息c-可转录基因
D.非转录基因E可表达基因
20.在基因工程中通常所使用的质粒存在于
A.细菌染色体B.酵母染色体C.细菌染色体外
D.酵母染色体外E.以上都不是
21.在已知序列信息的情况下,获取目的基因的最方便方法是
A.化学合成法B.基因组文库抹C.cDNA文库法
D.聚合酶链反应E.差异显示法
22.重组DNA的基本构建过程是将
A.任意两段DNA接在一起B.外源UNA.接人人体叫A
C.目的基因接入适当载体D.目的基因接入哺乳类DNA
E.外源基因接人宿主基因
23.如果某限制性核酸内切酶识别的碱基序列为6个,则24Kb的一段随机的DNA序列出现的切口数为;
A.4次B.5次C.6次D.7次E.8次
24.关于限制性核酸内切酶的叙述,下列那项是错误的:
A.限制性核酸内切酶分为三类,用于基因工程的为1酶
B.限制性核酸内切酶切割后可产生枯性末端或平端
C.识别的核苷酸序列个数可以是6个或8个
D.识别的序列一般具有回文结构
E.识别的DNA为单链
25.关于基因工程的叙述,下列那项是错误的?
A.基因工程也称基因克隆
B.只有质粒DNA可作为载体
C.重组体DNA转化或转染宿主细胞
D.需获得目的基因
E.需对重组DNA进行纯化、筛选
26.有关质粒的叙述,下列那项是错误的?
A.小型环状双链DNA分子
B.可小到2~3Kb,大到数百个Kb
C.能在宿主细胞中独立自主地进行复制
D.常含有耐药基因
E.只有一种限制性核酸内切酶切口
27.下列那项不是重组DNA的连接方式?
A.粘性末端与粘性末端的连接B.平端与平端的连接
C.粘性末端与平端的连接D.人工接头连接
E.同聚物加尾连接
28。
关于基因重组的叙述,错误的是:
A.整段的DNA不能在细胞内进行交换
B.整段的DNA能在细胞内进行交换
C.整段的DNA能在不同的物种间进行交换
D.交换的DNA能在新的位置上进行复制、转录、翻译
E.基因重组可引起自然突变现象
29.基因重组的方式不包括:
A.转化B.转导C.转位D.转换E.整合
30.EcoRI切割DNA双链产生
A.平端B.5’突出粘端C.3’突出粘端
D.钝性末端E.配伍末端
31.催化聚合酶链反应的酶是
A.DNA连接酶B.反转录酶C.末端转移酶
D.碱性磷酸酶E.TaqDNA聚合酶
32.将PstI内切酶切割后的目的基因与用相同内切酶切割后的载体4A连接属
A.同聚物加尾连接B.人工接头连接C平端连接
D.粘性末端连接E.非粘性末端连接
33.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是
A.DN~N聚合酶B.RNA聚合酶·C,DNA连接酶
0.RNA连接酶E.限制性核酸内切酶
34.以质粒为载体,将外源基因导入受体菌的过程称
A.转化B.转染E.感染D.转导E.转位
35.最常用的筛选转化细菌是否含质粒的方法是
A.营养互补筛选B.抗药性筛选E.免疫化学筛选
D.KR筛选E.分子杂交筛选
36.α-互补筛选法属于
A.抗药性标志筛选B.酶联免疫筛选C.标志补救筛选
D.原位杂交筛选E.免疫化学筛选
37.列常用于原核表达体系的是
A.酵母细胞B。
昆虫细胞C.D船L类细胞D.真菌E.大肠杆菌
38.在对目的基因和载体DNA进行同聚物加尾时,需采用
A.反转录酶D.多聚核昔酸激酶C.引物酶
D.RNA聚合酶E.末端转移酶
39.DNA克隆不包括下列那项步骤?
A.选择一个适合的载体
B.限制性核酸内切酶在特异位点裂解质粒和目的基因
C.用连接酶连接载体DNA和目的DNA,形成重组体
D.用载体的相应抗生素抗性筛选含重组体的细菌’
E.重组体用融合法导人细胞
40.下列那项不能作为表达载体导人真核细胞的方法?
A.磷酸钙转染B.电穿孔C.脂质体转染
D.显微注射E.氯化钙转染
41.下列那项不能作为基因工程重组体的筛选方法?
A.抗药性标志选择B.宿主菌的营养缺陷标志补救
C.原位杂交D.Southern印
A.将琼脂培养板上的转化子茵落经蒸汽裂解释放抗原
B.将固定目的基因编码蛋白质的抗血清聚乙烯薄膜覆盖在裂解菌落上
E.再使用’’P标记的DNA探针与薄膜反应
D.经放射自显影检出阳性反应菌落
E.免疫学方法特异性强、灵敏度高,尤其适用于选择不为宿主菌提供任何选择标志的基因
42.重组DNA技术不能应用于:
A.疾病基因的发现B.生物制药C.DNA序列分析
D.基因诊断E.基因治疗
43.基因重组是指DNA分子的:
A.共价连接且氢键连接巴离子键连接D.交换E.退火
44.下列那种药物不能用基因工程的方法生产?
A.胰岛素B.干扰素C.白细胞介素
D.性激素E.促红细胞生成素
45.DNA重组技术不能应用于下列哪个方面?
A.产前诊断B.携带者测试C.症候前诊断
D.遗传病的易感性E.传染病的传染性
46.一种可靠的DNA诊断学方法,下列那项是不必符合的?
A.能正确扩增靶基因
B.能准确区分单个碱基的差别
C.本底或噪声低,不干扰DNA的鉴定
D.便于完全自动化操作
E.方法简便,易于推广应用
47.关于转化错误的是:
A.受体细胞获得新的遗传表型
B.外源DNA一定整合进受体细胞基因组
C.自然界中较大的外源DNA转化几率较低
D.自然界中较大的外源DNA转化几率较高
E.越大的外源DNA与染色体整合几宰越低
48.关于同源重组不正确的是:
A.同源重组不需要特异的DNA序列
B.同源重组要求两分子间序列必须相同。
C.ReeB;CD具有内切酶和解旋酶活性·
D.Holliday中间体的形成,是同源重组的重要步骤
EPCR技术
49.下列那种酶是重组DNA技术中最重要的?
A.反转录酶B.碱性磷酸酶巴末端转移酶
D.DNA聚合酶[E.DNA连接酶
50.重组DNA技术常用的限制性核酸内切酶为
A.I类酶B.Ⅱ类酶C.Ⅲ类酶D.Ⅳ类酶E.V类酶
51.在分子生物学领域,分子克隆专指
A.细胞克隆B.RNA克隆C.DNA克隆
D.抗体克隆E.n~RNA克隆
52.用于重组DNA的限制性核酸内切酶识别核苷酸序列的
A.正超螺旋结构B.负超螺旋结构C.α-螺旋结构
D.回文结构E.锌指结构
53.在基因工程中通常所使用的质粒是
A.细菌的染色体DNAB.细菌染色体外的DNA
E.病毒染色体DNAn病毒染色体外的DNA
E.噬菌体DNA
54.构建基因组DNA文库时,首先需分离细胞的
A.染色体DNAE.线粒体DNAC.总mRNA
D.tRNAE.rRNA
55.建cDNA文库时,首先需分离细胞的
A.染色体DNAB.线粒体DNAC.总mRNA
D.tRNAE.rRNA
56.设计聚合酶链反应的引物时,应考虑引物与模板的
A.5'端特定序列互补B.5'端任意序列互补
C.3'端特定序列互补D.3'端任意序列互补
E.中间序列互补
57.用于鉴定转化子细胞是否含重组DNA的最常用方法是
A.抗药性选择B.分子杂交选择C.RNA反转录
D.免疫学方法E.体外翻译
58.限制性核酸内切酶酶切后的DNA末端最常见的是:
A.平头末端B.3,突出末端C.5’突出末端D.粘性末堵E.缺口末端
59.能识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶称为:
A.DNA内切酶B.限制性内切核酸酶
E.非限制性内切核酸酶D.限制性外切棱酸酶
E.非限制性外切核酸酶
60.cDNA是指:
A.在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA
B.在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA
C.在体外经反转录合成的与RNA互补的RNA
D.在体内经反转录合成的与RNA互补的RNA·
E.在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA
61.基因工程中通常使用的质粒存在于:
A.细菌染色体B.酵母染色体C。
细菌染色体外
D.酵母染色体外E.以上均不是·
62.质粒的分子结构是:
A.环状双链DNAB.环状单链DNAC.环状单链RNA
D.线状双链DNAE.线状单链DNA
B型题
(1—3)
A.抗药性选择B.分子杂交选择C.RNA反转录
D.免疫学方法E.体外翻译
1.用于鉴定是否有质粒转入受体菌的一般方法是
2.用于鉴定转化子细胞是否含目的基因的常用方法是
3.利用目的基因表达产物的特异性抗体来筛选含目的基因的转化子
胞的方法是
(4—6)
A.限制性核酸内切酶B.DNA连接酶C.反转录酶
D.TaqDNA聚合酶E.碱性磷酸酶
4.识别DNA回文结构井对其双链进行切割的是
5.用于聚合酶链反应的酶是
6.将目的基因与载体DNA进行拼接的酶是
(7—8)
A.支原体B.衣原体C.
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