人类诱导性多能干细胞1115.docx

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人类诱导性多能干细胞1115

人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）

技术指导手册

目录：

1.前言

iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。

其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminilietal2008）。

2006年Yamanaka和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc,和Klf4，Yamanaka因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。

2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashietal;Yuetal,2007）。

由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。

随后，iPS细胞的研究日新月异。

.近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。

一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。

斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。

目前，公司提供两种人类iPS细胞系，分别由4因子和6因子所诱导，方便科研工作者做后续的研究。

细胞系名称

货号

SiDSH-01

HIPS-01

SiDSH-03

HIPS-03

另外，对于新手提供初学者试剂盒：

名称

货号

包装

人类胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒

HESM-1KT

1kit

小鼠胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒

MESM-1KT

1kit

人类诱导多能干细胞产生初学者试剂盒

HiPS-1KT

1kit

小鼠诱导多能干细胞产生初学者试剂盒

MiPS-1KT

1kit

这些产品都是经过严格的质控，为您科研的成功提供了基本的保证。

2.人类胚胎成纤维细胞培养

材料：

✓人胚肺成纤维细胞：

货号SDSC-07，SDSC-08规格1*106/支；

✓人类胎儿包皮成纤维细胞：

货号SDSC-17，规格1*106/支；

✓0.25%trypsin：

胰酶，Sidansai，货号M-005-1，M-005-2；

✓含10%FBS的DMEM：

成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：

EFM-01。

实验步骤：

人类成纤维细胞培养及传代方法基本与293T细胞相同。

先吸弃废液，用0.25%Trypsin消化（一般T25瓶加1ml即可），放培养箱3－5分钟，待细胞大部分脱落时就可加含FBS的DMEM培养液终止消化，反复吹打至细胞至单细胞悬浮液即可。

传代比例为1：

3－1：

5。

Point

Ø此细胞系消化时间比293T细胞稍长，请不要在加入Trypsin后马上拍打使其脱落，否则会导致细胞结块，吹打不散。

Ø细胞传代比例大概为1：

3-1：

5，不能传得太稀，否则不易生长甚至停止生长。

Ø传代间隔时间为3－4天。

3.重编程载体构建

用于重编程的病毒载体，其构建方法与普通载体构建的方法基本相同，一般用慢病毒、腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体：

质粒名称

货号

iPS慢病毒载体

Lenti-oct4-GFP

PlvO-01

Lenti-sox2-GFP

PlvO-02

Lenti-cMyc-GFP

PlvO-03

Lenti-klf4-GFP

PlvO-04

Lenti-nanog-GFP

PlvO-05

Lenti-lin28-GFP

PlvO-06

Lenti-SV40LT-GFP

PlvO-07

iPS腺病毒载体

Ad-Oct4-GFP

pAD-01

Ad-Sox2-GFP

pAD-02

Ad-cMyc-GFP

pAD-03

Ad-Klf4-GFP

pAD-04

Ad-Nanog-GFP

pAD-05

Ad-Lin28-GFP

pAD-06

Ad-Htert-GFP

pAD-07

4.病毒包装

材料：

✓293T细胞：

Sidansai，货号Plv-C-01

✓转染试剂Fugene：

Roche，货号4709713001

实验步骤

1．包装细胞铺板：

①.传代293T细胞前将T75培养瓶用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，于37°C培养箱放置10min以上。

②.传代293T细胞

将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37°C培养箱中3min，取出，轻轻摇晃可发现细胞开始脱离瓶底，待其全部脱落，加入3mL37°C水浴中预热的培养液，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。

之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ulDMEM培养液，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。

计数板上共4大格，每大格16小格。

计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。

③.铺细胞前，用明胶包被的培养瓶取出，轻晃使明胶将瓶底完全覆盖，之后吸净剩余的明胶，即可将细胞铺上。

细胞数量为1000万/T75，最后加新鲜培养液至总体积为10ml。

）

2.转染：

第二天做转染前先观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。

转染前无需换培养基。

做脂转complex：

OptiMEM需在37°C水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。

转染每瓶T75的complex成分如下：

含cDNA的lv质粒：

10ug

pVSVG：

5ug

delta8.91：

7.5ug

optiMEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ulFugene转染试剂，加至optiMEM液面之下，吹打3-4次。

再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。

晃匀后，最好隔2-4h后再取出培养瓶晃匀一次。

3．收集病毒：

转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％DMEM培养液10mL，即开始收集病毒。

分别收集转染后48-96h的病毒上清，收集后可置于4°C冰箱短期保存。

4．病毒滴度测定：

收集病毒后即可测病毒滴度（悬浮感染）：

①.在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，每孔加入200ul明胶）。

②.消化293T细胞（步骤1.2），24孔板每孔铺被15万细胞。

可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000polybrene（终浓度为10ug/mL），混匀，每孔加入500ul/15万细胞即可。

③.将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。

分别取2ul或者5ul病毒上清至上述步骤中的24孔板一孔中，摇匀后放入培养箱中。

48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。

5．病毒滴度确定：

①.15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。

②.将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。

用PBS涮3次。

加入4％PFA室温固定30min,24孔板每孔200ul。

③．用PBT洗2次，每次3分钟。

④．PBS将DAPI1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。

⑤．PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。

⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积×1.5×105×103

6．停止收集病毒上清，用75％酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去。

7．病毒在感染目的细胞前用0.45um滤膜过滤后，预热方可使用。

我们提供的主要包装病毒：

病毒种类

携带基因

货号

包装

慢病毒

Oct4

LV-01

1×107

Sox2

LV-02

1×107

Nanog

LV-03

1×107

Lin28

LV-04

1×107

c-Myc

LV-05

1×107

Klf4

LV-06

1×107

SV40LT

LV-07

1×107

4factorsmixture

Lv-mix-4

2×107

6factorsmixture

Lv-mix-6

2×107

腺病毒

Oct4

AD-01

1×108

Sox2

AD-02

1×108

Nanog

AD-03

1×108

Lin28

AD-04

1×108

c-Myc

AD-05

1×108

Klf4

AD-06

1×108

SV40LT

AD-07

1×108

此外，我们还提供相关的病毒包装培训，为期1周。

学成后方便迅速搭建平台。

5.人类iPS细胞的诱导

材料：

✓已经测定好滴度的慢病毒（以6种为例）

✓体细胞（以人类胎儿包皮成纤维细胞为例）货号：

Sidansai，SDSC-17

✓助转剂polybrene：

Sidansai，货号M-020

✓胰酶：

Sidansai，货号M-005-2

✓0.1%gelatin：

明胶，Sidansai，货号M-004

✓DMEM（含10%FBS）培养液：

成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：

EFM-01

✓滋养层细胞（CF-1MEFcells）：

Sidansai，货号MEF-CF1-01

✓人类胚胎干细胞培养液：

Sidansai，货号HESM-01-500

✓人类胚胎干细胞条件培养基：

Sidansai，货号HESCM-01-100

✓基质胶：

Sidansai，货号M-002

Point：

Ø6种病毒所含基因分别为：

OCT4,NANOG,SOX2,LIN28,C-MYC,KLF4;

Ø由预实验可知，慢病毒感染MRC-5细胞的比例为10：

1（即10个病毒颗粒对应一个细胞时所有的细胞均能被感染上）。

Ø病毒感染可分悬浮感染和贴壁感染两种，两种方法均可行，不影响感染效率，细胞生长不受影响，故均可用。

Ø开始病毒感染实验以前，请先准备好滋养层细胞（MEF）。

病毒感染步骤：

（悬浮感染方案）

a.先用0.1%gelatin预包被一个T25瓶，包被时间约为10min。

b.待细胞生长良好时，用0.25%trypsin消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数（具体过程见成纤维细胞培养protocol）。

之后取出用于感染实验所需的细胞量（比如1×105）。

c.若感染1×105的细胞，以感染比例10：

1计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45um过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，避免对后续实验的影响。

d.然后将1×105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5ul助转剂polybrene（使用浓度为10ug/ml），将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25瓶中,摇匀后放入37°C培养箱中，过夜。

e.病毒感染24小时后（第1天），将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的MEF上。

按T75瓶每瓶铺5×104的细胞，铺2个T75瓶即可。

f.第2天，将DMEM培养液换成hESC培养液，继续培养。

以后每2天换液一次。

g.逐日观察，待细胞长至第5－7天时，可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集在一起。

h.直至第12天，由于MEF使用时间过长，故培养液换成CM（conditionedmedium）+HES（hESC正常培养液）的1:

1混合液,以提供给细胞充足的营养。

i.待细胞长至第20天左右，可以挑克隆，将ES-likeclone挑至新的MEF上，按hESC培养方法继续培养，扩增。

IPS克隆与正常的人类胚胎干细胞在形态上基本无异。

6.iPS细胞鉴定

●iPS细胞的鉴定主要包括以下几种：

●碱性磷酸酶活性检测

●干细胞表面marker的免疫染色检测

●干性因子的去甲基化分析

●干细胞内源基因的表达分析

●端粒酶活性检测

●核型检测

●拟胚体形成

●畸胎瘤形成实验

下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：

6.1．碱性磷酸酶活性检测

材料

✓PBSbuffer

✓4%Paraformaldehyde

✓AlkalinePhosphataseDetectionKit：

Sidansai，货号AP-1kit

✓1xRinseBuffer（e.g.TBST:

20mMTris-HCl,pH7.4,0.15MNaCl,0.05%Tween-20）

碱性磷酸酶染色步骤：

a.AspiratemediaandfixESoriPScellswithafixative（e.g.4%ParaformaldehydeinPBS）for1-2minutes.Note:

Donotoverfix.Fixingcellslongerthan2minuteswillresultintheinactivationofalkalinephosphatase.

b.AspiratefixativeandrinsewithPBSbuffer.

c.Aspirateandrinsewith1XRinseBuffer.DONOTallowwellstodry.

d.PreparereagentsforAlkalinePhosphatasestaining（BufferA:

BufferB:

BufferC=100:

38:

28）

e.Addenoughstainsolutiontocovereachwell（e.g.0.5mLforawellofa24-wellplate）.Incubateindarkatroomtemperaturefor15minutes.

f.Aspiratestainingsolutionandrinsewellswith1XRinseBuffer.Covercellswith1XPBStopreventdryingandthencountthenumberofcoloniesexpressingAP（redstemcellcolonies）,versusthenumberofdifferentiatedcolonies（colorless）.

6.2.干细胞表面marker的免疫染色检测

可用的试剂盒包括：

货号

包装

所鉴定的抗体

A-P1-1KT

10test

Oct4，Sox2，Nanog，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81

A-P2-1KT

10test

Oct4，Sox2，Nanog，SSEA1，SSEA3，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81

A-P3-1KT

10test

Oct4，Nanog，Sox2，SSEA1

表达于人类ES/iPS细胞中的标志物包括：

Stage-specificembryonicantigen-3（SSEA3）

Stage-specificembryonicantigen-4（SSEA4）

Tumor-relatedantigen-1-60（TRA-1-60）

Tumor-relatedantigen-1-81（TRA-1-81）

OCT4

SOX2

Nanog

表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括：

Stagespecificembryonicantigen-1（SSEA-1）

OCT4

SOX2

Nanog

免疫染色步骤：

1.首先把细胞固定在4％多聚甲醛（4％PFA）中，室温放置30min;

2.在无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）

注意：

此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA和Tra等

3.将上述溶液吸干，先用1XPBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于PBS）洗涤两次；

4.（此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含1%BSA+4%normalserum+0.4%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；

5.将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜；

6.用PBT（0.1%TritonX100）洗涤细胞3－5次；

7.将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h;

注意：

从步骤7开始，样品要注意避光！

8.用PBT洗涤3次；

9.将DAPI（1mg/mlinPBS）母液以1:

1000用PBS稀释,室温放置5min;

OR:

将JASMIN（hochest）母液以1:

1000用PBS稀释，室温放置5min;

10.用PBS洗涤5min,两次；

11.再用4％多聚甲醛室温固定30min；

12.最后再用PBS洗涤两次，每次5min.

6.3干性因子的去甲基化程度分析

BisulphiteSquencing法分析甲基化状态

（一）Bisulphite处理基因组DNA

1、将基因组DNA置于冰上，液体石蜡冰上预冷。

2、给每个样品准备6个Ep管，每管加300ul液体石蜡。

3、准备样品：

1）每个样品取210ng的DNA，稀释到21ul。

2）新配2M的NaOH（用超纯水配，1.6gNaOH/20ml水），每管样品中加4ul（使之终浓度为0.3M）NaOH。

3）50℃，15min。

4、准备2％低熔点argrose：

0.02g/ml，用双蒸水配。

100℃5min，之后置于50℃待用。

5、向3中的DNA液中加入50ul2％低熔点argrose，混匀（保持50℃）。

6、吸取上述argose和DNA混合液，加10ul/管于第二步预冷的矿物油中。

冰上至少30min，使beads坚硬。

7、向beads中加入500ul2.5MSodiummetabisulphite（新配），摇匀，使beads位于分层上。

离心甩一下。

8、50℃避光反应4h～12h，不超过16h～18h（一般12h）。

附：

Sodiummetabisulphite的配制总体积：

20ml

I.Hydroquinone220mg

H2O2ml

50℃避光溶解（黄红色）

II.Sodiumbisulphate7.6g

H2O8ml

2MNaOH5ml

50℃避光溶解，每隔10min晃一次，溶30min

I，II分别配好后，在暗处混合，混合后颜色变浅，降为室温即可使用。

终止反应，洗脱：

1、1mlTEph8.0洗3次，10min/次。

2、0.5ml0.2MNaOH洗2次，每次15min（时间不可缩短）。

3、1mlTEph8.0洗3次，10min/次。

4、每管beads加100ulTE，4℃保存。

（二）BisulphitePCR

方式：

巢式PCR

引物：

2对

第一轮outside-forward，outside-reverse；

第二轮inside-forward，inside-reverse

体系：

1stround

（25µl）

ddH2O8.3

10×buffer2.5

Primers（10µM）*2.0*outside-F+R

dNTP（10mM）2.0

rTaq0.2

template（beads）10.0

94℃5min

94℃30s

55~60℃*45s*退火温度根据引物设定

72℃50s

72℃7min

2ndround

（50µl）

ddH2O35.5

10×buffer5.0

Primers（10µM）*4.0*inside-F+R

dNTP（10mM）4.0

rTaq0.5

template1.0

94℃5min

94℃30s

55~60℃*45s*退火温度根据引物设定

72℃50s

72℃7min

注意事项：

1、第一轮的模板为beads，吸出的时候要小心，防止滑落或者弄碎。

在其他都加好之后再加beads。

2、第二轮的模板是第一轮反应的产物，为胶状，加入之前应在55度化开。

（三）纯化PCR产物（参见相关Kit说明书）

（四）连接至T-vector

体系：

基本按照T-vector说明书，SolutionI的体积应占总体积的一半，T-vector每个反应0.5ul。

比如，PCR产物浓度高时可用以下体系（PCR产物浓度较低时适当增加体积）：

Insert（纯化好的PCR产物）3ul

T-vector0.5ul

SolutionI3.5ul

16℃连接过夜，第二天转化。

最后挑克隆，抽质粒并且送测序即可。

6.4干细胞内源基因的表达分析

实时定量PCR检测内外源基因的表达

6.4.1抽提RNA

1.将培养板每孔上清吸掉，用移液管加500μlTRIZOL反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，收集到1.5ml离心管中（也可将细胞收集在离心管中后再用TRIZOL裂解）。

2.每500μlTRIZOL加0.1ml氯仿。

盖紧样品管盖，用力摇晃试管15秒并将其在室温孵育2-3分钟。

在2-8℃下12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。

离心后混合物分成三层：

下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。

RNA无一例外地存在于水样层当中。

水样层的容量大约为所加TRIZOL容量的50%。

3.将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。

最初均化时的每500lμlTRIZOL对应0.25ml异丙醇。

将混合的样品在15-30℃条件下孵育10分钟并在2-8℃下12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。

RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4.移去上层悬液。

用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每500μl的TRIZOL加0.5ml的75%乙醇。

旋涡振荡混合样品并在2-8℃下以7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。

5.在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。

取DEPC水来溶解RNA，并在55-60℃