植物学研究中染色体分选技术的运用.docx
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植物学研究中染色体分选技术的运用
植物学研究中染色体分选技术的运用
摘要:
介绍了染色体分选技术的基本原理和样品处理的基本流程,对根尖分生区采用同步化处理,制备染色体悬浮液,最后通过流式细胞仪的分析与收集获得纯度高、数量多的目标染色体。
综述了染色体分选技术在植物学研究中的主要应用,包括物理图谱的构建、DNA分子标记的开发、以及复杂多倍体植物的基因组测序等。
通过染色体分选技术的不断完善与发展,应用于染色体分选的探针标记不断开发,以及分选后的染色体DNA纯化和扩增技术的优化,将为多倍体植物如甘蔗等基因组学研究提供更有效的帮助。
关键词:
染色体分选;流式细胞术;基因组;多倍体植物;
Abstract:
Thebasicprincipleofchromosomesortingtechnologyandthebasicprocessofsampletreatmentwereintroduced.Thechromosomesuspensionwaspreparedbysynchronizingtheapicalmeristem.Andthenthetargetchromosomeswithhighpurityandhighquantitywereobtainedbyflowcytometry.Themainapplicationsofchromosomesortingtechnologyinplantswerereviewed,includingtheconstructionofphysicalmaps,thedevelopmentofDNAmolecularmarkers,andgenomesequenceofthecomplexpolyploidplant.Withthecontinuousimprovementanddevelopmentofchromosomesortingtechnology,thedevelopmentofprobemarkersforchromosomesortingandtheoptimizationofchromosomeDNApurificationandamplificationtechnologyaftersorted,itwillprovidemoreeffectivehelpforthegenomicsresearchofpolyploidplantssuchassugarcane.
Keyword:
Chromosomesorted;Flowcytometry;Genome;Polyploidplant;
染色体分选技术是一种基于流式细胞仪在经细胞周期同步化富集中期染色体的悬浮液中快速分析、分选染色体的有效手段。
起初,在人类基因组计划方面研究比较多【2】,在植物方面研究很少。
随着高质量的植物染色体悬浮液的成功制备,植物染色体分选技术的研究获得了快速发展。
国外在染色体分选方面的研究报道较多,特别是捷克、美国、澳大利亚等国家,而国内鲜有报道。
国际小麦基因组测序联盟(InternationalWheatGenomeSequencingConsortium,IWGSC)提出将小麦基因组分离为染色体或染色体臂组成,并构建相应的BAC文库。
后续BAC测序和物理图谱的构建由IWGSC成员国分担,我国主要是负责7DL物理图谱构建。
通过这种"化整为零";的方法,IWGSC完成了小麦染色体的物理作图,并使基因组测序得以完成。
受此鼓舞,染色体分选技术在复杂基因组植物中的应用越来越广泛。
通过对基因组中各条染色体的分选来完成全基因组的测序,不仅解决了组装困难的问题,而且可以进一步研究基因组的结构和进化,并且可以分离出感兴趣的一条或多条染色体进行精细研究。
染色体的分离使得我们可以用感兴趣的基因分析染色体,例如,由于小麦基因组的高度复杂性和多倍体性阻碍了基因定位的克隆和靶标记的开发。
通过对分选得到的小麦7A、7B和7D染色体的精细研究,最终从小麦染色体臂7DS上成功克隆了俄罗斯小麦抗蚜虫基因Dn2401并开发出11个新的与基因相关的标记。
自然界中高等植物的多倍化现象较为普遍,对其全基因组测序和组装还存在困难,因此采用染色体分选技术是一种不错的选择。
流式细胞术(flowcytometry,FCM)作为分子生物学应用最广、最普遍的细胞定量分析技术,具有精确、高效的优点,是根据液体悬浮液细胞或其他生物大分子的理化性质与光学参数进行功能水平上的精确收集与分析,从而实现对目标颗粒群体进行快速、准确的分析和分选。
早期流式细胞术在植物染色体分选中采用的是单色标记,即只用一种荧光标记物标记悬浮液中的染色体,这样染色体的大小可用荧光信号值的强弱来表示,这种荧光信号最终在计算机上表现为数值的大小,形态大小相近的染色体聚集在一起就形成峰或点,不同的染色体因自身的长短、形态而聚集成不同的峰或点,从而达到分选染色体的目的。
但是这种分选方式要求被分选的植物染色体形态必须差异大,然而,大多数植物的染色体间形态往往差异没那么大,因此采用单色标记法常常难以分选到感兴趣的染色体。
使染色体分选技术得到迅速发展的原因是悬浮液荧光原位杂交技术与染色体分选的结合。
研究人员通过设计探针,给目标染色体标记荧光信号,从而能够分选感兴趣的染色体进行研究。
这种利用双色标记进行流式核型分析的方法在植物染色体分析中发挥了强大的优势,对完成小麦基因组测序工作发挥重要作用。
目前,流式细胞术在植物染色体上的应用不仅体现在流式核型分析方面,也表现在目标染色体物理图谱的构建、遗传学标记的开发以及染色体测序等相关研究。
1、流式细胞术染色体分选的基本原理
流式细胞术是根据细胞理化性质,对悬浮液中的细胞群体进行快速、准确地分析与分选。
早期其主要应用于动物细胞研究,而在植物细胞学研究的应用较晚,原因是植物细胞结构与动物细胞不同,具有细胞壁和特殊的细胞器,制备单细胞悬浮液比较困难。
流式细胞术广泛应用于DNA含量、检测细胞凋亡、植物细胞周期、染色体核型和流式分子表型分析等方面研究分析。
流式细胞术分选染色体的基本原理是把经细胞周期同步化后的根尖组织进行酶解或进行机械匀浆,制成染色体悬浮液,在其中加入荧光标记探针与靶染色体进行杂交,制成荧光染色体悬浮液。
然后,将其加入到流式细胞仪中,在鞘液带动下高速通过光学检测系统,流式细胞仪中荧光信号的相对强度表现为染色体的含量。
通过流式细胞仪可以将荧光标记的染色体信息可视化地表现在电脑上,结果可以用染色体分布的一维直方图或二维散点图表示(分别是柱状图或散点图)。
在一维直方图中,不同的染色体在分布范围内形成不一样的峰值,每种峰值都代表一种染色体大小的差异;而在二维散点图中,不同的染色体形成不同的簇。
通过染色体DNA含量和碱基对特异性荧光色素检测到的A-T/G-C含量差异将其分开。
然后,通过调节分选参数,流式细胞仪可以自动对不同染色体峰或形成的簇进行分类,收集分选出的单一类型染色体。
2、染色体分选样品的处理
染色体分选技术包括细胞同步化处理,染色体悬浮液制备以及利用流式细胞仪对分选染色体的流式核型分析、分选和收集,最后得到分选出的染色体。
2.1、制备植物染色体的材料选取
植物细胞周期同步化的材料主要来源于叶肉原生质体或根尖分生组织的悬浮培养细胞。
细胞悬浮培养具有生长迅速、便于处理等优点,已在胡萝卜(Daucuscarota)、烟草(Nicotianatabacum)、小麦(Triticumaestivum)等植物的悬浮细胞培养中成功进行同步化诱导。
1984年DeLaat等以同步化诱导后的纤细单冠菊(Haplopappusgracilis)的悬浮培养细胞为材料,完成了植物染色体的首次流式核型分析。
但是悬浮液培养细胞存在缺点,即建立一个悬浮培养体系耗时多,需要数月甚至数年时间,并且核型的稳定性差,不利于遗传研究与利用。
因此研究人员尝试通过培养植物叶肉原生质体来获得染色体,1987年Conia等以矮牵牛(Petuniahybrid)的叶肉原生质体进行同步化诱导,但是这种方法富集的中期指数只有10%。
并且由于植物叶肉原生质体难获得,培养体系难构建,叶肉原生质体方法并没有得到广泛的运用。
1992年Dolezel等成功利用蚕豆(Viciafaba)的根尖分生组织制备了高质量的染色体悬浮液。
Halfmann等的研究表明,生长活跃的植物根尖分生组织中细胞群体分裂旺盛,并保持恒定的循环周期,易于进行人为同步化调控处理。
由于植物根尖具有来源广、易处理、可重复以及稳定性高等优点,通过使用植物根尖材料实现了多种植物的中期染色体富集的研究,如小麦、豌豆(Pisumsativum)、棉花(Gossypiumhirsutum)和甘蔗(Saccharumofficinarum)等。
2.2、细胞周期同步化富集中期染色体
根尖是制备染色体悬浮液,实现染色体分选的理想材料。
然而,未经处理的植物根尖材料用于制备染色体悬浮液的效果并不理想。
在自然条件下生长的根尖分生组织细胞中,处于分裂期的细胞仅占整个分生区细胞的5%~8%,用其制备的染色体悬浮液中包含大量细胞核以及细胞杂质。
在进行染色体分选时,过多的核以及杂质会干扰染色体的识别,导致分选效率低下、误差大。
因此,在进行染色体悬浮液的制备前,首先进行细胞周期同步化处理,即通过低温、DNA合成抑制剂和微管抑制剂等理化措施对根尖分生组织细胞进行处理,使其大部分细胞处于有丝分裂的中期,从而获得以中期染色体为主的流式核型。
植物组织中细胞周期同步化诱导主要有两种策略:
即物理法与化学法诱导。
物理法是根据细胞的物理特征将细胞同步化,常用的有离心淘析法(centrifugalelutriation),即利用细胞在不同时期的大小不相同的特点,通过离心方式对目标阶段的细胞进行分离与收集,以获得同步化的群体。
虽然这种方法操作简单,但是需要的实验设备特殊且昂贵,因此应用并不广泛。
化学法则在细胞的不同阶段采用不同类型的化学抑制剂处理,以达到对特定细胞周期的关键响应因子进行功能抑制,使细胞分裂过程受阻停滞在某一阶段,从而达到富集某一目标时期的细胞群体的目的。
在去除抑制后,细胞会继续向下一个阶段前进。
通常采用不同类型的化学抑制剂对细胞生长周期进行人为调控,主要分为两种,一种是DNA合成抑制剂,通过抑制周期蛋白(cyclins)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclinsdepen-dentkinases,CDKs)的有效表达,使细胞暂时抑制DNA的复制,停留在G1/S阶段,如羟基脲(HU)、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷等均可以抑制DNA的合成,去除DNA合成抑制剂后细胞可恢复正常进程。
第二种是微管抑制剂,通过破坏有丝分裂中微管的形成,消除纺锤体的牵引力从而将细胞阻断在中期,达到富集中期染色体的目的,如甲基胺草磷(amiprophos-methyl,APM)、氟乐灵(trifluralin)以及秋水仙碱(colchicine)等。
由于不同植物的生长周期不同,为达到理想效果,对细胞的同步化处理也应调整优化。
而为了提高细胞周期同步化效率,通常会将两种类型的抑制剂组合使用。
早在1999年,Dolezel等就通过对HU和APM进行组合,对蚕豆根尖进行同步化处理,获得的中期指数最高可达70%。
在大麦(Hordeumvulgare)根尖细胞周期同步化中,Lee等通过组合使用HU与氟乐灵,获得的染色体中期指数高达76.5%。
2.3、染色体悬浮液的制备
受染色体悬浮液制备质量的限制,植物染色体分选研究进展缓慢。
高等植
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