实验室生物安全标准操作规程.docx

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实验室生物安全标准操作规程

文件号：

YMY-PGC

×××县畜牧兽医工作站

实验室生物安全标准

操作规程

（第一版）

批准：

×××

审核：

×××

受控状态：

受控

2009年9月10日发布2009年11月01日实施

修订表

版号

程序号

修订次序

修订内容

批准

日期

目　录

BSL-1实验室个人防护装备的总体要求

实验室人员进出实验室

实验室检测样品采集

实验室检测样品包装和运送

实验室检测样品接收

动物细菌病检测操作规程

动物病毒病检测操作规程

动物寄生虫病检测操作规程

电气设备操作规程

实验室消毒剂配制标准操作规程

无菌间使用标准操作规程

菌（毒）种保种、传代操作规程

实验室废弃物处理标准操作规程

实验室消毒标准操作程序

实验室消毒效果评价操作程序

实验室意外事故处理

实验室个人防护装备的总体要求

1．目的

个人防护装备是减少操作人员暴露于气溶胶、喷溅物以及意外接种等危险的一个屏障。

为了实验人员的安全，以保证实验室人员的安全及实验室环境不被污染。

2．适用范围

适用于生物安全实验室选用个人防护装备（防护口罩、防护手套、防护服与防护鞋）的质量控制。

3．职责

实验室主任组织有关人员采购符合要求的个人防护装备，并且严格控制其质量。

4．程序

实验室所用的个人防护装备应符合国家标准GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》。

在生物因子危害评估的基础上，按不同级别的防护要求选择适当的个人防护装备。

4.1防护口罩

根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》、GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》、《医用防护口罩技术要求》，生物安全实验室选用P2级的防护口罩，必须满足GB19083-2003以下条件：

（1）长方形口罩展开后中心部分尺寸：

长度不小于17cm、宽度不小于17cm；密合型拱形口罩尺寸：

横径不小于14cm，纵径不小于14cm。

（2）口罩表面不得有破洞、污渍；口罩带应调节方便，应有足够强度固定口罩位置。

每根口罩带与口罩体连接点的断裂强力应不小于10N。

（3）口罩滤料的颗粒过滤效率应不小于95％；经环氧乙烷灭菌的口罩，其环氧乙烷残留量应不超过10μg/g；不能从防护口罩中检出致病菌；口罩对皮肤无刺激。

4.2防护手套

实验室防护手套选择用国内生产的一次性乳胶手套和耐酸碱手套。

技术要求见国标GB7543-1996。

4.3防护鞋及鞋套

防护鞋应该选择耐磨、防滑和舒适的合成材料制成的鞋类。

鞋套应为塑料材质制成，可防水、要求一次性使用。

4.4防护服

BSL-2实验室试验操作人员的防护服装主要选择一次性的连体防护服，通常选用国内厂商合格的防护服。

上下连体式，宜连鞋帽，无口袋、无横褶、腰带、接缝封缝、光洁。

发尘量小、不易发生纤维剥落、断丝；不易产生静电和粘附粒子；耐有机溶剂，透明度低、柔软、舒适、不妨碍动作。

BSL-1实验室人员进出实验室

1．目的

制定BSL-1实验室人员进出的标准操作程序，保障实验室生物安全。

2．适用范围

适用于BSL-1实验室人员进出程序。

3．职责

实验室工作人员执行本程序的规定。

实验室安全负责人（生物安全）监督执行。

4．程序

4.1进入程序

4.1.1实验室工作人员进入BSL-1实验室门厅，脱掉自已所穿鞋，放入外侧鞋柜内，转向内侧，从内侧鞋柜取出工作鞋换上。

4.1.2实验室工作人员进入更衣间，先用消毒肥皂洗手，洗完手后，穿上医用白大褂或连体工作服，戴上一次性口罩、头套和一次性乳胶手套。

4.2退出程序

4.2.1试验结束后，实验室工作人员在实验室脱掉一次性口罩和一次性乳胶手套和一次性防护服，装入高压灭菌袋中。

4.2.2实验室工作人员在更衣间脱下医用白大褂，打开更衣间的紫外灯进行紫外消毒。

实验室工作人员先用0.5%新洁尔灭对手进行消毒，再用消毒肥皂洗手。

4.2.3实验室工作人员退到实验室门厅，脱掉工作鞋，放入内侧鞋柜，转向外侧，从外侧鞋柜中取出自己所穿鞋。

离开实验室。

实验室检测样品采集

1．目的

为保障检测实验的顺利进行，防止病毒扩散，规范采样程序。

2．适用范围

适用于实验室样品的采集。

3．职责

3.1采集检测样品的工作人员在采集过程中应当防止病原扩散，并对样本的来源、采集过程和处理方法等作详细记录。

3.2检验人员必须严格按照本操作规程操作，不可擅自做出超出本规程的操作，所有实验人员对所从事的工作负相应的责任。

4．程序

4.1工作要求

采集和处理检测样品应当具备下列条件：

4.1.1具有采集、处理样品所需要的生物安全防护设备；

4.1.2具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员；

4.1.3具有有效的防止病原扩散的措施；

4.1.4具有保证检测样品质量的技术方法和手段。

4.2实验材料

准备灭菌的解剖器械（剪刀、镊子、手术刀、大刀、斧头等）、灭菌试管、平皿或自封袋、载玻片、棉签、营养肉汤、30%、50%甘油盐水缓冲液、加抗生素的PBS（病毒保存夜）、50％甘油磷酸盐缓冲液、酒精灯、灭菌注射器、15mL的离心管、1.5mLEP管、记号笔、签字笔、防护服、无粉乳胶手套、防护口罩、铅笔、空白标签纸、胶布、75%酒精棉球、碘酒棉球、冰袋、冷藏容器、消毒药品、采样单等。

4.3活畜样品的采集

4.3.1血清样品的采集

4.3.1.1采血方法

对采血部位的皮肤先剃（拔）毛，碘酊消毒，75%的酒精消毒，待干燥后采血。

采血方法推行生猪前腔静脉、牛羊站立式颈静脉、禽类翅静脉采血，采血过程严格无菌。

4.3.1.2采血数量

单一病种抗体监测的每头（只）采集2～3mL全血，多病种抗体检测的每头（只）采集5～10mL全血。

4.3.1.3全血保存

采集好的全血转入盛血试管，斜面存放，室温凝固后直接放在盛有冰块的保温箱，送实验室。

从全血采出到血清分出的时间不超过10h。

4.3.1.4血清分离

凝固全血在室温2～4h后，有血清析出时，用无菌针剥离血凝块，然后放入4℃冰箱4～8h后，待大量血清析出时，吸出血清。

必要时经离心机3000rpm、30min离心，吸出血清。

分离的血清，一般不加防腐剂。

血清若在1～2周内即可检验，可放在4℃冰箱内保存；如果保存时间较长，应放在-20℃～-80℃冰箱内保存。

运送血清时可将血清放在盛有冰块的保温箱中运送。

4.3.2全血样品的采集

全血采集后应直接注入盛有抗凝剂的试管中，立即摇动，充分混合。

也可将全血液注入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，立即连续振荡脱纤维蛋白。

4.4活禽样品的采集

咽喉拭子的采集：

将棉签插入喉头口及上颚裂处来回刮3～5次取咽喉分泌液，泄殖腔拭子的采集：

将棉签插入取泄殖腔转2～3圈并沾取少量粪便，再将咽喉拭子、泄殖腔拭子一并放入盛有0.8～1.0mL加有抗生素PBS的EP管中，加盖，编号。

4.5病死（屠宰）畜禽样品的采集

4.5.1解剖前检查

急性死亡的牛、羊、猪、马等动物，解剖之前应作临床检查，疑似炭疽病的应采血、镜检，排除炭疽病时，方可解剖。

动物死亡后应在6h内进行剖检。

解剖人员要做好自我防护工作。

4.5.2肝、脾、肾、淋巴结、肺和牛、马心脏样品的采集

在肝、脾、肾、淋巴结、肺和牛、马心脏有病变的部位各采取2～3cm3的小方块，分别置于灭菌的试管或平皿中。

其他畜禽采集整个心脏，置于自封袋中。

细菌分离样品的采集可用烧红的刀片烫烙脏器表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂金耳伸入孔内，取少量组织或液体，作涂片镜检或划线接种于适宜的培养基上。

4.5.3脑、脊髓样品的采集

取脑、脊髓2～3cm3浸入50%甘油盐水中或将整个头部（猪、牛、马除外）割下，用消毒纱布包裹，置于不漏水的容器中。

4.5.4肠、肠内容物及粪便样品的采集

肠样品的采集：

选择病变最严重的部分，将其中的内容物弃去，用灭菌的生理盐水轻轻冲洗后，置于试管中。

肠内容物样品的采集：

烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取肠内容物，放入盛有30%甘油盐水中或者直接将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断。

粪便样品的采集：

用棉签插到直肠黏膜表面采集粪便，然后将拭子放入盛有30%甘油盐水中。

4.5.5液体病料样品的采集

采集胆汁、脓、粘液、关节液、水泡液等样品时，用药物或烫烙法消毒采样部位，用灭菌吸管（毛细吸管、注射器）经消毒部位插入，吸取内部液体，然后将病料注入灭菌试管中，加盖。

也可用接种环经消毒部位插入，提取病料直接接种在培养基上。

4.5.6胎儿样品的采集

取流产后的整个胎儿，装入自封袋或不透水塑料薄膜中。

4.5.7皮肤样品的采集

用清水清洗病变皮肤后，取病变皮肤3～5g放入灭菌小瓶中，加适量50％甘油磷酸盐缓冲液（pH7.4），加盖密封。

4.5.8死（屠宰）禽样品的采集

死（屠宰）禽样品的采集除按上述方法采集，也可将整个死禽装入不透水塑料薄膜袋或自封袋中或其他容器内。

4.6组织样品采集完后的无害化处理

活畜禽、病死畜禽组织样品采集完后，应做好样品外包装和环境消毒以及病死畜禽及其产品的无害化处理。

5.样品编号、采样单、送检单填写

每头动物的不同部位的组织样品应单独包装。

包装好后，在样品袋或平皿外贴上标签，标签注明样品名、样品编号、采样日期等。

采集好不同部位的样品后，同一动物的样品集中包装。

样品编号由12位字母和数字组成。

其中前两位大写字母为区县（自治县）代码（见附件１），第3、4位和5、6位数字分别代表采样年度和月份，第7、8位字母代表动物种类（Sw表示猪，Bo表示牛，Ca表示羊，Ck表示鸡，Dk表示鸭，Go表示鹅），第9位字母F表示复核血清样品，第9位字母J表示病原学监督监测样品，第9位字母W表示委托样品，后3位数字表示样品的序号（应连续编号）。

同时填写动物血清和组织（拭子）采样单、流行病学调查表、动物检测样品送检单和动物疫病预防控制中心接诊单。

动物血清和组织（拭子）采样单一式三份，一份由被采样单位保存、一份由送检单位保存、一份由检测单位保存。

动物检测样品送检单一式两份，一份由送检单位保存，一份由检测单位保存。

动物疫病预防控制中心接诊单一式两份，一份由送检单位保存，一份由检测单位保存。

实验室检测样品包装和运送

1．目的

维护检测样品的质量，防止病原的泄漏和扩散，保障样品检测的顺利开展。

2．适用范围

适用于检测样品的包装和运送。

3．职责

3.1操作者必须严格按照本程序操作，不可擅自做出超出本程序的操作，所有实验人员对所从事的工作负相应的责任。

3.2实验室主任负有对病毒样品包装、运输的监督和管理职责，并监督检查相关工作人员的安全工作程序和行为。

4．程序

拟运输的病毒样品，要求严密包装，外表加以消毒，编号、登记后，贴上“生物危险”标识，并严防标识脱落。

样品必须经三层包装。

4.1样品的包装

4.1.1内包装

4.1.1.1必须是不透水、防泄漏的主容器，保证完全密封。

4.1.1.2必须是结实、不透水和防泄漏的辅助包装。

4.1.1.3必须在主容器和辅助包装之间填充吸附材料。

吸附材料必须充足，能够吸收所有的内装物。

多个主容器装入一个辅助包装时，必须将它们分别包装。

4.1.1.4主容器的表面贴上标签，注明样品类别、编号、名称、数量等信息。

4.1.1.5相关文件，例如毒种或样本数量表格、危险性声明、信件、毒种或样本鉴定资料、发送者和接收者的信息等应当放入一个防水袋中，并贴在辅助包装的外面。

4.1.2外包装

4.1.2.1外包装的强度应当充分满足对于其容器、重量及预期使用方式的要求。

4.1.2.2外包装应当印上生物危险标识并标注“生物危害二级，非专业人员严禁拆

开！

”的警告语。

4.1.3包装要求

4.1.3.1液体或者固体样品

在辅助包装周围必须放置冰、干冰或者其他冷冻剂，或者按照规定将冷冻剂放在由一个或者多个完整包装件组成的合成包装件中，内部要有支撑物，干冰或者干冰消耗掉以后，仍可以把辅助包装固定在原位置上。

如果使用冰，包装必须不透水；如果使用干冰，外包装必须能排出二氧化碳气体；如果使用冷冻剂，主容器和辅助包装必须保持良好的性能，在冷冻剂消耗完以后，仍能承受运输中的温度和压力。

4.1.3.2冻干样品

主容器必须是火焰封口的玻璃安瓿或者是用金属封口的胶塞玻璃瓶。

在辅助包装周围还必须放置冰、干冰或者其他冷冻剂。

4.2样品运送

4.2.1样品运输要求中心主任（生物安全负责人）负责审批传染性样本运输计划，菌（毒）种保管人员负责菌（毒）种样本的保存和发放，运送人员严格按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》的规定运输样本。

4.2.2所有样本的运输要防止污染人员或环境的方式运送到指定实验室。

4.2.3样品外部运送要求样品包装和运输须满足铁路、民航以及公路运输相关法律法规的要求。

样品须内外两层包装。

（1）内包装须不透水、防泄漏、能完全密封的主容器。

有结实、不透水和防泄漏的辅助包装。

在主容器的表面贴上标签，表明样品类别、编号、名称、数量、时间等信息。

在主容器和辅助包装之间填充吸附材料。

在辅助包装外面须有相关文件，相关文件包括样品的数量表格、危险声明、样品鉴定材料、发送者的信息等。

相关文件须用防水袋子包装后贴在外包装上面。

（2）外保装要印上危险标示。

4.2.4样品保存条件：

根据环境的温度和压力选择不同的制冷条件。

4.2.5样品运送须要专人护送。

4.2.6确保样品运送的可追溯性。

要建立样品接收和运出清单，应填写样品运送记录。

4.2.7样品在实验室传递，应严格按照样品传递程序进行。

实验室检测样品接收

1．目的

规范接收检测样品，保证生物安全。

2．适用范围

适用于送检样品的交接管理。

3．职责

样品接收员负责接收样品和接样的生物安全及样品检测和检测样品的生物安全。

4．程序

4.1样品的接收

4.1.1样品接收员接收样品时，送检单位（个人）详实填写接诊单、流行病学调查表，接样人负责检查接诊单、流行病学调查表的信息是否完全。

同时出具流转卡，将流转卡和样品移交给样品管理员。

4.1.2样品管理员按流转卡信息查看样品数量和流转卡显示数量是否相符，样品质量是否合格，做好记录，并通知接样人给送检单位出具书面回执。

4.1.3样品管理员负责制备样品，将样品处理、分装备份。

备份样品置入－20℃超低温冰箱内保存，将流转卡和样品移交给检测人员。

4.1.4检测人员按检测内容，需要尽快检测的样品立即进行检测。

检验后的剩余样品由实验室按相应的保存条件，妥善保存。

动物细菌病检测操作规程

1．目的

为规范动物细菌病的检测，特制定本规程。

2．适用范围

适用不同动物细菌病的检测。

3．职责

3.1实验室工作人员严格依照本规程进行动物细菌病的检测。

3.2实验室负责人负责监督实验室工作人员动物细菌病的检测工作。

4．程序

细菌病的检测方法分别参照国家标准和行业标准中规定执行。

下列标准凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范。

凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。

序号

细菌名称

检测标准（方法）名称及编号（含年号）

备注

1

鸡伤寒和鸡白痢

《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》，NY/T536-2002

《SPF鸡微生物学监测第8部分：

SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验》，GB/T17999.8-2008

《SPF鸡微生物学监测第4部分：

SPF鸡血清平板凝集试验》，GB/T17999.4-2008

《SPF鸡微生物学监测第9部分：

SPF鸡试管凝集试验》，GB/T17999.9-2008

2

动物布鲁氏菌病

《动物布鲁氏菌病诊断技术》，GB/T18646-2002

3

动物和动物产品沙门氏菌

《动物和动物产品沙门氏菌检测方法》，NY/T550-2002

《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》，GB/T4789.4-2008

4

猪传染性胸膜肺炎

《猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术》，NY/T537-2002

《猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验》，SN/T1447.1-2004

序号

细菌名称

检测标准（方法）名称及编号（含年号）

备注

5

致病性嗜水气单胞菌病

《致病性嗜水气单胞菌检验方法》，GB/T18652-2002

6

胎儿弯曲杆菌病

《胎儿弯曲杆菌病的的分离鉴定方法》，GB/T18653-2002

7

猪痢疾

《猪痢疾诊断技术》，NY/T545-2002

《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》，SN/T1207-2003

8

动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌

《动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测》NY/T555-2002

《肉与肉制品中肠出血性大肠杆菌O157:

H7检验方法》，SB/T10462-2008

《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》，GB/T4789.3-2008

《食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检验》，GB/T4789.6-2003

9

牛传染性胸膜肺炎

《牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术》，GB/T18649-2002

《牛传染性胸膜肺炎病原分离鉴定》，SN/T1376.1-2004

《牛传染性胸膜肺炎补体结合试验方法》，SN/T1376.2-2004

10

动物结核病

《动物结核病诊断技术》，GB/T18645-2002

《乳及乳制品中结核分支杆菌检测方法荧光定量PCR法》，SN/T2021-2008

11

动物副结核病

《副结核病诊断技术》，NY/T539-2002

《副结核皮内变态反应操作规程》，SN/T1084-2002

《副结核补体核试验操作规程》，SN/T1085-2002

《牛副结核酶联免疫吸附试验操作规程》，SN/T2036-2007

《副结核病细菌学检查操作规程》，SN/T1472-2004

12

牛无浆体病

《牛无浆体病快速凝集检测方法》，GB/T18651-2002

《牛无浆体病检疫技术规范》，SN/T2021-2007

13

猪喘气病

《猪喘气病诊断技术规程》，NY/SY183-2000

《猪肺炎支原体检验方法》，SB/T10463-2008

14

禽霍乱（禽巴氏杆菌病）

《禽霍乱（禽巴氏杆菌病）诊断技术》，NY/T563-2002

《SPF鸡微生物学监测第五部分：

SPF鸡琼脂扩散试验》，GB/T17999.5-2008

序号

细菌名称

检测标准（方法）名称及编号（含年号）

备注

15

禽支原体病

《禽支原体病诊断技术》，NY/T553-2002

《SPF鸡微生物学监测第6部分：

SPF鸡酶联免疫吸附试验》，GB/T17999.6-2008

《SPF鸡微生物学监测第2部分：

SPF鸡红细胞凝集抑制试验》，GB/T17999.6-2008

《SPF鸡微生物学监测第4部分：

SPF鸡血清平板凝集试验》，GB/T17999.4-2008

《禽鸡支原体病诊断技术规程》，NY/SY175-2000

16

禽曲霉菌病

《禽曲霉菌病诊断技术》，NY/T559-2002

17

鸡传染性鼻炎

《鸡传染性鼻炎诊断技术》，NY/T538-2002

《SPF鸡微生物学监测第6部分：

SPF鸡酶联免疫吸附试验》，GB/T17999.6-2008

《SPF鸡微生物学监测第4部分：

SPF鸡血清平板凝集试验》，GB/T17999.4-2008

《鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验操作规程》，SN/T1556-2005

18

动物炭疽

《动物炭疽诊断技术》，NY/T561-2002

不做动物试验、细菌分离培养

《动物皮毛炭疽Ascoli反应操作规程》，SN/T1700-2006

19

动物衣原体病

《动物衣原体病诊断技术》，NY/T562-2002

《禽衣原体间接红细胞凝集试验方法》，SN/T1395.1-2004

《衣原体病诊断技术规程》，NY/SY182-2000

20

猪巴氏杆菌病

《猪巴氏杆菌病诊断技术》，NY/T564-2002

21

猪丹毒

《猪丹毒诊断技术》，NY/T566-2002

22

马流产沙门氏菌病

《马流产沙门氏菌病诊断技术》，NY/T570-2002

《马流产沙门氏菌病凝集试验方法》，SN/T1382-2004

23

马腺疫

《马腺疫诊断技术》，NY/T571-2002

24

马鼻疽

《马鼻疽诊断技术》，NY/T557-2002

《马鼻疽检疫技术规范》，SN/T2018-2007

25

兔出血性败血症（兔巴氏杆菌病）

《兔出血性败血症诊断技术》，NY/T567-2002

序号

细菌名称

检测标准（方法）名称及编号（含年号）

备注

26

流行性淋巴管炎

《流行性淋巴管炎诊断技术》，NY/T552-2002

27

猪萎缩性鼻炎

《猪萎缩性鼻炎诊断技术》，NY/T546-2002

28

猪链球菌病

《猪链球菌2型平板和试管凝集试验操作规程》GB/T19915.1-2005

《猪链球菌2型分离鉴定操作规程》GB/T19915.2-2005

《猪链球菌2型PCR定型检测技术》GB/T19915.3-2005

《猪链球菌2型三重PCR检测方法》GB/T19915.4-2005

《猪链球菌2型多重PCR检测方法》GB/T19915.5-2005

《猪链球菌通用荧光PCR检测方法》GB/T19915.6-2005

《猪链球菌2型荧光PCR检测方法》GB/T19915.7-2005

《猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法》GB/T19915.8-2005

《猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法》GB/T19915.9-2005

29

家畜放线菌病

《家畜放线菌病病原体检验方法》，SB/T10464-2008

30

牛附红细胞体病

《牛温氏附红细胞体聚合酶链式