运动配合中药及艾灸对慢性疲劳综合症大鼠行为及外周血淋巴细胞凋亡的阻碍.docx
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运动配合中药及艾灸对慢性疲劳综合症大鼠行为及外周血淋巴细胞凋亡的阻碍
运动配合中药及艾灸对慢性疲劳综合症大鼠行为及外周血淋巴细胞凋亡的阻碍
邹军,苑建齐,吕爽,屠嘉衡,季明勇
【摘要】 目的探讨慢性疲劳综合症(GFS)造模对SD大鼠行为及外周血淋巴细胞凋亡的阻碍,并观看运动配合中药及艾灸作用成效。
方式用48只Sprague-Dawley大鼠,按体质量分4组即对照组(CG)、CFS模型组(CFSG)、运动加中药组(ETCMG)和艾灸组(MG),每组12只。
实验共进行3次旷场与悬尾行为测试,最后进行水迷宫实验和取外周血,流式细胞仪测定淋巴细胞凋亡指数。
结果CFSG、ETCMG、MG参与造模的3组体质量的增加受到严峻抑制;旷场行为CFSG行为指数明显降低,ETCMG和MG旷场行为指数比CFSG显著升高;悬尾行为CFSG显著降低,ETCMG比CFSG显著升高,MG悬尾与CFSG无不同;水迷宫可视平台组间无不同,探讨第2象限参与造模3组的时刻比CG延长;细胞凋亡指数CFSG比CG显著升高,ETCMG比CFSG显著降低,且与CG无不同,MG与CFSG无不同。
结论CFS造模抑制大鼠体重增加,行为表现抑郁,外周血淋巴凋亡细胞增多;运动加中药方式有效减缓大鼠行为病症,降低凋亡细胞指数;艾灸方式可减缓大鼠行为病症,但对细胞凋亡未见阻碍;两种干与方式对经历行为未见阻碍。
【关键词】疏肝健脾中药;跑笼运动;艾灸;足三里;慢性疲劳综合症;动物行为;淋巴细胞凋亡
自从1988年由Holmes等[1]将慢性或反复发作的极度疲劳为特点的症候群命名为慢性疲劳综合症(ChronicFatigueSyndrome,CFS)以来,世界很多国家的学者对此进行研究,拟定了相应的诊断标准。
该病的发生与长期精神紧张,脑力、体力长期过度劳累,并与神经、体液调剂和免疫功能失调有关。
专门是脑力劳动者尤其突出,对社会阻碍大,尚未平安、有效的药物和方式医治,护理保养费用较高,给社会卫生福利部门造成较大的压力[2],因此引发了世界各国的普遍重视,开展了有针对性的研究。
最近几年来,我国也开展有关CFS的基础与临床方面的研究工作,在发病机理,阻碍因素,病症表现等多有涉及。
有关中医药医治CFS的疗效与机理报导较多,但将运动配合中医药防治CFS的研究较少。
研究有关CFS模型的成立,不同窗者方式不尽相同,咱们采纳慢性束缚、电击、冰水游泳无规律进行刺激的复合方式成立了包括体力和精神的慢性疲劳动物模型[3]。
动物躯体和精神的疲劳必然程度反映在动物行为和免疫状态上,依照慢性疲劳综合症和祖国医学对“疲劳”的医治原那么,本文拟通过观看动物行为和外周血淋巴细胞凋亡的改变,从动物行为学和免疫学角度来探讨慢性疲劳综合症发生机制,并观看运动配合疏肝健脾中药和艾灸足三里对其调理作用。
1材料与仪器
实验对象由上海西普尔-必凯实验动物提供SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只,2月龄,体质量196~247g,在中国人民解放军第二军医大学基础部神经生物实验室动物房饲养,温度20~22℃,光/暗周期为自然光暗周期,实验前适应饲养1周,自由取得饮水和饲料。
仪器见表1。
表1实验仪器(略)
试剂用品药艾条:
苏州市东方艾绒厂,批准文号:
国药准字Z;中药片剂(由柴胡、白芍、佛手、茯苓、黄芩、川芎、小麦、大枣、甘草等组成,广州中医药大学提供,批号),每片g,含g生药)。
淋巴细胞分离液、BindingBuffer试剂、PI碘化丙啶(BEEKMANCOULTER公司)。
RPMI1640w/oL-Glutaminew/25mMHEPES;%戊巴比妥250ml;生理盐水。
无钙镁离子磷酸缓冲盐水(PBS)(mol/LpH;NaClgKClgNa2HPO4gKH2PO4g;将上述试剂依次溶于1000ml去离子水中,完全溶解后,115℃高压灭菌10~15min,存在4℃冰箱中备用。
2方式
动物分组称体质量后,将大鼠随机分为对照组(CG)、CFS模型组(CFSG)、运动加中药组(ETCMG)和艾灸组(MG)(组间无不同)。
每组12只,标记后分笼饲养,每笼6只。
CFS造模方式对CFSG、ETCMG、MG三组实施造模。
天天电击,用波宽2ms的电脉冲,1mA电流强度,时刻隔20s,天天15次电击,共5min。
束缚和冷水游泳隔日交替进行:
将大鼠放进自制的行为束缚筒内,束缚2h/次;冷水游泳,水温12℃,时刻5min,游泳后用电吹风机将大鼠吹干。
CFS干与方式
ETCMG组干与方式
中药干与:
给予疏肝健脾的中药片剂,用温开水溶解,天天灌胃1ml中药,剂量为按成人每千克体质量计算剂量的20倍。
为排除灌胃对实验的阻碍,其他各组均灌胃1ml生理盐水。
运动干与:
采纳自制跑笼进行,跑笼安装计数器,运动组大鼠在直径40cm的自制圆形跑笼中进行自主运动,每日跑200圈,总长度约m,每周7d。
跑动时刻约20~90min不等。
实验第1周适应期内,通过训练大鼠,让其能自主跑动。
训练的方式为将ETCMG大鼠放进转笼,让其主动跑笼,第1天跑10min,以后天天增加10min,直到递增至1h/d,自动记录跑笼圈数。
MG组的艾灸方式MG组的艾灸方式:
与造模束缚同时进行。
把艾条分卷成直径6~8mm的灸条,先将大鼠后肢腿部双侧穴位的毛剃净后放进行为束缚筒,用封箱胶带从大鼠尾部粘贴固定,露出两后肢,持艾条于“足三里”[4]穴上2~3cm处悬灸,采纳温和灸补法,1次/d,两穴15~20min/次,直至皮肤发红发烧为止。
旷场实验(open-fieldtest)各组大鼠进行3次旷场实验,均采纳DigBehv动物行为视频跟踪分析系统(上海吉量软件科技提供),测试在隔音、避光的开放场箱(60cm×60cm×65cm)中进行。
箱左侧面中心装有摄像头。
在场箱底面长宽60cm方形旷场内,中央有16个直径为2cm的圆形小洞,深1cm,小洞底为球形凹,安装有红外线计数装置,记录大鼠探洞行为次数。
以距离旷场四边15cm画四条线,即为“井”字,把旷场分为四边、四角,一中央,9个区。
视频合成器将大鼠看成一个质点,记录大鼠运动轨迹,记录总路程(cm)、活动时刻(s)、中央区路程(cm)、探洞次数。
检测固定在19:
00~22:
00进行。
记录时刻为3min,在放入大鼠后1min开始计时。
悬尾实验各组大鼠测试3次悬尾实验。
采纳上海吉量软件科技JLgBehv动物行为视频跟踪分析系统的悬尾箱,测试在隔音、避光的悬尾箱(60cm×60cm×65cm)中进行。
悬挂好后,关闭悬尾箱后即刻开始计时。
记录时刻为5min,检测固定在17:
00~22:
00进行。
活动状态的界定:
实验动物质点1s内位移大于系统设置的设定值(1mm),那么以为实验动物处于活动状态。
Morris水迷宫实验
Morris水迷宫装置此实验所有大鼠均参与,在实验饲养大鼠的最后5天进行,前4天为学习进程,最后1天为可视平台和探讨实验。
采纳上海吉量软件科技DigBehv动物行为视频跟踪分析系统的水迷宫装置,由一圆柱形水池和一可移动位置的圆形站台组成。
圆柱形水池直径m,高m。
站台能够25~35cm高度起落调剂,并能够在4个象限,每一个象限2个点自由选择站台位置,每一个象限的2个点相关于圆心处于同一名置(即相邻象限的站台点成轴对称,相对象限的站台点成中心对称)。
站台直径12cm,位于水下1~2cm。
整个水池、站台用黑色塑料制成,水温24℃。
室温26℃。
Morris水迷宫实验方式Morris水迷宫学习实验:
本实验目的是让大鼠经历水池中站台的位置。
学习共进行4d,每只大鼠天天训练4个象限各1次。
从造模第22天开始,进行学习实验。
在大鼠入水前,将大鼠直接放到水池里的平台上30s,让大鼠明白水面下平台的方位,将大鼠别离沿着4个象限的池壁的固定位置放入水中,同时启动记录装置开始记录,记录时长为1min,等大鼠找到平台后让其在平台上再待30s,目的是给大鼠有经历方位的时刻。
第2象限有隐匿平台在,在1min内大鼠找到并爬上平台后,装置自动停止记录。
记录进程电脑自动识别大鼠运动轨迹。
假设大鼠在1min内未能找到平台,那么直接帮忙或指引,或将其直接放到站台上,并让其停留30s。
Morris水迷宫探讨实验:
本实验目的是检查大鼠是不是经历站台位置,和经历的准确程度。
在学习实验4d终止后进行。
拔掉站台,从着第4象限的池壁放入大鼠,其他条件与学习条件相同。
统计大鼠穿越原先在第2象限的平台所在位置的次数,和大鼠在第2象限内的时刻和这段时刻所占探讨时刻1min的百分数。
探讨实验只做第4象限1个象限。
Morris水迷宫可视平台实验:
本实验目的是排除大鼠由于视力缘故或游泳体力等非经历能力因素,而造成组间不同。
将站台升出水面2cm,并用略微比黑色浅些的毛巾包裹,若是用浅色毛巾包裹站台,视频跟踪系统会误将站台视为大鼠,因为站台不动而迅速终止记录。
站台换到第4象限,位置与在第2象限的相同,将大鼠从第2象限沿池壁相同位置放入,如此大鼠从第2象限到第4象限的站台的直线游泳距离相等。
在测试可视平台前,先将大鼠放到平台上30s后,让其熟悉平台的新位置然后直接进行测试。
可视平台实验只进行1个象限。
结果以大鼠寻觅站台游泳的暗藏期(时刻)表示。
淋巴细胞凋亡在上海体育学院分子生物实验室进行。
大鼠腹腔麻醉后,打开腹腔,在腹腔后壁找到腹主静脉,用真空抗凝管从腹主静脉一次采全血5ml,备用。
利用AnnexinV/PI双染法,流式细胞仪测试凋亡细胞数量,统计初期凋亡、晚期凋亡和凋亡细胞总数量。
统计分析采纳统计软件分析,统计结果以±s表示,计算数据用单因素方差分析,方差齐用LSD查验,方差不齐用Tambane'sT2查验,P<为有显著性不同,P<有高度显著性不同。
3结果
48只参与实验大鼠由于冷水游泳刺激,患肺炎病死亡3只,在束缚进程中窒息死亡6只,不明缘故死亡1只,共死亡10只,最后38只大鼠进入实验搜集血样标本,各项实验结果如下。
运动配合中药及艾灸足三里对CFS大鼠模型行为的阻碍
动配合中药及艾灸足三里运对CFS大鼠模型旷场行为的阻碍运动配合中药及艾灸足三里对CFS大鼠模型旷场行为的阻碍见表1。
表1旷场实验数据(略)
旷场行为探洞次数在实验中期参与造模3组相关于CG有显著不同(P<),但最后一次这种不同消失。
在总路程、活动时刻、平均速度3项指标,CFSG显著(P<)低于CG;MG和ETCMG显著(P<)高于CFSG。
另外,总路程ETCMG显著(P<)高于MG;平均速度ETCMG高度显著(P<)高于MG。
运动配合中药及艾灸足三里对CFS大鼠模型悬尾行为的阻碍悬尾实验结果如表2所示。
表2悬尾实验活动时刻(略)
从表2中能够看出CFSG显著(P<)低于CG;实验中期ETCMG高度显著(P<)高于CFSG,显著(P<)高于MG。
运动配合中药及艾灸足三里对CFS大鼠模型经历行为的阻碍
Morris水迷宫学习实验结果:
Morris水迷宫学习实验第4天的学习实验,共4个象限。
结果见表3。
表3Morris水迷宫学习实验暗藏期结果(略)
第1象限的学习暗藏期,CFSG显著(P<)擅长CG,MG和ETCMG显著(P<)短于CFSG。
第4象限,参与造模的3组均擅长CG(P<)。
Morris水迷宫探讨及可视平台实验结果:
Morris水迷宫探讨实验只进行1个象限。
结果见表4。
表4Morris水迷宫探讨及可视平台实验结果(略)
可视平台实验结果各组间无不同(P>),探讨穿越次数CFSG和MG多于CG(P<),参与造模的3组探讨Ⅱ象限时刻和大鼠在探讨Ⅱ象限的百分率均多于CG(P<)。
运动配合中药及艾灸足三里对CFS大鼠模型外周血淋巴细胞细胞凋亡的阻碍实验结果运动配合中药及艾灸足三里对CFS大鼠模型外周血淋巴细胞细胞凋亡的阻碍实验结果见表5。
表5各组大鼠淋巴细胞凋亡指数的比较(略)
CFSG和MG初期凋亡高度显著(P<)多于CG;CFSG和MG凋亡指数都显著(P<)多于CG;ETCMG凋亡指数高度显著(P<)低于CFSG;晚期凋亡CFSG显著(P<)多于CG,ETCMG显著(P<)低于CFSG;不管初期凋亡、晚期凋亡仍是凋亡,ETCMG与CG都无不同。
4讨论
CFS干与方式的选择世界各国学者关于CFS的医治手腕也各有不同,有的用日本草药[5],有的用抗抑郁药物[6]给CFS大鼠模型或人服用来观看疗效。
中药和针灸对CFS进行医治研究的报告近来年也慢慢增多。
已有研究说明慢性疲劳可引发肝细胞物质代谢功能持续紊乱,最终致使肝功能损伤[7]。
中医学以为CFS属于中医虚劳范围,兼有郁证、惊悸等疾病的某些病症,是一种多脏器、多系统功能失调的疾病,其病因可归结为与劳逸、情志、饮食、起居等有关,其全然病机为气机失调、气血不足、脏腑功能衰退,尤其是肝脾肾不足在慢性疲劳综合征的发生、进展中起着重要作用[8]。
在《素问》中有:
“肝受血而能视,足受血而能步,掌受血而能摄。
肝气虚,筋不能动。
”及“脾病者身重”、“脾气虚那么四肢不用”等记载。
因此本实验所用中药片剂是由疏肝健脾的中药:
柴胡、白芍、佛手、茯苓、黄芩、川芎、小麦、大枣、甘草等组成,在临床中咱们也用来调理考试应激状态[9]或医治慢性疲劳。
柴胡、佛手疏肝解郁,茯苓、白芍、黄芩、甘草健脾益气等为主药,辅以小麦、大枣养心,川芎活血等,以达解郁除烦,健脾益气养心,从而改善由于慢性疲劳引发的焦虑、气虚无力等诸症。
休闲运动本身也是对CFS的放松疗法,运动能够增进血液循环,加速新陈代谢,因此咱们对CFS模型大鼠采纳自由跑笼运动结合中药的方式,来观看对CFS大鼠模型的阻碍。
咱们操纵运动量天天200圈,而非运动时刻。
因为若是操纵时刻,大鼠可能很长时刻不动,而达不到运动成效。
大鼠运动强度完全自由,不强迫。
中医疗法提出整体观念,辨证施治,针对患者全面调整,提高疗效。
足三里是足阳明胃经合穴,具有理脾胃、调营血、补虚损的作用,为强壮要穴。
《太平圣惠方》言:
“亦主五劳羸瘦,七伤虚乏”,有健脾和胃、补气养血的作用。
大鼠模型病症表现为嗜睡,倦怠,行为活动减少,多属中医虚劳,《扁鹊心书》以为虚劳类疾病“……必用火灸,方可回生。
”艾灸亦用补法,如《针灸大成》所说:
“以火补者,毋吹其火,须自灭,即按其穴”。
已有研究说明艾灸对外周血淋巴细胞凋亡有必然程度抑制[10],其选取多穴位,本实验选取单一足三里穴位,研究其成效。
运动配合中药及艾灸对CFS大鼠模型行为的阻碍
对大鼠悬尾实验的阻碍大鼠在悬尾时,由于体位不正常,会进行猛烈的挣扎、抖动和打转。
悬尾时活动时刻越长,那么说明体力和情绪越好。
本实验通过在悬尾5min进程中的活动时刻的长短说明慢性疲劳模型大鼠躯体和心理疲劳状态。
本实验结果显示,CFSG大鼠悬尾的活动时刻减少,体力明显下降,“躯体疲劳”状态表现为明显抑郁样,显现典型的疲劳状态。
CFSG大鼠的鼠尾悬挂静止时刻较CG明显(P<)延长。
而ETCMG在实验中期测试时有明显改善,相关于CG有高度显著不同,但随造模的继续进行,疲劳的积存到造模终止时,ETCMG与CG无不同。
运动配合中药方式CFS大鼠模型悬尾实验行为有良好的调理作用,能够增加大鼠悬尾的活动时刻,但艾灸对悬尾实验活动时刻的阻碍不明显。
对大鼠旷场实验的阻碍旷场实验是反映大鼠在新环境中的探讨行为及情绪的方式,可用来测试动物中枢神经系统的“兴奋”或“抑郁”状态[11]。
抑郁病症的表现为探洞次数的减少、总路程减少、活动时刻缩短和平均速度降低。
除探洞次数指标外,CFSG旷场行为有显著降低(P<),有“抑郁”偏向,处于疲劳状态,中药配合运动方式和艾灸足三里方式对降低的旷场行为有显著改善(P<),ETCMG大鼠有些指标乃至超过CG的行为水平。
艾灸及运动配合中药方式有必然的抗“心理疲劳”、抗应激疲劳的作用。
对大鼠经历行为-水迷宫实验的阻碍Morris水迷宫实验是反映大鼠学习和空间经历能力的经常使用方式,分为学习期和测试期。
先学习,后测试。
测试又分为可视平台和探讨实验。
学习期的暗藏期越短,说明大鼠的学习和空间经历越好,认知进程越快。
CFSG第一、第4象限学习暗藏期擅长CG,因此CFS造模大鼠学习行为有降低的阻碍。
可视平台实验组间无不同,排除本实验大鼠经历行为结果不是由于视力和体力缘故造成的。
在探讨实验中,大鼠关于平台所在象限通过的时刻总和及在1min的探讨进程中,在目标象限的百分数能够反映大鼠对平台的经历程度。
目标展台的穿越次数越多,说明大鼠对站台位置的经历越好,在目标象限的时刻越长所占百分数越大说明大鼠经历越好。
目标站台区的穿越次数CFSG、ETCMG显著多于CG,在目标象限的时刻和时刻百分率CFSG、MG、ETCMG也显著高于CG。
分析其缘故可能大鼠在天天造模刺激中通过训练,它们对不良环境存在必然的适应,比CG更快达到躯体和大脑对外界刺激引发的紧张程度水平,常常被造模刺激使大鼠紧张程度高,注意力会更集中,经历成效会好一些,而CG没有造模刺激,紧张程度低,经历成效差。
另结果显示运动配合中药及艾灸方式对经历没有阻碍,说明两种方式对大鼠学习经历没有帮忙。
对CFS大鼠模型外周血淋巴细胞细胞凋亡的阻碍本研究利用流式细胞仪,将AnnexinV与PI匹配利用,把处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
由于CFS的造模,外周血淋巴细胞凋亡细胞百分率提高,原先凋亡和新生成淋巴细胞的动态平稳受到CFS造模进程的破坏,凋亡细胞的增多,可能是机体由于体力和精神疲劳,造成循环血中淋巴细胞寿命缩短,细胞由于应激而启动凋亡程序基因,加速了外周血淋巴细胞的凋亡,初期、晚期凋亡指数均显著增加。
慢性疲劳加速外周血淋巴细胞凋亡,其对机体免疫功能的阻碍有待于更深切的研究。
运动配合中药疗法对增多的细胞凋亡指数有明显降低的阻碍,艾灸足三里对外周血淋巴细胞凋亡指数无阻碍,说明运动配合中药疗法对慢性疲劳免疫系统有必然的调理作用,其机制也有待进一步研究。
本实验结果提示:
慢性疲劳动物模型大鼠在动物行为上表现出明显的疲劳样,在外周血淋巴细胞凋亡上表现明显不同,说明CFS造模阻碍动物行为和外周血淋巴细胞凋亡;艾灸对动物行为有阻碍,有效减缓造模而形成的抑郁旷场行为,但对悬尾行为和外周血淋巴细胞凋亡未见阻碍;运动配合中药干与方式能明显降低由于造模而升高的外周血白细胞凋亡指数,减缓大鼠在旷场、悬尾实验中焦虑参数,但未见运动配合中药干与方式对经历行为的阻碍。
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[11]徐叔云,卞如廉,陈修.药理实验
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