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PCR假阳性等问题共14页word资料
PCR检测常见问题与解决途径
我国古代的读书人,从上学之日起,就日诵不辍,一般在几年内就能识记几千个汉字,熟记几百篇文章,写出的诗文也是字斟句酌,琅琅上口,成为满腹经纶的文人。
为什么在现代化教学的今天,我们念了十几年书的高中毕业生甚至大学生,竟提起作文就头疼,写不出像样的文章呢?
吕叔湘先生早在1978年就尖锐地提出:
“中小学语文教学效果差,中学语文毕业生语文水平低,……十几年上课总时数是9160课时,语文是2749课时,恰好是30%,十年的时间,二千七百多课时,用来学本国语文,却是大多数不过关,岂非咄咄怪事!
”寻根究底,其主要原因就是腹中无物。
特别是写议论文,初中水平以上的学生都知道议论文的“三要素”是论点、论据、论证,也通晓议论文的基本结构:
提出问题――分析问题――解决问题,但真正动起笔来就犯难了。
知道“是这样”,就是讲不出“为什么”。
根本原因还是无“米”下“锅”。
于是便翻开作文集锦之类的书大段抄起来,抄人家的名言警句,抄人家的事例,不参考作文书就很难写出像样的文章。
所以,词汇贫乏、内容空洞、千篇一律便成了中学生作文的通病。
要解决这个问题,不能单在布局谋篇等写作技方面下功夫,必须认识到“死记硬背”的重要性,让学生积累足够的“米”。
利用PCR方法检测转基因成分时,经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论,有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性,PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性,尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
一般说来,“教师”概念之形成经历了十分漫长的历史。
杨士勋(唐初学者,四门博士)《春秋谷梁传疏》曰:
“师者教人以不及,故谓师为师资也”。
这儿的“师资”,其实就是先秦而后历代对教师的别称之一。
《韩非子》也有云:
“今有不才之子……师长教之弗为变”其“师长”当然也指教师。
这儿的“师资”和“师长”可称为“教师”概念的雏形,但仍说不上是名副其实的“教师”,因为“教师”必须要有明确的传授知识的对象和本身明确的职责。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
宋以后,京师所设小学馆和武学堂中的教师称谓皆称之为“教谕”。
至元明清之县学一律循之不变。
明朝入选翰林院的进士之师称“教习”。
到清末,学堂兴起,各科教师仍沿用“教习”一称。
其实“教谕”在明清时还有学官一意,即主管县一级的教育生员。
而相应府和州掌管教育生员者则谓“教授”和“学正”。
“教授”“学正”和“教谕”的副手一律称“训导”。
于民间,特别是汉代以后,对于在“校”或“学”中传授经学者也称为“经师”。
在一些特定的讲学场合,比如书院、皇室,也称教师为“院长、西席、讲席”等。
一、假阳性:
(一)假阳性现象
假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
(二)造成假阳性的原因
1.样品间交叉污染:
样本污染主要有收集样本的容器被污染,或样本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染;样本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;
2.PCR试剂的污染:
主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3.PCR扩增产物污染:
这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。
4.气溶胶污染:
在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5.实验室中克隆质粒的污染:
由于克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大。
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题比较常见。
(三)假阳性问题的试验控制
在每次PCR检测时,一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。
阴性对照样品检测为阴性时,表明试验全部过程的试剂没有受到污染;阳性对照样品检测为阳性时,表明DNA提取(RNA提取、RNA反转录)、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。
在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下,才能对检测样品进行判定。
只有设立试验全程的对照,才能证明试验结果成立。
造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。
试验对照包括:
1、DNA阳性对照:
以含有目的片段的DNA(或质粒)作为模板进行扩增,证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。
(注意:
阳性样品扩增效率高,应严格控制,避免其成为潜在的污染源)。
2、DNA阴性对照:
以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象。
3、空白对照:
以纯水作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4、PCR抑制物对照:
在与阳性对照相同的反应体系中,加入相同数量的待测样品DNA,如果未扩增出目的片段,证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。
5、空白提取对照:
空白提取对照扩增结果为阳性,说明DNA提取试剂可能受到污染。
6、阳性提取对照:
阳性提取对照扩增结果为阴性,说明提取过程可能有误。
如果DNA阳性对照扩增结果为阴性,或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性,则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。
(四)假阳性解决途径
由于PCR的敏感性和效率特别高,所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。
尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染,导致假阳性现象发生。
1、规范实验室设计
实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区。
物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序,严禁倒流。
在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。
不同工作区域相互隔离,通过传递仓传递。
PCR前处理区(样品制备室、DNA提取室)和PCR准备室设置正压通风系统,并设置通风柜或生物反应柜造成局部负压;后PCR室(PCR室及电泳室为高度污染区)设置负压通风系统,防止大量游离分子及气溶胶,对其它区域造成环境污染。
配制PCR反应体系(配备冰箱及生物安全柜,此实验室要求无模板DNA存在)和向PCR反应体系中加入模板DNA(配备生物安全柜及冰箱)要求在不同区域进行。
2、规范试剂耗材管理
1)验证:
新购买的试剂需进行实验前验证;
2)分装:
双蒸水、引物和dNTP均应分装储存,并标明日期,以防污染;试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行;试剂分装成小份一次使用后弃去。
3)消毒:
除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
必要时,在加样本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
3、规范实验室操作
1)控制污染源:
PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源,应严格防止将这个空间的物品带出;
2)一次性用具:
使用实验服和一次性手套,使用带有滤膜的移液器枪头,一次性反应管和离心管;
3)定期消毒:
定期对实验室进行紫外照射,用10%漂白剂、3%双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。
4)定期通风:
对实验室定期进行正压、负压通风处理;
5)小心操作:
操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;加样时,最后加阳性对照。
4、技术处理
1)在DNA模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。
一般选用波长254nm照射30min(Nature,1990,34:
27);
2)PCR实验中使用dUTP,而不用dTTP。
在扩增前使用UraciIN一g1ycosylase(尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的PCR产物,而不降解基困组DNA模板,然后热灭活此酶,再进行扩增反应(Gene,1990,93:
125)。
美国PE公司提供此类试剂盒;
3)在PCR反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联DNA链,使之不能再扩增(NucleicAcidsRes,1991,19:
99)。
二、假阴性
(一)假阴性现象与判断方法
如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果,提示本次实验中可能有假阴性结果。
但这里应注意,许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA,和标本相比来说,不需纯化提取核酸的步骤,因此,如果在标本核酸纯化提取步骤有问题,即使阳性对照均呈阳性,标本检测中还可能有假阴性。
设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。
在每一反应管中同时对内标准基因对照进行扩增,若内标准基因对照未能扩增出来,说明该反应管的结果可能有问题。
(二)造成假阴性的原因
1.仪器因素
PCR实验对仪器的依赖性是很高的,离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。
扩增仪的主要问题是孔间差,引起扩增失败或扩增效率降低。
而离心机的影响则更容易被忽视。
国内使用离心机很少使用离心加速度(XXXg)作为参数指标,而常使用转数作为参数指标,这里就存在着一个问题,由于离心机的大小不同,有效跳心半径也不相同,因此同样的转速所产生的离心力相差很大(有的在数倍以上),所以在相同的离心时间下,有可能模板并没有离心下来,造成PCR假阴性。
这个问题在其他实验也有,但因其他实验都是测定大分子蛋白沉淀,对离心的速度要求较低所以不太明显。
建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。
2.试剂质量问题
PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要,试剂的质量问题涉及多个方面:
细胞的裂解;模板的抽提;引物位点的选择;Taq酶的活性等等。
其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。
这些都是试剂质量的问题,因此选用高质量的PCR试剂非常重要。
酶失活:
需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物:
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
3.核酸模板问题
1)模板中含有杂蛋白质;
2)模板中含有Taq酶抑制剂;
3)模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白;
4)在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;
5)模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
4、物理原因:
PCR仪控温不准,也是PCR失败的原因之一。
有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。
5、靶序列变异:
如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
6.操作人员素质问题
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