HRP标记抗体原理及方法戊二醛二步法和过碘酸钠法.docx
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HRP标记抗体原理及方法戊二醛二步法和过碘酸钠法
HRP标记抗体原理及方法(戊二醛二步法和过碘酸钠法)
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其次要有良好的制备方法。
目前,高质量的酶(如辣根过氧化物酶,简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上,宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一)酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶,原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求:
(1)来源方便,易于纯化;
(2)比活性高,性质稳定;
(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,B-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,
HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。
HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。
HRP由多个同功酶组成,分子量为40,000,等电点为PH3〜
9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。
酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm
/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit
Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小,非酶蛋白就越多。
值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变性后,RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体
(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有
色的氧化型染料(D)。
酶促反应的过程如下
HRP
DH2+H20>DHI2O
供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。
如DAB(3.3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。
5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。
OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。
目前用得较广泛和较满意的供氢体是:
OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。
前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。
另外,还有一种供氢体称ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。
尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。
应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2已消耗殆尽)。
这样即使再延长时间也不会增加反应产物颜色。
(二)HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。
对于制备HRP结物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。
尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法
1.原理:
戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫
球蛋白结合物。
2.标记步骤:
(1)称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
(2)反应后的酶溶液经Sephadex
G-25层析柱,用生理盐水洗脱。
流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。
如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1MPH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?
小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4C1小
时。
(7)3000rpm离心半小时,弃上清。
沉淀物用半饱和硫酸铵
洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中,对0.15M
PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。
3.结果判定:
(1)定性及效价滴定:
用特异性抗原(或抗体)同酶标记
抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。
然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。
最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选择)。
(2)定量和克分子比值测定:
可用分光光度计测定(光
程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nnX0.4
IgG量(mg/ml)=
OD280nm-OD403nnX0.42)X0.94X0.62
酶量
IgG量
(3)本法标记步骤比较简单,重复性好。
缺点是酶的利用率低,一般只有2〜4%的
酶与蛋白质结合。
4.试剂及器材:
(1)0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS):
取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO4
51ml,
NaCl1.8克,加蒸馏水至200ml。
(2)1.25%戊二醛液:
取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
(3)1MPH9.5碳酸盐缓冲液:
取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4)0.2M赖氨酸溶液:
称赖氨酸29.2mg溶于0.01M
PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
(5)0.15MPH7.4PBS及生理盐水。
(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液
(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
(9)HRP(RZ>3.0)。
(10)SephadexG-25层析柱(2cmx50cm)。
(11)搅拌器,分光光度计,离心机。
(12)透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NalO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和lg结合,99%的lg与酶结合,酶与|g的活性无重大损失,是目前最常用的方法。
1.原理:
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭
HRP上残留的a和£氨基基以避免酶分子之间的交联。
后来Wilson等改用在低PH下使NalO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。
HRP经NalO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
2.标记步骤:
(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNalO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中,对1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4C过夜。
(4)加20卩I0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛
化?
RP的PH升高到9.0〜9.5,然后立
即加入10mgIgG(抗体,或SPA5mg)在1mI0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小
时。
(5)力口0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液,混匀,再置
4C2小时。
(6)将上述液装入透析袋中,对0.15MPH7.4PBS透析,4C过夜。
其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
3.结果判定:
除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nnX0.3)x0.62
4.试剂及器材:
(1)0.1MNalO4:
称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂,批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
(2)1mMPH4.4醋酸钠缓冲液:
0.2MNaAc(1.361克/50ml)3.7ml
0.2MHAc(0.601ml/50ml)6.3ml
加蒸馏水至2,000ml。
(3)0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液:
Na2CO30.32克
NaHCO30.586克
加蒸馏水至50ml
再用蒸馏水作20倍稀释,即成0.01MPH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4)NaBH4溶液(4mg/ml):
临用时称取NaBH44mg溶于1ml蒸馏水中。
(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
(三)工作浓度的选择
在免疫酶技术中,首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。
因为酶标记物浓度的很小变化,便可导致试验结果产生很大的波动。
另外,由于浓度过高,可使非特异性反应增加,而浓度过低又可影响测定的敏感性。
因此,正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是:
将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上,然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应,以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价,或称工作浓度。
其步骤为:
先将抗原(或抗体)用0.05M
PH9.6包被缓冲液稀释为10卩g/ml左右,于聚苯乙烯板孔内加0.1ml,4C过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤3次。
酶标记
抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1:
100,:
200,:
400,1:
800,1:
1600?
?
(根据据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度二孔,每孔0.1ml,37C孵育1小时后洗
涤。
然后加底物液,每孔0.1ml,37C10〜30分钟。
以2M
H2SO40.05ml终止反应。
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。
并以OD为纵座标,结合物浓度为横座标,绘制滴定曲线。
由曲线上查得OD值为1.0左右,且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度,即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
要说明的是,本法为ELISA直接法,所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。
这就要求在建立ELISA实验系统中,因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法),以达到最适的实验条件。
(四)注意事项
1.在具备高质量HRP的条件下,所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1:
16),纯度高,亲和力好,这是保证标记物效价高,免疫活性好的首要条件。
2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。
所
用试剂,最好(或必需)新鲜配制。
如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品,因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂
质)。
否则,影响标记效果。
3.室温搅拌时须避光,室内温度一般在25C为宜。
标记物每次透析前,须认真检查,防止漏液。
4.浓的标记物相当稳定,常加入30〜40%甘油于-10C
下保存。
4C可保存1〜2年,但稀释成1:
10,只能保存数周。
已配制的使用液应在12小时内用完。
切忌反复冻融。
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