医学免疫学与病原生物学实验指导.docx
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医学免疫学与病原生物学实验指导
医学免疫学与病原生物学
实验指导
(供三年制护理学专业使用)
主编穆春晓谢涛
副主编洪宇王力
编者李慧霞林君荣
辽东学院医学院基础医学教学部
实验室规则
实验是验证理论,并对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。
为保证实验效果,同时避免病原生物的实验室内传染,保障实验操作者的安全,特制定如下规则:
一、尽量不带个人生活用品入实验室,必要的用具带入后,应放在远离操作的位置。
二、进入实验室后穿上白大衣,离室时脱下反叠带走。
在实验室内应保持安静、整洁、有序;不得高声谈笑、随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。
三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水,严禁用嘴吸移液及润湿标签,尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。
四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况,应立即报告指导教师,切勿隐瞒或自行处理。
五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中,不得放在桌面上或水槽内。
六、爱护公物,节约试剂材料,不得将实验室任何物品私自带走。
如遇仪器、用品损坏,应报告指导教师并按规定予以赔偿。
七、实验完毕,整理桌面,值日生打扫室内卫生,最后离开的同学应注意关好水电、门窗,洗手后离开。
第一部分医学免疫学实验
实验一凝集反应与沉淀反应
【实验目的】
1.掌握凝集反应的原理、参加要素及临床意义。
2.掌握沉淀反应的原理、参加要素及临床意义。
【基本原理】
抗原与抗体的结合具有特异性,所以可以用已知抗原检测未知的抗体,或是用已知的抗体检测未知的抗原。
1.凝集反应:
颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合能出现肉眼可见的凝集现象。
2.沉淀反应:
可溶性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线。
一、凝集反应
(一)玻片直接凝集反应——菌种鉴定
【目的】观察细菌在玻片上与其相应抗体结合所出现的细菌凝集现象,理解抗原抗
体反应的特异性。
【原理】将已知细菌抗体与待测细菌混合,如果抗原与抗体相对应,则引起细菌凝
集,反之则不凝集,据其凝集现象可判断细菌种类。
【材料】
1.1:
20痢疾杆菌免疫血清,1:
20伤寒杆菌免疫血清。
2.痢疾杆菌培养物。
3.生理盐水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯、消毒缸等。
【方法】
1.取洁净玻片1张,用记号笔划分三等份,如下图所示:
NS伤寒杆菌免疫血清痢疾杆菌免疫血清
+++
痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌
2.用接种环分别取生理盐水、1:
20伤寒杆菌免疫血清、1:
20痢疾杆菌免疫血清各
3~4环按图示位置放在玻片上,注意在换取另一种血清时要烧灼接种环,以免混淆血清产生错误结果。
3.用接种环挑取少量痢疾杆菌加入玻片的生理盐水中,充分混匀,再挑取少量痢疾杆菌加人1:
20伤寒免疫血清中混匀,同法挑取痢疾杆菌加入1:
20痢疾杆菌免疫血清中,混匀。
注意无菌操作。
4.轻摇动玻片,1~2分钟后观察。
【结果观察】
阳性:
液体变清,并有乳白色凝集块出现。
阴性:
液体仍然混浊,,无凝集块出现。
记录结果之后,将玻片放入含消毒液的指定容器内,切勿任意放置或冲洗。
-
+
(阴性)
(阳性)
【注意事项】取细菌培养物时不宜过多,与免疫血清混合时,必须将细菌涂散、涂
均匀,但不宜将面积涂得过大,以免很快干涸而影响结果观察。
(二)试管直接凝集反应——血型抗体效价滴定
【目的】了解试管凝集反应方法;掌握凝集效价的判定及其意义。
【材料】
1.A或B型试者血清、生理盐水。
2.A或B型红细胞悬液。
3.小试管、试管架、吸管。
4.37℃恒温培养箱等。
【方法】
1.取7支小试管,标1~7号。
2.按下表加样,将待检血清进行倍比稀释。
在第1~7管内加入红细胞悬液各0.5ml。
(注意:
加样顺序由后往前加)充分混匀后,置37℃恒温箱30分钟后观察记录结果。
表1-2试管凝集实验方法和结果举例
试管号1234567(对照)
生理盐水(ml)0.90.50.50.50.50.50.5
待检血清(ml)0.10.50.50.50.50.5(弃0.5)—
红细胞(ml)0.50.50.50.50.50.50.5
血清稀释度1:
201:
401:
801:
1601:
3201:
640—
37℃温箱放置30分钟
结果判定++++++++++++++——
【结果观察】
先观察生理盐水对照管(第7管),应不发生凝集,液体混浊,管底沉淀呈圆形,边缘整齐。
此沉淀物为红细胞悬液静置时因重力作用自然下沉形成。
然后自第6管开始依次观察管内液体的混浊程度及管底凝集块的大小。
【血清对倍稀释方法】
用吸管将第1管的溶液连续吸吹三次,使其充分混匀后吸出0.5ml移入第2管(先反复练习吸吹方法,待掌握操作方法后再进行正式试验),同法使充分混匀后吸出0.5ml移入第3管,如此作倍比稀释至第6管,从第6管吸0.5ml弃去,第7管为不加血清对照。
【结果判定】
凝集物上清液凝集程度
全部凝集澄清++++(最强凝集)
大部份凝集基本透明+++(强凝集)
有明显凝集半透明++(中度凝集)
很少凝集基本混浊+(弱凝集)
不凝集混浊—(不凝集)
【孔底凝块观察】
++++++++++—
【凝集效价(血清凝集滴度)的判定】
通常以能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集(++)的血清最高稀释度为血清凝集效价。
上表所示结果,血清效价为1:
160。
(三)间接凝集反应(类风湿因子检测)
【原理】类风湿因子(rheumatoidfactorRF)是抗人或动物IgGFc段的抗体,是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。
IgM型RF被认为是RF的主要类型,也是临床免疫检验中常规方法所测定的类型。
IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上作为检测试剂,在反应介质中,待检血清中如含有RF,可与胶乳颗粒出现凝集反应。
这是检测IgM型RF的常用方法,但此方法只能定性或以滴度半定量,其灵敏度和特异性均不高,且只能检出血清中的IgM型RF。
【方法】胶乳颗粒凝集试验
即一定稀释度的待检血清+Ig-胶乳颗粒1~2滴,观察凝集与否。
(四)间接凝集抑制试验------乳胶妊娠试验
【原理】将待测样品中的抗原与已知抗体作用后,再与相应抗原—乳胶颗粒混合。
因没有游离抗体的存在,乳胶颗粒表面的抗原不能与抗体结合出现凝集现象,即凝集被抑制。
孕妇尿液中含HCG,用抗HCG与之结合后,再加HCG—乳胶,则不出现凝集现象。
【方法】
1.取玻片一张,左侧加生理盐水一滴,右侧加待检尿液一滴。
2.两侧各加抗HCG(HCG诊断血清)一滴,混匀2分钟。
3.两侧各加HCG—乳胶抗原一滴,混匀2分钟,观察结果。
【结果分析】
左侧对照实验:
出现均匀的凝集颗粒。
妊娠诊断试验阴性:
出现凝集现象,即凝集未被抑制,说明待检尿液中无HCG。
妊娠诊断试验阳性:
不出现凝集,即凝集被抑制,说明待检尿液中有HCG。
凝集
不凝集
(试验阴性)
(试验阳性)
【理论联系实际思考题】
1.依据试验原理,分析实验结果。
2.叙述玻片直接凝集试验的临床应用。
3.间接凝集试验与直接凝集试验比较有何优点?
二、沉淀反应
(一)环状沉淀反应
【目的】掌握环状沉淀实验的原理、操作方法、结果判断及用途。
【原理】在口径很小的环状沉淀试管中,将一定稀释度的抗原溶液加于抗体血清之上,使二者直接在液相中相互扩散,抗原与相应抗体结合后,于两液交界面上形成白色沉淀环。
【材料】
1.试剂:
兔抗人血清;人血清稀释液;动物(如羊、豚鼠等)血清稀释液;生理盐水。
2.其他:
环状沉淀试管;毛细吸管。
【方法】
1.取3支环状沉淀试管,注明管号。
2.用毛细吸管在①、②、③管中各加入兔抗人血清0.2ml。
3.倾斜环状沉淀试管,用毛细吸管吸取人血清稀释液0.2ml沿管壁缓缓加入①管中抗体之上,将沉淀管直立,并使抗原抗体二者呈一清晰界面。
用同样的方法在②管加动物血清稀释液0.2ml、在③管中加入生理盐水0.2ml。
4.室温中静置10~20分钟,观察两液交界面有无白色沉淀环形成。
【结果观察与分析】
两液交界面有白色沉淀环者为环状沉淀实验阳性,无白色沉淀环者为阴性。
【注意事项】
1.加血清的过程中不要形成气泡。
2.加抗原时应沿管壁缓缓加入,毛细吸管尖勿触及抗体部分,避免抗原与抗体混合。
3.实验时抗体的浓度应大于抗原的浓度。
【理论联系实际思考题】
1.试述环状沉淀实验的原理。
2.试述该实验的临床应用范围。
(二)凝胶沉淀反应
1.双向琼脂扩散试验
【原理】常用于定性检测,也可用于半定量检测。
将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶板上相邻近的小孔内,让它们相互向对方扩散。
当两者在最适当比例处相遇时,即形成一条清晰的沉淀线。
根据有否出现沉淀线,可用已知的抗体鉴定未知的抗原,或用已知的抗原鉴定未知的抗体。
临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白,作为原发性肝癌的早期辅助诊断。
甲种胎儿蛋白(α-Fetalprotein,AFP),是胎儿组织及体液中的正常组织成份。
胎儿在第9周才出现此种蛋白,13~19周达高峰,到21周后逐渐下降,胎儿出生后该蛋白即行消失或含量甚微,普通试验方法检查不出,而肝癌病人及个别卵巢癌或睾丸癌病人的血清检出有此种蛋白。
【材料】
1.抗AFP血清、已知肝癌病人AFP阳性血清、待检病人血清。
2.1.2%琼脂(用生理盐水配成)。
3.载玻片、毛细吸管、湿盒。
【方法】
1.制备琼脂玻片:
将已知加热溶化的1.2%琼脂3.5ml,迅速倾入载玻片上。
2.打孔、加样:
待凝固后用打孔器按下图样打孔(孔径3mm,孔距4mm)。
以上方孔为第1孔,按顺时针方向分别称为2、3、4、5和6孔,中央孔为7孔。
7孔加入抗AFP血清,1、4孔加入已知AFP阳性血清(或AFP),作为阳性对照孔;6孔加入已知AFP阴性血清,作为阴性对照孔,其余2、3、5孔为试验孔,加入待检血清。
2、3、5孔待检血清为AFP阳性
4.温育置湿盒室温或37℃温育12~24h。
【结果观察】
1、4孔与7孔间应出现白色沉淀线(如上左图1与7,4与7),6与7孔间应不出现白色沉淀线。
若2、3、5孔与7孔间出现白色沉淀线而且与阳性对照沉淀线吻合者如图中2、3、5与1、4孔间,即为实验阳性,表明待检血清中含有AFP(即AFP阳性)。
如出现与阳性对照相连接,且呈枪刺状如上右图中4与5孔间,说明二者间有共同抗原成分;如出现成交叉的沉淀线如上右图3与4,则是非特异性沉淀反应,为假阳性反应,乃判为实验阴性,表明待检血清为AFP阴性。
2.对流免疫电泳
【原理】在一定条件下,胶体颗粒是带有电荷的,这些带电胶体颗粒在电的影响下
发生移动。
如胶体颗粒带负电,则移向阳极;反之,移向阴极。
这种现象称为电泳。
对流免疫电泳是将病人血清(待检抗原)放在琼脂板阴极端孔内,已知抗血清(含有已知抗体)放于阳极端孔内,在碱性环境条件下同时进行电泳,抗原由阴极向阳极移动快,而抗体系丙种球蛋白,等电点在pH6~7之间,故带负电荷少,移动速度慢,由于电渗作用结果向阴极倒退,于是抗原抗体在电场中相遇,当两者比例适当时,则特异性抗原抗体互相结合,便形成肉眼可见的白色沉淀线。
【材料】
1.1%,PH8.6,0.075M巴比妥缓冲液。
2.抗AFP血清,已知AFP阳性血清,待检病人血清。
3.玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、电泳仪等。
【方法】
1.将用缓冲液配制好的1.2%琼脂隔水加热溶化,趁热吸取3.5ml加于玻片上,冷凝后打孔,孔直径3毫米,二孔间距离3毫米。
2.分别从上至下向左列1、3、5孔内加入抗AFP血清;向右列2孔内加待检病人血清,4孔内加已知AFP阳性血清作为阳性对照,6孔内加已知阴性对照血清。
各孔加满为度,勿使外溢,
3.将琼脂板置于电泳槽内,抗原端入阴极侧,抗体放阳极侧,二端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。
4.通电,固定电压5~6伏/厘米长,通电45~60分钟左右。
【结果观察】
电泳毕,关闭电源,取出琼脂板。
在黑色背景上方,透过散射光线,首先观察3与4孔间(阳性对照组)、5与6孔间(阴性对照组)的白色沉淀线是否出现;再看试验孔,如孔间未出现这样的沉淀线,则该待检血清为AFP阴性血清。
Ab+11-Ag-Ag
【理论联系实际思考题】
1.在双琼脂扩散实验中,加入过量的抗原可增加沉淀线的清晰度吗?
为什么?
2.如何分析双琼脂扩散实验结果?
第二部分医学微生物学实验
实验二细菌的染色与形态结构观察
【实验目的】
1.掌握革兰染色与抗酸染色的基本程序和判断标准,明确革兰染色与抗酸染色的实际意义。
2.掌握油镜的使用及保护方法,熟悉油镜的原理。
3.熟悉细菌的基本形态与特殊结构。
【实验原理】
一、革兰染色原理
1.细胞壁学说:
革兰阳性细菌细胞壁肽聚糖是具有5肽交联桥的三维结构,且层数多(15~50层,20~80nm),含量丰富(占细胞壁干重50%~80%);革兰阴性菌细胞壁肽聚糖没有5肽交联桥,形成的是不牢固的二维结构,层数少(1~2层,10~15nm),含量较低(占细胞壁干重10%~20%),并且含大量脂质成分的外膜占细胞壁干重的80%以上。
当用95%酒精脱色时,阳性细菌细胞壁破坏较小,结晶紫-碘复合物不易脱去;阴性细菌细胞壁大部分被溶解,结晶紫-碘复合物容易脱掉。
2.等电点学说:
G+菌等电点(pH2~3)比G-菌等电点(pH4~5)低,在一定的pH环境中,前者带有的负电荷数量多于后者,故与带正电荷的结晶紫染料结合能力更强,不易脱色。
3.化学学说:
G+菌细胞质内带有较多的核糖核酸镁盐,可与碘-结晶紫复合物形成更大分子的复合物,在细胞内不易脱色。
而G-菌只含有少量核糖核酸镁盐,因此,较G+菌易脱去颜色。
二、抗酸染色原理
抗酸染色是将固定的标本先经石炭酸复红加温染色,再用盐酸酒精脱色,最后用美蓝复染。
抗酸菌被染成红色,经脱色被复染成蓝色者为非抗酸菌。
结核杆菌为细长略带弯曲的杆菌,因细胞壁中含有大量脂质、蜡质、分支菌酸等,故一般不易着色,需经加温或延长染色时间才能着色,一旦着色后,能抵抗盐酸酒精的脱色作用,故用抗酸染色法对其染色,其为抗酸菌,被染成红色。
此法在直接镜检结核病人标本时有一定诊断意义。
三、显微镜油镜原理
光线在不同媒质中的传递速度不同,因而,在由一个媒质进入另一个媒质中时,可产生折射作用。
为了使透射光线不被折射掉,在载玻片和油镜头间加入同玻璃折光率比较接近的香柏油(或液体石蜡),最大限度的使光线进入物镜,提高成像率。
(见图1—2)
【实验材料与仪器】
一、革兰染色
1.标本:
葡萄球菌与大肠杆菌的混合菌液(新鲜菌液)。
2.革兰染色液:
结晶紫染液;碘液;95%乙醇;稀释石炭酸复红染液。
3.其他:
载玻片;酒精灯;接种环;吸水纸;玻璃笔;香柏油;擦镜纸;二甲苯。
4.仪器:
光学显微镜。
二、抗酸染色
1.标本:
消化肺结核患者痰标本。
2.抗酸染色液:
石碳酸复红;3%盐酸酒精;美蓝。
3.其他:
载玻片;酒精灯;接种环;吸水纸;玻璃笔;香柏油;擦镜纸;二甲苯;玻片夹。
三、细菌形态观察
1.球菌:
葡萄球菌;链球菌;淋球菌。
2.杆菌:
大肠杆菌;炭疽杆菌;枯草杆菌。
3.螺形菌:
霍乱弧菌;幽门螺杆菌。
四、细菌特殊结构标本
1.荚膜:
肺炎链球菌;炭疽杆菌。
2.鞭毛:
变形杆菌;霍乱弧菌。
3.芽胞:
破伤风杆菌;枯草杆菌。
【实验方法及内容】
一、革兰染色(自做)
1.细菌涂片标本的制备:
点燃酒精灯,在酒精灯上方用接种环取混合菌液一环,缓慢涂于载玻片中央,形成直径约1cm的涂层。
将玻片反复在酒精灯上方通过几次,对标本进行干燥、固定(也可自然干燥)。
2.革兰染色过程:
结晶紫染色(1min,水洗)→卢戈氏碘液媒染(1min,水洗)→95%酒精脱色(30-40s,水洗)→稀释复红染色(30s,水洗)→吸干待检。
3.标本观察
将标本滴加镜油,置于油镜下观察细菌的颜色与形态。
二、抗酸染色(自做)
1.涂片、干燥、固定:
以蜡笔划一大小为2.0cm~2.5cm的椭圆形圈,用接种环挑取痰液中脓样黄绿色部分或血丝部分在圈中作厚膜涂片,自然干燥,微火固定。
2.初染:
在涂片标本上放一滤纸片(其作用是滤去染液中的沉淀,并防止加热过程中染液外溢),在滤纸上滴加石炭酸复红液,将玻片置于火焰上方微微加热,待蒸汽出现,维持5min,去掉滤纸片,等冷却后水洗。
3.脱色:
滴加3%盐酸酒精脱色30s~60s,轻轻摇动玻片,直至无红色流下为止,水洗。
4.复染:
用吕氏碱性美兰复染60s,水洗,吸干,油镜检查。
三、油镜使用方法(自做)
(一)熟悉光学显微镜基本构造
1.熟悉显微镜基本结构(图1—1)
2.显微镜保养注意事项
(1)载物台要保持清洁,勿将油或水留在台上。
(2)观察标本时,缓慢调节粗调节器,发现标本后,再调节细调节器,直至标本清晰。
严格禁止直接利用细调节器寻找标本。
原则上,细调节器的旋转在正反方向上不应超过三周,以免损坏微螺旋。
(3)注意物镜油镜头的保护,浸入镜油中时,切忌将镜头顶在载玻片上,以免划伤镜片。
观察结束后,用擦镜纸轻轻拭去镜头上的油渍,或用二甲苯擦拭镜头及镜片,防止镜油对镜头的侵蚀或影响透光率。
(4)在不观察标本时,应及时关闭自带光源显微镜电源开关,一方面延长灯泡的使用寿命,同时也可节约用电。
(5)使用完毕后,将显微镜套上防尘罩,置于干燥处存放,注意防止潮湿,避免阳光直晒。
(二)油镜下观察细菌基本形态、特殊结构与革兰染色、抗酸染色
取细菌染色标本片一张,在标本染色部位滴加一滴香柏油,将标本片置于显微镜载物台上,调整至集光器中央位置。
选择好油镜头,将油镜头浸入镜油中,旋动粗调节器,缓慢抬升油镜头,待标本出现后,再旋转细调节器进行微调,直至图象清晰。
图1—1光学显微镜基本构造
图1—2油镜的原理
【实验结果与判定】
1.革兰染色结果:
记录并绘制观察到的细菌颜色、形态及排列方式。
紫色:
G+菌;红色:
G-菌。
2.抗酸染色结果:
结核杆菌为细长、直的或微弯曲杆菌,呈红色,为抗酸染色阳性。
标本的其余部分及非抗酸菌被染成蓝色。
3.记录并绘制所观察到的细菌基本形态和特殊结构模式图。
【注意事项】
一、革兰染色
1.涂片后注意要干燥、固定,以免标本被冲刷掉。
2.注意每个步骤的时间控制,尤其是95%酒精脱色时间和均匀度的控制,否则会直接影响染色结果。
3.待检混合菌液要用新鲜培养物洗液。
二、抗酸染色
1.在涂片后烧灼接种环时,为防止痰中的细菌溅出,可先将接种环在内焰烧干,然后再于外焰灭菌。
2.在初染加热时,切记染液不可沸腾,出现蒸气即暂时离开,若染液因蒸发减少时,需随时补加,以防烤干。
3.把握好脱色时间,最长不要超过1min。
三、油镜的使用
1.调整浸在油中的物镜时,要控制好方向和调整的距离,切忌将载玻片顶碎,损伤油镜头;用后将镜头用二甲苯擦拭去油。
2.按操作规程使用油镜,观察标本时要多观察几个视野,选取细菌标本的典型形态和结构。
【理论联系实际思考题】
1.革兰染色的原理及意义。
2.革兰染色最关键的是哪一步?
此时阳性菌和阴性菌各应该是何种颜色?
3.为何要用油镜观察细菌?
4.从医学角度讲,细菌特殊结构有何意义?
5.结核杆菌的形态染色有何特点?
实验三细菌的人工培养与代谢产物观察
【实验目的】
1.掌握细菌接种的无菌操作基本方法,观察细菌在不同培养基中的生长现象;通过进行细菌人工接种培养,建立无菌操作观念。
2.熟悉细菌在各种人工培养基上的生长繁殖特点。
3.熟悉常用细菌培养基种类及应用范围。
4.了解培养基的制备原则和基本程序。
【实验原理】
1.根据细菌对营养的基本需求及所要达到的培养目的,确立细菌培养方案,设定培养基配方及制作程序。
通过提供氮源、碳源、无机盐、水等基本营养成分,调整适合的氢离子浓度,以满足细菌生长繁殖的营养需求;最后,经高压蒸汽灭菌,制备出不同用途的无菌培养基。
2.在同时满足细菌生长的温度条件和气体条件后,细菌可以在所提供的培养基内分裂、繁殖,形成肉眼可见的培养物。
根据培养目的的不同,可以利用多种培养基进行不同类型的细菌培养。
【实验材料与仪器】
1.药品:
牛肉膏;蛋白胨;氯化钠;琼脂;NaOH;HCL;蒸馏水。
2.菌种:
葡萄球菌;大肠杆菌;葡萄球菌-大肠杆菌混合菌液。
3.培养基:
普通肉汤培养基;固体斜面培养基;固体平板培养基;半固体培养基。
4.仪器:
天平;高压蒸汽灭菌器;电热恒温干燥箱。
5.其他:
三角烧瓶;烧杯;试管;培养皿;移液管;精密pH试纸。
酒精灯;接种环;接种针。
【实验方法及内容】
一、制备培养基的基本原则和程序(示教)
1.基本原则①满足细菌的基本营养需求;②提供适度的pH环境;③通过灭菌操作达到培养基的无菌标准;④封装、冷藏保存。
2.基本程序按比例称取营养物质→熔于定量蒸馏水→调整营养液pH值→过滤除杂质(加琼脂的需要过滤)→分装、加塞(平板培养基灭菌后再分装)→灭菌→冷却、备用。
二、常用培养基制作(示教)
1.普通肉汤培养基称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g→加入1000ml蒸馏水中加热溶解→调整pH7.4-7.6→分装试管、加塞→高压蒸汽灭菌(1.05kg/cm2,121.3℃;作用15~30min)→冷却后备用。
2.普通琼脂培养基配制1000ml肉汤培养基→加入20~30g琼脂→加热溶解→过滤→调整pH7.4-7.6→分装试管、加塞(制作平板培养基时,待整体灭菌冷却至50~60℃后再以无菌操作分装至灭菌培养皿内)→高压蒸汽灭菌(条件同上)→摆斜面冷却备用(斜面培养基)。
3.半固体培养基配制1000ml肉汤培养基→加入3~5g琼脂→加热溶解→过滤→调整pH7.4-7.6→分装试管、加塞→高压蒸汽灭菌(条件同上)→直立冷却备用。
4.血琼脂平板培养基配制普通琼脂培养基,灭菌后冷却至50~60℃,以无菌操作加入5%~10%脱纤维无菌动物血,再以无菌操作分装平皿,冷却备用。
三、细菌的人工培养(自做)
(一)固体斜面培养法(图2—1)
1.左手拇指、食指、中指及无名指平行握持斜面培养基试管及待接种菌试管,斜面朝上。
2.右手持接种环,在酒精灯火焰上方灼烧灭菌并冷却。
3.于酒精灯火焰上方无菌区域内,用小指及小指与无名指间指缝夹取两个试管塞,迅速用灭菌的接种环刮取少许菌苔,以划蛇形线方式转接至新培养基内。
4.接种完毕,塞紧试管塞。
灼烧接种环后放回原处。
将试管做好标记,37℃培养过夜。
此法适合菌种传代或保藏菌种。
图2—1固体斜面接种法
(二)肉汤增菌培养法(图2—2)
1.2.同上。
3.于酒精灯火焰上方无菌区域内,用小指
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