NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用.docx
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NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用.docx
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NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
【摘要】目的研究同种异体NK细胞对人鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。
方法PCRSSP法检测CNE2细胞HLAA、B、Cw表型、NK细胞KIR表型,磁珠分离法分离NK细胞并进行体外培养扩增,LDH释放法测定NK细胞对CNE2细胞的体外杀伤活性。
12只BALB/c裸鼠分为两组,每组6只,对照组裸鼠每只皮下接种1×106CNE2细胞,治疗组裸鼠每只皮下接种1×106CNE2细胞,同时每只经尾静脉注入3×107NK细胞,观察两组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积变化、计算抑瘤率。
结果CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2,24;B18,35;Cw4,7,3例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。
效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(±)%、(±)%、(±)%and(±)%。
对照组和NK细胞治疗组肿瘤出现时间分别为(±)d、(±)d,(P),成瘤率分别为100%、%,对照组和NK细胞治疗组裸鼠的瘤重分别为(±)g、(±)g,(P),NK治疗组的抑瘤率为%。
肿瘤组织石蜡切片病理学鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌,NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞,较多的淋巴细胞浸润和大量细胞坏死区。
结论NK细胞对鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤有明显的抑制作用,有希望成为治疗鼻咽癌的新方法。
【关键词】鼻咽癌;自然杀伤细胞;裸鼠;移植瘤;杀伤细胞免疫球蛋白样受体;细胞治疗
鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤,早期患者采用放射治疗常能取得较好的治疗效果,晚期患者放射治疗联合化学治疗虽能提高局部控制率,但未能提高总体生存率[1]。
异基因骨髓移植中供受者之间杀伤细胞免疫球蛋白样受体配体错配(KIR配体错配)引发的同种异体反应性NK细胞活性可以防止白血病细胞复发,使NK细胞的抗肿瘤治疗作用日益得到医学研究者的重视。
此前我们的体外实验表明同种异体NK细胞对CNE2细胞具有较强的杀伤活性。
本研究以同种异体NK细胞为效应细胞,观察其对人鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响,为鼻咽癌的治疗探索一种新的方法。
1材料和方法
材料
分离NK细胞用的缓冲液(磷酸盐缓冲液,,加入%BSA,2mmol/lEDTA,MiltenyiBiotec公司产品),CD56MicroBeads(MiltenyiBiotec公司产品),RPMI1640(Gibco公司产品),淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品),rhIL2、PHA(Sigma公司产品),人鼻咽癌细胞株CNE2购于军事医学科学院。
方法
NK细胞的分离纯化采用常规密度梯度离心法分离3例健康人外周血单个核细胞,PBS洗涤2次,计数细胞,CD56MicroBeads作MACS细胞阳性分选,获得CD3-CD56+细胞即为NK细胞。
细胞培养细胞培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640。
培养NK细胞时加入1000U/mlrhIL2,PHA10μg/ml。
CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型采用PCRSSP法,按PCRSSPA、B、Cw特异性引物试剂盒说明操作。
KIR基因分型采用PCRSSP法,按KIR基因分型试剂盒说明操作。
动物实验
裸鼠选取体重15~20g的4~6周BALB/c裸鼠12只,分2组,每组6只,雌雄各半,在第一军医大学SPF动物实验中心饲养。
裸鼠接种对数生长期的CNE2细胞经胰酶消化、离心收集、计数后重悬于无血清RPMI1640培养基中,配制成每含1×106个肿瘤细胞的悬液,用1ml注射器将细胞悬液注射于BALB/c裸鼠背部皮下,NK细胞治疗组,NK细胞悬于无血清RPMI1640培养基中计数,配制成每含3×107个细胞的悬液,用1ml注射器将细胞悬液经尾静脉注射于BALB/c裸鼠体内(每例健康者的NK细胞分别注射2只BALB/c裸鼠),尾静脉注射NK细胞与皮下注射CNE2细胞同一天进行。
肿瘤生长情况监测及肿瘤的病理变化观察自细胞注射之日起,观察两组裸鼠成瘤时间、成瘤率,待肿瘤出现后用游标卡尺测量肿瘤块2个方向的直径,分别记为a、b,肿瘤体积计算公式:
V=1/2ab2。
肿瘤出现后3周处死裸鼠,测肿瘤重量,计算肿瘤生长抑制率:
肿瘤生长抑制率=(1-处理组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%。
肿瘤标本称重后,常规福尔马林固定,石蜡包埋,5μm连续切片,分别行HE染色,观察病理变化。
统计学方法
应用软件进行数据处理,数据以±s表示,采用独立样本t检验。
2结果
NK细胞的纯度流式细胞仪检测CD3-CD16+CD56+细胞的纯度为(±)%。
CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型结果CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2,24;B18,35;Cw4,7。
KIR基因分型3例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。
NK细胞对CNE2细胞的体外杀伤活性效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分虽为%。
肿瘤的生长情况单纯接种CNE2细胞组和CNE2+NK细胞治疗组,肿瘤出现时间分别为(±)d、(±)d,(P),NK细胞治疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长。
NK细胞抑制CNE2移植瘤的生长实验结果表明NK细胞能有效抑制肿瘤细胞生长,生长曲线显示NK细胞能明显减缓CNE2细胞BALB/c裸鼠体内移植肿瘤的生长速度,见图1。
图1NK细胞对CNE2移植肿瘤生长的影响
各组裸鼠瘤重、抑瘤率CNE2细胞组和CNE2+NK治疗组裸鼠的肿瘤重量分别为(±)g、(±)g,(P)。
NK细胞治疗组肿瘤抑制率为%。
肿瘤组织病理改变成瘤组织经HE病理切片鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌,细胞呈多边形,细胞核卵圆形或不规则形,核仁较明显,核分离相多见。
NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞,较多的炎性细胞浸润和大量细胞坏死区,见图2。
3讨论
NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群,在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。
NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR)与靶细胞表面特定的HLAI类分子结合抑制NK细胞的活性,靶细胞缺乏iKIR特定的配体(KIR配体错配)将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性。
不同的iKIR分子识别并结合不同的HLAI类分子。
KIR2DL1识别HLACw2、Cw4、Cw5、Cw6;KIR2DL2/2DL3识别HLACw1、Cw3、Cw7、Cw8;KIR3DL1识别HLABw4;KIR3DL2识别HLAA3,A11;其余的KIR配体尚未明确。
KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体。
本研究表明CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2,24、B18,35、Cw4,7,不表达Bw4、A3、A11分子,因此3例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR配体错配现象。
KIR3DL2为NK细胞的框架基因,任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2,因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR配体错配现象。
NKG2D是介导NK细胞杀伤活性的主要活化性受体,表达在所有NK细胞上,靶细胞表面的MICA/MICB分子是NKG2D的主要活化性配体,MICA/MICB与受体NKG2D结合后可以激活NK细胞对表达MICA/MICB分子的肿瘤细胞的杀伤。
我们的研究表明,CNE2细胞表面表达NK细胞活化性受体NK2D的配体MICA/MICB等,结合KIR检测结果表明,任意个体的NK细胞均存在杀伤CNE2细胞的分子基础,体外杀伤实验显示NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比30∶1时为(±)%。
本研究中动物实验表明,NK细胞治疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长,治疗组肿瘤体积较对照组明显减小,NK细胞治疗组肿瘤抑制率为%,成瘤组织病理学证实两组均为低分化鳞状上皮细胞癌,NK细胞治疗组较对照组可见角化肿瘤细胞,有明显的淋巴细胞浸润和肿瘤坏死区,表明NK细胞能有效抑制CNE2移植瘤的生长。
本研究提示NK细胞能有效抑制CNE2裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌的治疗提供了另一种方法,但尚需大规模的体内实验,为临床应用提供充分的依据。
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