甜瓜主要病原菌的鉴定与抗病基因的分子定位.docx

甜瓜主要病原菌的鉴定与抗病基因的分子定位.docx

《甜瓜主要病原菌的鉴定与抗病基因的分子定位.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《甜瓜主要病原菌的鉴定与抗病基因的分子定位.docx（73页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

甜瓜主要病原菌的鉴定与抗病基因的分子定位

分类号：

S单位代码：

10749

密级：

学号：

02040326

宁　夏　大　学

硕士学位论文

题目

english

研究生：

哈矿武

指导教师：

刘萍教授

申请学位门类级别：

农学硕士

专业名称：

作物育种

研究方向：

蔬菜育种新技术

所在学院：

农学院

二零零八年四月

NingxiaUniversity

ThesisforApplicationofMasterDegree

StudyonDrought-toleranceatStageofGerminationandSeedlingof14VarietiesofTallFescueunderPEG-6000Stress

Graduatestudent：

WangBin

Director：

Prof.XieYingzhong

Specialty：

GrasslandEcology，ResourcesandEnvironment

Major：

PratacultureScience

FinishDate：

April2008

独创性声明

本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：

时间：

年月日

关于论文使用授权的说明

本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：

学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）

研究生签名：

时间：

年月日

导师签名：

时间：

年月日

甜瓜主要病原菌的鉴定与抗病基因的分子定位

摘要

甜瓜（CucumismeloL.）是深受世界各地人民喜爱的一种高档瓜果之一。

在整个生育时期中遭到多种病虫害的侵袭。

随着经济的发展和人民生活的提高，近年来，甜瓜栽培面积，尤其是保护地栽培取得了长足的发展，然而，在甜瓜生产蓬勃发展的势头中，还存在许多问题。

连作重茬是影响甜瓜生产可持续发展的重要问题之一。

由于连作重茬造成土传病害加剧，影响了果品产量与品质的提高。

筛选抗源、培育和推广抗病品种是防治甜瓜病害最经济有效的措施。

本文针对甜瓜主要病害（蔓枯病、枯萎病和白粉病），展开病原与抗源鉴定、抗源抗性遗传分析以及抗病基因的分子定位研究，取得结果如下：

1.按照柯赫氏法则，成功分离、纯化和鉴定了甜瓜蔓枯病、枯萎病病原，鉴定结果表明甜瓜蔓枯病（Didymellabryoniae（Auersw.）Rehm）属半知菌亚门，球壳孢目，壳二孢属；甜瓜枯萎病病原菌为尖袍镰刀菌（Fusariumoxysporum.f.sp.melonis）。

经致病性测定及再分离研究，病原菌的形态特征与前人的研究结果一致。

2.在PSA培养基上蔓枯病菌丝体生长茂盛，难以产生分生孢子，即使在易产孢的燕麦或玉米培养基上，产生的分生孢子也极少。

为了高效诱导分生孢子，采用逆境胁迫的方法，结果表明在PSA平板上生长茂盛的蔓枯病菌丝体紫外照射2和4min效果较好，15d后各处理均产生较多的分生孢子器；热激处理效果更好，35℃各处理均产生大量的分生孢子器，但处理1d和2d的相对较好；40℃各处理均产生分生孢子器，但处理2d、3d和4d的相对较好；45℃各处理均产生大量的分生孢子器，处理1d、2d、3d的相对较好。

说明适宜的热激条件可有效诱导分生孢子器的产生。

将分生孢子器接种在燕麦培养基上短期内能快速扩繁分生孢子器。

甜瓜枯萎病病菌的分生孢子采用PD培养液振荡诱导。

3．建立了甜瓜干种子基因组DNA提取方法，结果表明提取的DNA中RNA消化彻底，稀释100倍DNA浓度达30ng/ul左右，直接用于Fom2——SCAR标记反应体系的PCR扩增。

4.利用叶片离体接种和Fom2——SCAR标记鉴定技术，从92份中国香瓜种质资源中发掘了63份抗源；采用上胚轴针刺接种方法从100份中国香瓜种质资源中筛选出了11份蔓枯病抗源，其中包括2份高抗抗源。

5．以杂交组合4G21/3A832的F3家系及其双亲、F1、BCs和BCr为材料，利用叶片离体接种鉴定技术，分析了抗源4G21的抗性遗传规律，结果表明：

F1抗性水平低于抗病亲本,表明抗病基因在F1表现为部分显性。

BCs抗感分离比为1∶1，F3家系抗感分离比为3∶1,经χ2测验均达到了显著水平。

表明F2群体蔓枯病抗性由一对部分显性单基因控制。

将该基因命名为Sb-x,利用本试实验室构建的甜瓜基因组分子图谱，直接将Sb-x定位于LG1连锁群上，Sb-x与标记位点me45em42-4、me45em2-3、me45em2-42和me3em42-4、me3em42-3紧密连锁，其遗传距离分别为2cM和3cM。

6.以抗感交组合C12/3B13的6个世代（双亲、F1、F2、F3、BCs和BCr）为材料，利用叶片离体接种抗性鉴定技术，分析了甜瓜白粉病抗源3B13的抗性遗传规律，结果表明：

F1抗性水平接近于抗病亲本，表现为抗病，表明抗病基因在F1表现为部分显性；BCs抗感分离比为1：

1，F2抗感分离比为3：

1，2测验均达到了显著水平,表明抗源3B13对白粉病菌的抗性由1对部分显性基因控制。

利用本研究室构建的分子图谱，借助SSR标记，进行图谱整合，结果将甜瓜白粉病抗源3B13携带的抗病基因Pm-x位点定位于LG3连锁群。

Pm-x位点与标记位点me45em1-4和TJ29连锁，其遗传距离分别为4cM和24cM。

关键词：

甜瓜，病原菌，抗性遗传分析，Sb-x，Pm-x，Fom2，分子定位

Abstract

Fourteenvarietiesoftallfescue（FestucaarundinaceaSchreb.）weretreatedwithPEG-6000solutionatconcentrationsof0（CK）,-0.3MPa,-0.6MPa,-0.9MPaand-1.2MPainordertoassesstheeffectsofdroughtonrelativegerminationrate,germinationindex,droughttoleranceindex,andchlorophyllconcentration,MDAconcentration,freeprolineconcentrationaswellasanti-oxidantenzymeatthegerminationstageandseedlingstage.Differenttolerancetodroughtandcorrelationbetweentheseparameterswereanalyzedinthisexperiment.Furthermore,themethodofprinciplecomponentanalysiswasusedtoevaluatethedifferenttoleranceoftheexperimentedvarietiestodrought.Resultswereasfollows:

（1）Waterpotentialsuitablefortallfescueseedgerminationismorethan-0.4MPa.At-0.76MPa,halfseedlingsgerminateddied.Whileat–1.33MPa,alltheseedlingsgerminateddonotsurvive.

（2）Relativegerminationpotential,simplevigorindex,germinationindex,andgerminationvigorindexallchangedwithwaterpotential;atthesametime,atransitionpointof-0.6MPawasobserved,whichisalsothetransitionpointtoassessthesignificantdifferencesamongthevarietiestestedbasedonANOVA.Thusweconcludedthat-0.6MPawastheturningpointforseedgerminationoftallfescue.

（3）Basedoncompoundanalysisofsixparametersintheseedlingstage,wefoundtheperiodthatseedlingscouldtoleraterangedfrom14daysto12days,whilethedroughtstressrangedfrom-0.6MPato-0.9MPa.

（4）Nopatternswerefoundintheparametersmeasuredamongthe14varietiesregardingdifferentdroughtstressesanddifferentstresstimes.Itmightbeattributedtothedifferentadaptationsofthesevarietiestostresses.Everyvarietyhasitsownspecialtolerancetostress.

（5）Incorrelatingthesixparametersmeasuredintheseedlingstage,astrongrelationshipwasfoundbetweenthem.Thus,tallfescuewasbetteradaptedtodrought.

（6）Thedifferencesofdroughtresistancefortallfescuevarietiesweremoreobviousbetweengerminationstageandseedlingstage.14varietiesoftallfescueweresequencedbymembershipfunctionbasedonthedroughtresistanceparametersofgerminationstageandseedlingstage,resultswereTrapleA＞AridⅢ＞Jaguar2＞FirePhoenix＞Justice＞Fawn＞CrossfireⅡ＞Southeast＞Plantation＞Infero＞FirePhoenixRT＞Pixie＞Finelawn＞Poppoint.

Keywords:

TallFescue，PEG-6000，DroughtTolerance，GerminationStage，SeedlingStage

目录

第一章绪论4

1.1植物抗旱性研究进展错误！

未定义书签。

1.1.1植物的形态解剖结构与抗旱性错误！

未定义书签。

1.1.2植物的生理生化特性与抗旱性错误！

未定义书签。

1.2草坪草对干旱胁迫适应性的研究进展错误！

未定义书签。

1.2.1草坪草的避旱性错误！

未定义书签。

1.2.2草坪草的耐旱性错误！

未定义书签。

1.2.3草坪草的抗旱性比较方法研究错误！

未定义书签。

1.3高羊茅抗旱性及其他抗性生理研究进展错误！

未定义书签。

1.3.1高羊茅抗旱性研究错误！

未定义书签。

1.3.2高羊茅抗热抗寒性研究错误！

未定义书签。

1.3.3高羊茅抗盐碱性研究错误！

未定义书签。

1.3.4高羊茅抗重金属胁迫研究错误！

未定义书签。

1.3.5其他物质对高羊茅抗性影响的研究错误！

未定义书签。

1.4研究目的及意义错误！

未定义书签。

第二章试验材料与方法错误！

未定义书签。

2.1试验材料错误！

未定义书签。

2.2试验方法错误！

未定义书签。

2.2.1试验时间和地点错误！

未定义书签。

2.2.2试验设计错误！

未定义书签。

2.3测定方法错误！

未定义书签。

2.3.1萌发期指标测定错误！

未定义书签。

2.3.2幼苗期指标测定错误！

未定义书签。

2.4数据分析错误！

未定义书签。

第三章结果与分析错误！

未定义书签。

3.1干旱胁迫对不同品种高羊茅萌发期的影响错误！

未定义书签。

3.1.1干旱胁迫与种子相对发芽率错误！

未定义书签。

3.1.2干旱胁迫与种子相对发芽势错误！

未定义书签。

3.1.3干旱胁迫与胚根胚芽比错误！

未定义书签。

3.1.4干旱胁迫与简化活力指数（G.S.）错误！

未定义书签。

3.1.5干旱胁迫与萌发指数（GI）错误！

未定义书签。

引言

甜瓜（CucumismelonL）几乎在世界各国都有种植，是营养丰富、品味独特的食用佳品目前广泛种植的品味优良的甜瓜品种几乎都易感病，而抗病品种多数产量低、品味较差。

尽管育种工作者利用已知的抗病种质，通过杂交育种培育了许多优良的甜瓜抗病新品种，但抗病育种周期长，相对病害的发展往往滞后。

迄今为止，甜瓜病虫害的防治仍然依靠化学方法，这不仅给生态环境造成了很大的污染，同时还加速了病原物的变异，出现耐药或抗药性的病原菌。

传统育种培育F1杂种品种，选育优良自交系需要多代自交、回交，不仅周期长、费工、费时，而且效率很低。

传统抗病育种通过对表现型的选择而实现对基因型的选择，每次对后代的抗性选择都需要营造发病环境，因此育种程序繁杂，工作量大，耗费时间长。

应用分子标记和生物技术手段，进行甜瓜抗病基因分子标记辅助育种来解决甜瓜病虫害问题己成为抗病育种的新途径，越来越多的被接受。

既能借助与抗病基因紧密连锁的分子标记，在实验室直接对基因型选择，又能加快品种改良的速度。

因此，能够克服常规育种的缺陷。

尤其20世纪90年代以来，现代分子标记和生物技术的快速发展，使许多抗病基因或与抗病基因紧密连锁的分子标记定位于甜瓜分子图谱上，甜瓜抗病基因的分离和利用己经受到了广泛的关注。

而鉴定优良抗病基因是实现分子抗病的前提。

本研究对北京地区甜瓜主要病害病原菌进行了采集、分离和培养，并对其进行了鉴定。

利用分子标记辅助发掘中国香瓜抗枯萎病种质资源所含Fom-2基因，利用离体接种鉴定技术，分析了甜瓜蔓枯病和白粉病的抗性遗传机制，结合本研究室开展的甜瓜分子图谱构建研究，将抗源4G21携带的抗蔓枯病基因直接地定位于分子图谱上；利用SSR标记，通过基因组比较作图研究，将抗源3B13携带的抗白粉病基因间接地定位于甜瓜分子图谱上。

为目标基因的克隆与分子标记辅助育种奠定了基础。

第一部分文献综述

1甜瓜主要病害的研究进展

1.1蔓枯病

蔓枯病（Didymellabryoniae（Auersw.）Rehm）是世界性的甜瓜重要土传病害之一。

1.1.1分生孢子的高效诱导

蔓枯病菌在常用培养基上培养，不易获得子实体，为抗病性鉴定带来一定困难。

近年来，国内外不少专家对此做了大量的研究，但由于地域性、季节性、菌株差异和培养条件的不同有时仍不能达到令人满意的产抱效果。

戴富明，陆金萍（2003）报道甜瓜蔓枯病病原菌在PDA培养基上培养不能形成分生孢子器，在KC1、甜瓜（或黄瓜）茎叶煎汁、琼脂和玉米粉琼脂培养基上能形成分生孢子器。

王晓东，李国英（2004）报道菌株在打瓜、黄瓜果实上接种，自然光条件下，一周后均能产生大量的分生孢子器，在葫芦瓜上接种大部分菌株均能产生分生孢子器。

其中各菌株在黄瓜上产生的能力最强，数量最多，其次为打瓜和葫芦瓜。

在黄瓜和葫芦瓜上所产生的分生孢子器多为淡黄色或黄褐色，分生孢子器壁较薄。

而在黑暗条件下，大部分不能产生分生孢子器。

在国外有关逆境胁迫下诱导瓜类蔓枯病菌产生分生孢子的报道很多，美国学者进行接种体制备时通常在12h荧光/12h黑暗条件下培养10-14天后获得大量分生抱子（St.Amand，1995；Wehner，2000），戴富明等发现在26~28℃,12h光照/12h黑暗的条件下，培养三周左右，能形成大量黄褐色的小点即分生孢子器，但后续相关研究未见报道。

1.1.2抗性接种鉴定

国内对甜瓜蔓枯病抗性鉴定方法报道较多，但无一种十分标准的方法。

陈秀蓉，魏永良（1990）等详细报道了用各种形态的病菌以及不同的接种方法接种的研究，孢子喷雾、孢子涂抹、孢子灌根、针刺四种方法可引起发病。

针刺法发病率最高，潜育期10天，其次为喷雾及溶抹法。

灌根最低，潜育期12天。

比较四种方法，针刺虽发病率高，但显不出抗性的差异，且费工费时。

灌根法发病率偏低，潜育期偏长。

喷雾与涂抹比较简便，但喷雾均匀，发病率亦高，认为孢子喷雾和涂抹法较好。

有关甜瓜蔓枯病离体接种鉴定方法未见报道。

1.1.3甜瓜种质资源蔓枯病抗性鉴定和遗传分析

长期以来，国外发达国家十分重视甜瓜蔓枯病病原与抗源的鉴定、病原菌的致病性变异与甜瓜抗病育种工作。

先后从甜瓜、西瓜、南瓜、西葫芦和黄瓜等葫芦科植物上分离出许多菌系，已经证实病菌群体内不同菌系的基因型存在质的差异、致病性存在量的差异，但没有发现蔓枯病菌对不同葫芦科植物存在“种”的专化性，即使在其中任何一种葫芦科植物如甜瓜或西瓜上也没有发现存在“小种”分化。

在抗源鉴定方面，最早报道了1份抗源PI140471（Sowell，1966）。

Norton等（1971，1972，1985）利用该抗源在美国又育成了3个抗病品种。

随后又报道了2份抗源PI266935和PI436533（Sowell，1981），其抗性水平与PI140471相似。

McGrath等（1993）报道了1个高抗抗源PI266934，其抗性水平远高于PI266935，且不受植株发育时期和接种浓度的影响。

Zhang等（1997）在温室和田间对798份甜瓜品种资源和24个甜瓜近缘种进行了系统的接种鉴定，结果鉴定了一批温室与田间抗性表现一致的抗源：

其中，有中国的PIs157076，157080，157081，157082，157084；有津巴布韦（Zimbabwe）的PIs482393，482398，482402，482403，482408；有朝鲜的PI255478；有墨西哥的PI511890，这批抗源的抗性水平至少与PI140471相似。

Takada等（1980）评价了世界不同地区的甜瓜品种资源对蔓枯病的抗性水平，发现东方甜瓜，即香瓜（C.melovar.makuwa）和东方刺甜瓜，即菜瓜（C.melovar.conomon）的抗性水平较高。

有关抗源的抗性遗传规律研究报道不多。

PrasadandNorton（1967）报道PI140471携带显性单基因Mc。

Wako报道C.melovar.makuwa，var.conomon和var.agrestis的抗源的抗性由1对不完全显性基因控制。

在我国，甘肃农林科学院和新疆农业大学曾分离出甜瓜蔓枯病病原，但后续研究报道很少，对甜瓜蔓枯病病原的致病性变异与抗病性鉴定及抗性遗传分析未见报道。

本试验按照柯赫氏法则，成功分离、纯化和鉴定了甜瓜蔓枯病病原，研究了该病原菌分生孢子高效诱导与扩繁技术，并利用上胚轴针刺接种方法，从100份中国香瓜地方品种资源中筛选了11份抗源，其中包括2份高抗抗源。

1.2抗枯萎

枯萎病又称萎蔫病或蔓割病，是香瓜的一种重要土传病害之一。

1894年Smith在美国南卡罗来纳州发现，目前已广泛分布于世界各产瓜区。

1978、1993年我国新疆一些地区哈密瓜田因枯萎病危害而绝收。

甜瓜枯萎病（Fusariumwilt）由尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusariumoxysporummelonis（LeachetCurrence）SnydaretHans2en）（RisserAnnAméliorPlantes,1973）所致。

近年来，随着甜瓜栽培面积的不断扩大，我国许多省市甜瓜枯萎病发生严重，且危害程度逐年加重，尤其在以瓜果著名的新疆爆发非常频繁。

孙玉宏，张国桥，杜念华等（2000）认为该病是典型的土传性、维管束寄生的系统病害，从苗期到成株期均可发病，结瓜中期为发病高峰，常引起瓜秧枯萎死亡，对甜瓜的品质、产量影响很大。

研究病原菌生理小种的变化动态，广泛搜集品种资源，鉴定抗源基因，展开种质创新与种质创新技术研究，进一步提高育成品种或嫁接砧木的抗性水平和抗性的持久性，是预防薄皮甜瓜土传病虫害的一条经济、有效、安全的途径。

研究病原菌与寄主植物的互作关系有助于开展甜瓜抗病育种工作。

Risser等（1976）以甜瓜品种CharentaisT、Doublon和CM17-187为鉴别品种，研究了甜瓜鉴别品种间的抗性差异与病原菌的致病力的差异，并根据抗病基因与病原菌间的互作关系，将甜瓜枯萎病病原菌划分为4个生理小种，即小种0、1、2和1.2。

CharentaisT不携带任何抗病基因，而对4个小种均感病；Doublon携带一对显性抗病基因Fom-1，而高抗小种0、2；CM17-187携带一对显性抗病基因Fom-2，而高抗小种0、1。

3个鉴别品种对小种1.2均感病，并根据病症的差异，又将小种1.2分为1.2w（病症表现为萎蔫）和1.2y（病症表现为枯黄）。

目前，尚未发现高抗Race1.2的抗源（Zink,1991）。

Zink（1985）研究结果表明品种PerlitaFR也抗小种0、2，但其携带的一对与Fom-1非等位的显性抗病基因，并将该基因命名为Fom-3。

抗病基因资源的挖掘是抗病育种的基础。

由于甜瓜枯萎病没有建立标准化的寄主——生理小种鉴别系统，使鉴定抗源基因与生理小种间的关系存在困难。

Armstrong（1978）利用来自不同国家的7个枯萎病生理小种分离系（法国，4个；美国-加拿大、以色列和日本各1个）抗性鉴定证实：

AnanasYorkneam抗法国小种1、2、4和美-加、日本小种，但感法国小种3和以色列小种；Doublon抗法国小种1和美-加、以色列、日本小种，但感法国小种2、3、4；Earl’sFavorite抗美-加小种，中抗以色列小种，但感法国小种1、2、3、4和日本小种；Ogon抗法国小种1、2、4，美-加和以色列小种，但感法国小种3和日本小种；Smith’sperfect抗法国小种1、美-加和日本小种，但感法国小种2、3、4和以色列小种。

研究甜瓜枯萎病“生理小种”的地理分布和流行特征，有助于选择适宜的小种进行抗源鉴定、抗病基因转移和制定抗病基因部署策略。

在美国，Risser等（1976）鉴定的4个生理小种均存在：

1974年